Isolamento e cultura delle cellule endoteliali aortiche primarie dai suini in miniatura
Summary
Viene descritto un metodo enzimatico efficace per l’isolamento delle cellule endoteliali sui porcili primari (pAEC) dai suini in miniatura. I pAEC primari isolati possono essere utilizzati per studiare la risposta immunitaria e di coagulazione nello xenotrapianto.
Abstract
Lo xenotrapianto è un modo promettente per risolvere la carenza di organi umani per i pazienti con insufficienza d’organo allo stadio finale, e il maiale è considerato una fonte di organo adatta. Il rigetto immunitario e la coagulazione sono due ostacoli principali per il successo dello xenotrapianto. Le lesioni e disfunzioni delle cellule endoteliali (EC) sono importanti per lo sviluppo delle risposte di infiammazione e coagulazione nello xenotrapianto. Pertanto, l’isolamento delle cellule endoteliali aortiniche porcine (pAEC) è necessario per studiare il rigetto immunitario e le risposte di coagulazione. Qui, abbiamo sviluppato un semplice approccio enzimatico per l’isolamento, la caratterizzazione e l’espansione di pAEC altamente purificati da maiali in miniatura. In primo luogo, il maiale in miniatura è stato anestetizzato con chetamina, e una lunghezza di aorta è stata assortata. In secondo luogo, la superficie endoteliale dell’aorta è stata esposta allo 0,005% di collagenasi IV digestiva per 15 min. Terzo, la superficie endoteliale dell’aorta è stata raschiata in una sola direzione con un raschietto cellulare (<10 volte), e non è stata compressa durante il processo di Raschiare. Infine, i pAEC isolati del terzo giorno e dopo il passaggio 1 e il passaggio 2 sono stati identificati dalla citometria di flusso con un anticorpo anti-CD31. Le percentuali di cellule CD31-positive erano rispettivamente del 97,4% , 1,2%, 94,4% , 1,1% e 92,4% – 1,7% (media – SD). La concentrazione di Collagenasi IV, il tempo digestivo, la direzione e la frequenza e l'intensità della raschiatura sono fondamentali per ridurre la contaminazione fibroblasta e ottenere un'elevata purezza e un gran numero di EC. In conclusione, il nostro metodo enzimatico è un metodo altamente effctivo per isolare gli EC dall'aorta di maiale in miniatura, e le cellule possono essere espanse in vitro per studiare le risposte immunitarie e di coagulazione nello xenotrapianto.
Introduction
La carenza di organi disponibili per i trapianti è un problema eccezionale in tutto il mondo1. Secondo la Croce Rossa della Cina, solo un piccolo numero di pazienti con insufficienza di organi allo stadio finale ha ricevuto un organo adatto in Cina nel 2018.
Lo xenotrapianto è un modo promettente per risolvere il problema della carenza di organi. Gli organi di maiale sono considerati gli organi più adatti per gli esseri umani a causa delle somiglianze anatomiche e fisiologiche2,3. Il fallimento di un xenotrapianto di suino è in gran parte legato al rigetto immunitario dei primati e alle risposte di coagulazione. Le cellule endoteliali dei porcini (EC) sono fondamentali poiché queste cellule sono le prime a interagire con il sistema immunitario dei primati, che include anticorpi, complementi, citochine e cellule immunitarie (ad esempio, cellule T, cellule B e macrofagi)4,5. Le EC suine svolgono un ruolo vitale nell’organodi maiale e nello xenotrapianto 6,7. Pertanto, le EC sono cellule importanti per studiare le risposte di rigetto e coagulazione a un innesto di suini. L’isolamento delle EC su suini di alta qualità è necessario per la ricerca sugli xenotrapianto.
Nel tentativo di isolare le EC da diversi organi (ad esempio, cuore, rene, fegato e aorta), diversi protocolli sono stati segnalati in un’impostazione xenotrapianto8,9,10,11,12. Tuttavia, mantenere una cultura ultrapura dei EC isolati è un problema eccezionale nei protocolli standard. L’aumento della concentrazione della soluzione digerita, il tempo di digestione inappropriato e l’intensità dei graffi possono contribuire all’aumento della contaminazione del fibroblasto negli studi attuali8,10,13. Inoltre, il metodo dei pAEC isolati dai maiali in miniatura è meno studiato. Qui, descriviamo un metodo enzimatico ottimizzato per isolare i pAEC altamente purificati dai maiali in miniatura (Wuzhishan o Bama). Diversi passaggi del protocollo sono stati progettati per ridurre la contaminazione da fibroblasti e ottenere EC ad alta purezza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le cellule endoteliali sono comunemente utilizzate nella ricerca di disfunzione vascolare, diabete, rigenerazione tissutale, trapianto e cancro14,15,16,17,18. Per comprendere e caratterizzare la biologia e la funzione delle EC in queste malattie, sono stati riportati numerosi metodi per isolare le EC di diversi organi o tessuti malati8<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Natural Science Foundation of Guangdong Province, Grant/Award Number: 2016A030313028; Medical Scientific Research Foundation della provincia del Guangdong, numero di sovvenzione/premio: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Numero di sovvenzione/premio: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJ-201703141713575556, JCYJ20160425103000011 e JCYJ2016042814204444545455 Shenzhen Longhua District Foundation of Science and Technology, Numero di sovvenzione/premio: 2017013; National Key R&D Program of China, Numero Grant/Award: 2017YFC1103704; Sanming Project of Medicine in Shenzhen, Numero di sovvenzione/premio: S201412020; Fondi speciali per la costruzione di ospedali di alto livello nella provincia del Guangdong (2019); Fondo per la costruzione di discipline mediche di alto livello di Shenzhen, numero di sovvenzione/premio: 2016031638; Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission, Grant/Award Number : S’XJ2017021 e S-XJ2018059. Ringraziamo Hancheng ‘hang e ‘hicheng ‘ou dell’Università di Shenzhen per aver assistito nella preparazione del manoscritto.
Materials
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride：0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride：1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap （T25） | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe（5mL） | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
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