En effektiv enzymatisk metode for isolering av primær svin aorta endothelial celler (pAECs) fra miniatyr griser er beskrevet. Den isolerte primære pAECs kan brukes til å undersøke immun-og blødnings responsen i xenotransplantation.
Xenotransplantation er en lovende måte å løse mangelen på menneskelige organer for pasienter med sluttfasen organ svikt, og grisen er betraktet som en passende organ kilde. Immun avvisning og-blødnings er to store hekk for suksessen til xenotransplantation. Vaskulær endothelial celle (EC) skade og dysfunksjon er viktig for utviklingen av betennelse og blødnings responser i xenotransplantation. Således er isolering av svin aorta endothelial celler (pAECs) nødvendig for å undersøke immun avvisning og blødnings responser. Her har vi utviklet en enkel enzymatisk tilnærming for isolering, karakterisering, og utvidelse av svært renset pAECs fra miniatyr griser. Først ble miniatyr grisen anesteserte med Ketamin, og en lengde av aorta var excised. For det andre, den endothelial overflaten av aorta ble eksponert for 0,005% kollagenase IV fordøyelseskanal løsning i 15 min. tredje, den endothelial overflaten av aorta ble skrapet i bare én retning med en celle skraper (< 10 ganger), og ble ikke komprimert under prosessen med Skraping. Til slutt ble den isolerte pAECs av dag 3, og etter passering 1 og passasje 2, identifisert ved flyt flowcytometri med et anti-CD31 antistoff. Prosentene av CD31-positive celler var 97,4% ± 1,2%, 94,4% ± 1,1%, og 92,4% ± 1,7% (gjennomsnittlig ± SD), henholdsvis. Konsentrasjonen av Kollagenase IV, fordøyelses tiden, retningen og hyppigheten og intensiteten av skraping er avgjørende for å redusere Fibroblast forurensning og oppnå høy renhet og et stort antall ECs. Som konklusjon, er vår enzymatisk metode en svært effctive metode for å isolere ECs fra miniatyr gris aorta, og cellene kan utvides in vitro for å undersøke immunforsvaret og blødnings responser i xenotransplantation.
Mangelen på tilgjengelige organer for transplantasjon er et fremragende problem World-Wide1. Ifølge Røde Kors Society of China, fikk bare et lite antall pasienter med slutt-fase orgel svikt et passende organ i Kina i 2018.
Xenotransplantation er en lovende måte å løse problemet med orgel mangel. Gris organer anses å være den mest egnede organer for mennesker på grunn av anatomiske og fysiologiske likheter2,3. Svikt i en gris xenograft er i stor grad knyttet til primater immun avvisning og blødnings responser. Svin endothelial Cells (ECs) er kritiske fordi disse cellene er de første til å samhandle med primater immunsystem, som inkluderer antistoff, komplement, cytokiner, og immunceller (f. eks, T celler, B celler, og makrofager)4,5. Svin ECs spiller en viktig rolle i gris orgel og Holme xenotransplantation6,7. Dermed ECs er viktige celler for å undersøke avvisning og blødnings reaksjoner på en gris pode. Isolering av høy kvalitet svin ECs er nødvendig for xenotransplantation forskning.
I forsøk på å isolere ECs fra forskjellige organer (f.eks. hjerte, nyre, lever og aorta) har flere protokoller blitt rapportert i en xenotransplant innstilling8,9, 10,11,12. Men å holde en ultrarent kultur av isolerte ECs er et fremragende problem i standardprotokoller. Den økte konsentrasjonen av fordøyd løsningen, upassende fordøyelsen tid og skrape intensitet kan bidra til økt Fibroblast forurensning i dagens studier8,10,13. For resten, metoden av isolere pAECs fra miniatyr Pigs er færre studert. Her beskriver vi en optimalisert enzymatisk metode for å isolere svært renset pAECs fra miniatyr griser (Wuzhishan eller Bama). Flere trinn i protokollen er utformet for å redusere Fibroblast forurensning og oppnå ECs med høy renhet.
Endothelial celler er ofte brukt i forskning av vaskulær dysfunksjon, diabetes, vev gjenfødelse, transplantasjon, og kreft14,15,16,17,18. Å forstå og karakterisere biologi og funksjon av ECs i disse sykdommene, mange metoder for å isolere ECS av ulike syke organer eller vev har blitt rapportert8,19</sup…
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet ble støttet av tilskudd fra Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Grant/Award nummer: 2016A030313028; Medisinsk vitenskapelig forskning stiftelsen av Guangdong-provinsen, Grant/Award nummer: B2018003; Shenzhen Foundation for vitenskap og teknologi, Grant/Award nummer: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 og JCYJ20160428142040945; Shenzhen Longhua District Foundation for vitenskap og teknologi, Grant/Award nummer: 2017013; Nasjonal nøkkel R & D program i Kina, Grant/Award nummer: 2017YFC1103704; Sanming prosjekt av medisin i Shenzhen, Grant/Award nummer: SZSM201412020; Spesielle midler for bygging av høyt nivå sykehus i Guangdong-provinsen (2019); Fondet for High Level medisinsk disiplin bygging av Shenzhen, Grant/Award nummer: 2016031638; Shenzhen Foundation av helse og familieplanlegging Commission, Grant/Award nummer: SZXJ2017021 og SZXJ2018059. Vi takker Hancheng Zhang og Zhicheng Zou fra Shenzhen University for å bistå i utarbeidelsen av manuskriptet.
BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
Cell scraper | Corning | 3010# | |
Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride:0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride:1mg/2ml | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
ECM | Sciencell | 1001# | |
ECGS | Sciencell | 1052# | |
Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
Flowjo v10.0 | |||
Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap (T25) | Corning | 3289# | |
Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
Syringe(5mL) | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |