लघु सूअरों से प्राथमिक पॉर्सिन महाधमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं (PAECs) के अलगाव के लिए एक प्रभावी एंजाइमी विधि का वर्णन किया गया है। अलग प्राथमिक PAECs exeotransplantation में प्रतिरक्षा और जमावट प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Xenotransplantation अंत चरण अंग विफलता के साथ रोगियों के लिए मानव अंगों की कमी को हल करने के लिए एक शानदार तरीका है, और सुअर एक उपयुक्त अंग स्रोत के रूप में माना जाता है। प्रतिरक्षा अस्वीकृति और स्कंदन xenotransplantation की सफलता के लिए दो प्रमुख बाधाएं हैं. स्वास्कुलर एंडोथेलियल सेल (ईसी) चोट और रोग xenotransplantation में सूजन और स्कंदन प्रतिक्रियाओं के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रकार, प्रतिरक्षा अस्वीकृति और स्कंदन प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए पॉर्सिन महाधमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं (PAECs) का अलगाव आवश्यक है। यहाँ, हम अलगाव, विशेषता, और लघु सूअरों से अत्यधिक शुद्ध pAECs के विस्तार के लिए एक सरल एंजाइमी दृष्टिकोण विकसित किया है. सबसे पहले, लघु सुअर ketamine के साथ anaesthetized था, और aorta की लंबाई excised किया गया था. दूसरा, ओर्टा के एंडोथेलियल सतह को 15 मिनट के लिए 0.005% कोलैजेनस IV पाचन समाधान के संपर्क में किया गया था। तीसरा, ऑर्टा की एंडोथेलियल सतह को केवल एक ही दिशा में एक सेल खुरचनी के साथ स्क्रैप किया गया था ([lt;10 बार), और की प्रक्रिया के दौरान संकुचित नहीं किया गया था Scraping. अंत में, 3 दिन के अलग pAECs, और मार्ग 1 और मार्ग 2 के बाद, एक विरोधी CD31 एंटीबॉडी के साथ प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पहचान की गई. CD31-सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत 97.4% था – 1.2%, 94.4% – 1.1%, और 92.4% – 1.7% (मतलब ] एसडी), क्रमशः. Collagenase चतुर्थ की एकाग्रता, पाचन समय, दिशा, और आवृत्ति और स्क्रैपिंग की तीव्रता फाइब्रोब्लास्ट संदूषण को कम करने और उच्च शुद्धता और ईसी की एक बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। अंत में, हमारे एंजाइमी विधि लघु सुअर ओरोटा से ईसी को अलग करने के लिए एक उच्च-प्रभावी विधि है, और कोशिकाओं को विदेशी प्रत्यारोपण में प्रतिरक्षा और जमावट प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए इन विट्रो में विस्तारित किया जा सकता है।
प्रत्यारोपण के लिए उपलब्ध अंगों की कमी एक उत्कृष्ट समस्या दुनिया भर में1है. चीन के रेड क्रॉस सोसायटी के अनुसार, केवल अंत चरण अंग विफलता के साथ रोगियों की एक छोटी संख्या में चीन में एक उपयुक्त अंग प्राप्त 2018.
अंग की कमी की समस्या को हल करने के लिए Xenotransplantation एक आशाजनक तरीका है। पिग अंगों को शारीरिक और शारीरिकसमानता2,3के कारण मनुष्यों के लिए सबसे उपयुक्त अंग माना जाता है . एक सुअर xenograft की विफलता काफी हद तक प्राइमेट प्रतिरक्षा अस्वीकृति और जमावट प्रतिक्रियाओं से संबंधित है। Porcin endothelial कोशिकाओं (ईसी) महत्वपूर्ण हैं क्योंकि इन कोशिकाओं को प्राइमेट प्रतिरक्षा प्रणाली है, जो एंटीबॉडी, पूरक, साइटोकिन्स, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं (उदा., टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, और मैक्रोफेज)4,5शामिल हैं के साथ बातचीत करने के लिए पहली बार कर रहे हैं। पोरसिन ईसी सुअर के अंग और इलेट जेनोट्रांसप्लांटेशन6,7में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं . इस प्रकार, ईसी एक सुअर कलम करने के लिए अस्वीकृति और स्कंदन प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए महत्वपूर्ण कोशिकाओं रहे हैं. उच्च गुणवत्ता वाले पॉर्सिन ईसी के अलगाव के लिए विदेशी प्रत्यारोपण अनुसंधान के लिए आवश्यक है।
विभिन्न अंगों (जैसे, दिल, गुर्दे, जिगर और माओरा) से ईसी को अलग करने के प्रयास में, कई प्रोटोकॉल एक xenotransplant सेटिंग8,9,10,11,12में सूचित किया गया है. हालांकि, अलग ईसी के एक ultrapure संस्कृति रखते हुए मानक प्रोटोकॉल में एक उत्कृष्ट समस्या है. पचे हुए घोल की बढ़ी हुई सांद्रता , अनुपयुक्त पाचन समय और परिमार्जन की तीव्रता वर्तमान अध्ययन8,10,13में फाइब्रोब्लास्ट संदूषण में वृद्धि में योगदान दे सकती है . इसके अलावा, लघु सूअरों से अलग PAECs की विधि कम अध्ययन किया जाता है. यहाँ, हम लघु सूअरों (Wuzhishan या Bama) से उच्च शुद्ध PAECs को अलग करने के लिए एक अनुकूलित एंजाइमी विधि का वर्णन. प्रोटोकॉल में कई कदम फाइब्रोब्लास्ट संदूषण को कम करने और उच्च शुद्धता ईसीएस प्राप्त करने के लिए डिजाइन किया गया है।
एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग आमतौर पर संवहनी रोग, मधुमेह , ऊतक पुनर्जनन, प्रत्यारोपण और कैंसर14,15,16,17,18के अनुसंधान में किया जाता है . इन रोगों म…
The authors have nothing to disclose.
काम गुआंग्डोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, अनुदान / गुआंग्डोंग प्रांत के चिकित्सा वैज्ञानिक अनुसंधान फाउंडेशन, अनुदान / पुरस्कार संख्या: B2018003; शेन्ज़ेन विज्ञान और प्रौद्योगिकी के फाउंडेशन, अनुदान / पुरस्कार संख्या: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJH$2017031417135556, JCYJ2016042510300011 और JCYJ20160042814404 शेन्ज़ेन Longhua जिला विज्ञान और प्रौद्योगिकी के फाउंडेशन, अनुदान / चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम, अनुदान/पुरस्कार संख्या: 2017YFC1103704; शेन्ज़ेन में चिकित्सा की सनमिंग परियोजना, अनुदान/पुरस्कार संख्या: एसजेडएसएम201412020; गुआंग्डोंग प्रांत (2019) में उच्च स्तरीय अस्पतालों के निर्माण के लिए विशेष निधि; शेन्ज़ेन के उच्च स्तरीय चिकित्सा अनुशासन निर्माण के लिए निधि, अनुदान/पुरस्कार संख्या: 2016031638; शेन्ज़ेन फाउंडेशन ऑफ हेल्थ एंड फैमिली प्लानिंग कमीशन, ग्रांट/अवार्ड नंबर: एसजेडएक्सजे2017021 और एसजेडएक्सजे2018059। हम पांडुलिपि की तैयारी में सहायता करने के लिए शेन्ज़ेन विश्वविद्यालय से Hanchheng झांग और झिचेंग ज़ू धन्यवाद.
BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
Cell scraper | Corning | 3010# | |
Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride:0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride:1mg/2ml | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
ECM | Sciencell | 1001# | |
ECGS | Sciencell | 1052# | |
Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
Flowjo v10.0 | |||
Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap (T25) | Corning | 3289# | |
Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
Syringe(5mL) | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |