Isolamento e cultura de células endoteliais aórticas primárias de suínos em miniatura
Summary
Um método enzimático eficaz para o isolamento de células endoteliais aórticas primárias porcinas (pAECs) de suínos em miniatura é descrito. Os pAECs preliminares isolados podem ser usados para investigar a resposta imune e da coagulação no xenotransplante.
Abstract
Xenotransplante é uma maneira promissora para resolver a escassez de órgãos humanos para pacientes com insuficiência de órgãos em estágio final, e o porco é considerado como uma fonte de órgão adequada. A rejeição imune e a coagulação são dois obstáculos principais para o sucesso do xenotransplante. A lesão e a disfunção da célula endotelial vascular (EC) são importantes para o desenvolvimento das respostas de inflamação e coagulação no xenotransplante. Assim, o isolamento de células endoteliais aórticas porcinas (pAECs) é necessário para investigar as respostas de rejeição imune e coagulação. Aqui, desenvolvemos uma abordagem enzimática simples para o isolamento, caracterização e expansão de pAECs altamente purificados de suínos em miniatura. Primeiramente, o porco diminuto foi anestesiado com cetamina, e um comprimento da aorta foi extirpado. Em segundo lugar, a superfície endotelial da aorta foi exposta a 0, 5% de solução digestiva de colagenase IV por 15 min. terceiro, a superfície endotelial da aorta foi raspada em apenas uma direção com raspador de células (< 10 vezes), e não foi comprimida durante o processo de Raspagem. Finalmente, os paecs isolados do dia 3, e após a passagem 1 e a passagem 2, foram identificados pelo fluxo citometria com um anticorpo CD31. As porcentagens de células CD31-positivas foram 97,4% ± 1,2%, 94,4% ± 1,1% e 92,4% ± 1,7% (média ± DP), respectivamente. A concentração de Collagenase IV, o tempo digestivo, o sentido, e a freqüência e a intensidade da raspagem são críticas para diminuir a contaminação do fibroblasto e obter a elevado-pureza e um grande número ECs. Em conclusão, nosso método enzimático é um método altamente effctive para isolar ECs da aorta diminuta do porco, e as pilhas podem ser expandidas in vitro para investigar as respostas imunes e da coagulação no xenotransplante.
Introduction
A escassez de órgãos disponíveis para a transplantação é um problema proeminente World-Wide1. De acordo com a Cruz Vermelha da sociedade de China, somente um número pequeno de pacientes com falha de órgão da fase final recebeu um órgão apropriado em China em 2018.
O xenotransplante é uma forma promissora de resolver o problema da escassez de órgãos. Os órgãos do porco são considerados ser os órgãos os mais apropriados para seres humanos por causa das similaridades anatômicas e fisiológico2,3. A falha de um xenograft do porco é relacionada pela maior parte às respostas imunes da rejeição e da coagulação do primata. As células endoteliais porcinas (ECS) são críticas, uma vez que essas células são as primeiras a interagir com o sistema imunológico do primata, que inclui anticorpos, complemento, citocinas e células imunes (por exemplo, células T, células B e macrófagos)4,5. A porcina ECS desempenha um papel vital no órgão de suínos e no Islet xenotransplante6,7. Assim, os ECs são células importantes para investigar as respostas de rejeição e coagulação a um enxerto de porco. A isolação de ECS suínos de alta qualidade é exigida para a pesquisa do xenotransplante.
Em tentativas de isolar ECS de diferentes órgãos (por exemplo, coração, rim, fígado e aorta), vários protocolos têm sido relatados em uma configuração de xenotransplante8,9,10,11,12. Entretanto, manter uma cultura ultrapura de ECs isolado é um problema proeminente em protocolos padrão. O aumento da concentração da solução digerida, o tempo de digestão inadequado e a intensidade de raspagem podem contribuir para o aumento da contaminação do fibroblastos nos estudos atuais8,10,13. Além disso, o método de pAECs isolados de suínos em miniatura é menos estudado. Aqui, nós descrevemos um método enzimático otimizado para isolar pAECs altamente purificados de suínos em miniatura (Wuzhishan ou Bama). Várias etapas do protocolo foram projetadas para reduzir a contaminação de fibroblastos e obter ECs de alta pureza.
Protocol
Representative Results
Discussion
As células endoteliais são comumente utilizadas na pesquisa de disfunção vascular, diabetes, regeneração tecidual, transplante e cânceres14,15,16,17,18. Para compreender e caracterizar a biologia e a função de ECS nestas doenças, os métodos numerosos para isolar o ECS de órgãos ou de tecidos doentes diferentes foram relatados8</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação de ciências naturais da província de Guangdong, concessão/número do prêmio: 2016A030313028; Fundação médica da pesquisa científica da província de Guangdong, concessão/número da concessão: B2018003; Fundação de Shenzhen da ciência e da tecnologia, concessão/número da concessão: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 e JCYJ20160428142040945; Fundação do distrito de Shenzhen Longhua da ciência e da tecnologia, concessão/número da concessão: 2017013; Programa nacional da chave R & D de China, concessão/número da concessão: 2017YFC1103704; Sanming projeto de medicina em Shenzhen, Grant/Award Number: SZSM201412020; Fundos especiais para a construção de hospitais de alto nível na província de Guangdong (2019); Fundo para a construção da disciplina médica de nível elevado de Shenzhen, concessão/número da concessão: 2016031638; Shenzhen Fundação de saúde e planejamento familiar Comissão, Grant/Award Number: SZXJ2017021 e SZXJ2018059. Agradecemos a Hancheng Zhang e Zhicheng Zou da Universidade de Shenzhen por ajudar na preparação do manuscrito.
Materials
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride：0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride：1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap （T25） | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe（5mL） | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
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