Summary
Vi beskriver förfaranden för behandling av nyfödda råtta hjärn vävnad att få högupplösta elektronmikrografer för morfometriska analys av synaptisk vesikler distribution vid nervterminaler. De mikrografer som erhålls med dessa metoder kan också användas för att studera morfologin hos ett antal andra cellulära komponenter och deras dimensionella strukturella relationer.
Abstract
Vårt laboratorium och många andra har utnyttjat den höga upplösnings kraften i transmissionselektronmikroskopi för att studera morfologin och den rumsliga organiseringen av synaptiska vesikler. För att erhålla högkvalitativa elektronmikrografer som kan ge den grad av morfologisk detalj som krävs för kvantitativ analys av pre-synaptisk vesikeldistribution är optimal preparat preparering kritisk. Kemisk fixering är det första steget i processen för preparat beredning, och av yttersta vikt för att bevara fina ultrastruktur. Vaskulär fixering med en glutaraldehyd-formaldehyd lösning, följt av behandling av vibratome-Snittade prover med osmium tetroxid, stabiliserar det maximala antalet molekyler, särskilt proteiner och lipider, och resulterar i överlägsen bevarande av ultrastruktur. Vävnad bearbetas sedan med counterfärgning, sekventiell uttorkning och harts-inbäddning. En block färgning med uranyl acetat (dvs färgning av vibratome-snittad vävnad innan harts inbäddning) förbättrar endogena kontrasten och stabiliserar cell komponenter mot extraktion under preparat bearbetning. Kontrasten kan ökas ytterligare genom applicering av uranyl acetat som en post-fläck på ultratunna sektioner. Dubbel färgning av ultratunna sektioner med blycitrat efter behandling med uranyl acetat förbättrar också bildens upplösning, genom att intensifiera elektron-opacitet av nukleinsyra-innehållande strukturer genom selektiv bindning av bly till uranyl acetat. Transmission elektronmikroskopi är ett kraftfullt verktyg för karakterisering av morfologiska Detaljer av synaptiska vesikler och kvantifiering av deras storlek och rumsliga organisation i terminalen Bouton. Men eftersom den använder fast vävnad, transmissionselektronmikroskopi kan bara ge indirekt information om levande eller föränderliga processer. Därför bör andra tekniker övervägas när huvud syftet är att studera dynamiska eller funktionella aspekter av synaptisk vesikel trafficking och exocytos.
Introduction
Vi beskriver metoder för beredning av hjärn vävnad från nyfödda råttor för att erhålla högkvalitativa elektronmikrografer för djupgående morphometrisk analys av synaptisk vesikelspatial fördelning vid nervterminaler1,2. De hög kontrast mikrografer som kan erhållas genom bearbetning av prover efter dessa metoder kan också användas för att studera den detaljerade morfologin av ett antal cellulära komponenter och deras dimensionella strukturella relationer3,4.
Transmission Electron Mikroskop (TEM) är ett kraftfullt verktyg för att studera morfologi av organeller andra cellulära strukturer kvantitativt. Från och med detta årtionde, det finns inga andra metoder för utredning som kan ge samma grad av upplösning av Lipidmembran och organeller utan immuno-taggning, med undantag för kryofixering genom högtrycks frysning. Emellertid, frysa substitutions tekniker används inte i stor utsträckning, och normalt kräver dyr utrustning och långa förberedelse tider.
För att kunna dra nytta av TEM: s höga upplösnings effekt är optimal preparat beredning av största vikt. De viktigaste målen för preparat preparatet är att bevara vävnads strukturen med minimal förändring från den levande tillstånd, förbättra preparat kontrast, och stabilisera vävnaden mot utvinning av cellulära komponenter under bearbetning och exponering för elektronen Beam. Många protokoll för TEM vävnads beredning har införts och fulländat av flera laboratorier under årens lopp. Många av dem har fokuserat på metoder för optimal visualisering av synaptiska vesikler5,6,7,8,9,10,11. Bland ett antal väletablerade, guldmynt standard metoder som för närvarande används, valde vi förfaranden för kemisk fixering, post fixation, en Bloc färgning, sekventiell uttorkning, harts inbäddning och efter färgning som syftar till att bevara optimal vävnads struktur och uppnå utmärkt bild kontrast. Notera, bevarandet av fina ultrastruktur kan vara särskilt utmanande när man arbetar med nyfödda råtta hjärn vävnad. Faktum är att det centrala nerv systemet hos mycket unga djur kännetecknas av en högre vatten halt än den vuxna hjärnan, mer framträdande utvidgning av extracellulära utrymmen, och lösare anslutningar mellan cellerna12. Detta gör nyfödda råtta hjärn vävnad djupt känslig för förändringar i osmolaritet, och utsökt benägna att artifaktuella krympning och/eller svullnad när bearbetas genom sekventiella lösningar av olika Tonicity12. Därför använde våra metoder lösningar för preparat bearbetning som är av osmolaritet så nära som möjligt till den hos råtta nyfödda hjärnan. Vårt mål var att få högkvalitativa, högupplösta elektronmikroskopi bilder för kvantitativ bedömning av synaptisk vesikel spatial distribution vid nervterminaler. Specifikt försökte vi mäta antalet vesikler i nerven terminalen, avståndet till synaptiska vesikler från pre-synaptiska plasma membranet, antalet vesikler dockad vid pre-synaptiska membranet, storleken på synaptiska vesikler och Inter-Vesicle avstånd1.
Tillfredsställande kemisk fixering är en förutsättning för att erhålla högkvalitativa elektronmikrografer som kan ge den morfologiska detalj som krävs för att studera synaptisk vesikelmorfologi och spatial organisation. Även om flera lägen för fixering finns, fixering av hjärn vävnad genom vaskulär per fusion är avgjort överlägsen andra metoder. Eftersom fixering via vaskulär per fusion börjar omedelbart efter gripandet av systemisk cirkulation, förkortar det intervallet mellan syresättning av hjärn vävnaden och tvär bindning av proteiner med fixativ, vilket resulterar i minimala förändringar i cell Struktur. Dessutom åstadkommer det snabb och enhetlig penetration, på grund av det snabba flödet av fixativ från kärl bädden till extracellulära och cellulära fack12,13,14. Primär fixering med glutaraldehyd, följt av sekundär fixering (post-fixation) med osmium tetroxid, ger utmärkt bevarande av den fina strukturen15,16,17. En blandning av glutaraldehyd och paraformaldehyd har den extra fördelen av mer snabb penetration i vävnaden12.
Eftersom biologiska vävnader inte är tillräckligt stela för att skärs i tunna partier utan stöd av en harts matris, måste de bäddas in i ett medium innan tunn snittning. Vatten-immiscible epoxihartser används ofta som en inbäddning medium i TEM. När denna typ av matris används, måste alla preparat fritt vatten bytas ut mot ett organiskt lösnings medel före harts infiltration. Vatten avlägsnas genom att provet passerar genom en serie lösningar av stigande koncentrationer av etanol och/eller aceton12. I detta protokoll är proverna först plana inbäddade mellan flexibla aclar ark, sedan inbäddade i en kapsel. resultatet är vävnad som ligger på spetsen av ett cylindriskt harts block, som har den ideala geometri som minst påverkas av vibrationer som uppstår under mikrotomen snittning.
Färgning med tung metaller för att förbättra endogen vävnad kontrast är en annan viktig aspekt av preparatet preparat. Bildens kontrast i TEM beror på elektrons spridning av atomerna i vävnaden. Biologiskt material består dock till stor del av låga Atom vikt molekyler (dvs. kol, väte, syre och kväve). Därför kräver generering av tillräcklig spridning kontrast införlivandet av hög Atom vikt atomer i cellulära komponenter i vävnaden. Detta uppnås genom färgning av preparatet med tung metaller12,18,19. Osmium tetroxid, uran och bly, som binder starkt till lipider, är de vanligaste tung metaller som används som elektron fläckar.
Osmium (Atom nummer 76) är en av de tätaste metallerna i tillvaron. Det är både en fixativ och en fläck, även om dess primära roll i TEM är som en pålitlig fixativ12. Bland de olika bindnings protokoll som används är metoden för dubbel fixering med glutaraldehyd som följs av osmium den mest effektiva för att reducera extraktionen av cell bestånds delar under preparat preparatet. Dessa två fixativ används för att stabilisera det maximala antalet olika typer av molekyler, särskilt proteiner och lipider, och resultera i överlägsen bevarande av vävnad ultrastruktur12,14,15, 16 för att , och 17.
Uran (Atom nummer 92) är den tyngsta metallen som används som elektron fläck, oftast i form av uranyl acetat. På samma sätt som osmium, fungerar den som en fläck och fixativ, även om dess primära roll i tem är som en fläck20,21. Nukleinsyra-innehållande och membranös strukturerar är starkt och befläckas prioriterat med uranyl saltar i aldehyde-fixade vävnader22,23. Behandling av vävnader med uranyl acetat efter osmication och före Dehydrering resulterar i stabilisering av membranös och nukleinsyra-innehållande strukturer, samt förbättrad kontrast, och tillåter identifiering av vissa strukturella detaljer som inte skulle kan lätt upptäckas i prover som har betats med osmium ensamt12,24,25. Det är tänkt att uranyl acetat kan stabilisera den fina strukturen genom att kombinera med reducerad osmium som har deponerats på Lipidmembran under osmication24. Maximal kontrast uppnås när uranyl acetat appliceras före inbäddning och som en post-fläck i tunna avsnitt12.
Bly (Atom nummer 82) är den vanligaste fläcken som används för TEM och är främst anställd för efter färgning av tunna sektioner. Blysalter har hög elektron opacitet och visar affinitet för ett brett spektrum av cellulära strukturer, inklusive membran, nukleära och cytoplasmatiska proteiner, nukleinsyror och glykogen26,27. När dubbel färgning metoden är anställd (dvs, färgning med uranyl acetat följs av behandling med bly), den senare fungerar som en utvecklare av uranyl acetat färgning. Till exempel, bly efter färgning av kromatin fast med glutaraldehyd ökar uranyl acetat upptag med en faktor på tre28,29,30,31,32. Bly ökar också färgning förmedlas av andra metaller som osmium. Det är tänkt att bly salter fläcken membranen av osmium-fasta vävnader genom att fästa till Polar gruppen av fosfatider i närvaro av reducerad osmium33. En potentiell nackdel med färgning med både uranyl acetat och bly, särskilt för långvarig varaktighet, är att många olika strukturella element är färgade lika och icke-specifikt, och därmed inte kan lätt skiljas från en annan12 .
Den senaste tidens införande av alternativa ljus källor, såsom i optisk super-upplösning foto-aktiverad lokalisering mikroskopi, har betydligt bättre ljus mikroskopi upplösning34. Men eftersom ljus mikroskopi förlitar sig på histokemiska och immuncytokemiska metoder för att visualisera individuellt märkta proteiner eller enzymer, kraften i TEM för att visa alla strukturella element på en gång är oöverträffad för fördjupad studie av morfologi och dimensions relationer i vävnads strukturer. I synnerhet, ingen annan teknik kan ge den morfologiska detaljer som krävs för att utföra morphometriska analys av synaptisk vesikler distribution vid pre-synaptiska nerv boutons. Det är dock viktigt att notera att elektronmikrografer fångar strukturen i vävnaden efter att organismen dör, och därför kan de inte ge information om dynamiken i pre-synaptisk vesikel trafficking och exocytos. Därför, andra verktyg, såsom FM färg-Live Imaging och patch-Clamp elektrofysiologi, bör övervägas när det huvudsakliga målet är att studera dynamiska och/eller funktionella aspekter av synaptisk vesikel trafficking och exocytos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla studier godkändes av den institutionella djur omsorgs-och användnings kommittén vid University of Virginia (Charlottesville, VA) och genomfördes i enlighet med de nationella hälso instituten rikt linjer.
1. fixering genom vaskulär perfusion
Anmärkning: En allmän beskrivning av metoden för råtta hjärna vaskulär per fusion har redan detaljerade i denna tid skrift13 och ligger utanför tillämpningsområdet för detta protokoll. Emellertid, följande steg är specifika för beredning av nyfödda råtta hjärn vävnad att få högkvalitativa elektronmikrografer för kvantitativ analys av synaptiska vesikler distribution vid pre-synaptiska terminaler.
-
Förbered 4% paraformaldehyd
- Placera 800 mL 0,1 M fosfatbuffert (PB) i en 2 L glas bägare på en Omrörnings platta under en draghuv. Värm till ca 60 ° c utan att koka upp bufferten.
- Tillsätt 40 g paraformaldehyd pulver. Rör om kontinuerligt
- När du mäter pH, tillsätt små droppar av 10 N NaOH tills lösningen försvinner. Slutligt pH ska vara 7,2-7,4.
- Tillsätt resterande 0,1 M PB till en slutlig volym på 1 L. Låt svalna, filtrera med ett 0,45 μm membran och förvara vid 4 ° c över natten.
Anmärkning: Förbered ny paraformaldehyd dagen innan per fusion.
Var försiktig: Inandning av aldehydångor kan orsaka näs symtom och irritation i luftvägarna. Hud kontakt orsakar dermatit. Aldehyder ska hanteras i en Fume-huva med handskar, en skyddande klänning och skydds glasögon
-
Förbered Tyrode-lösningen
- Placera 1 L destillerat vatten i en glas bägare på en Omrörnings platta. Tillsätt NaCl (8 g), KCl (0,15 g), CaCl2 (0,1 g), mgcl2 (0,006 g), NaH2Po4 (0,055 g), NaHCO3 (1 g) och dextros (1 g) i bägaren.
- Rör om kontinuerligt och mät pH. Behåll pH mellan 7,2 och 7,4.
Anmärkning: Tyrode-lösningen är också kommersiellt tillgänglig.
- Blanda 4% paraformaldehyd med glutaraldehyd vid en koncentration på 2%. Tillsätt 40 mL elektronmikroskopi-grad 50% glutaraldehyd till 1 L av 4% paraformaldehyd. Blanda väl i en Omrörnings platta
Anmärkning: Cirka 100 mL av paraformaldehyd-glutaraldehyd fixativ lösning behövs för att parfymera kroppen av en nyfödd råtta. Därför kan minst 10 nyfödda råttor parfymeras med 1 L fixativ. Blanda inte paraformaldehyd och glutaraldehyd förrän omedelbart före användning. Ta alla lösningar till rums temperatur före per fusion. - När till gång till vänster kammare har vunnits (se hela djuret per fusion protokoll13), spola kärl systemet med Tyrode lösning för 30 s vid ett per fusions tryck på 120 mmHg.
Anmärkning: Framgången för per fusion beror delvis på fullständig uteslutning av blod från kärl bädden - Spola med paraformaldehyd-glutaraldehydlösning med samma tryck under 10 min.
Anmärkning: Underhåll av konstant per fusions tryck är viktigt för att undvika införandet av artefakter. Dessutom bör temperaturen på parfymen inte vara under råttans kropps temperatur för att undvika vasokonstriktion - Ta bort den fasta hjärnan från skallen och placera i färsk paraformaldehyd-glutaraldehyd fixativ vid 4 ° c över natten.
Obs: protokollet kan pausas här.
2. Brain skivning
- Bädda in den fasta hjärnan i 4% AGA ros och limma hjärnan-AGA ros blocket på en vibratome skede
Anmärkning: Andra laboratorier har fått bra kvalitet sektioner genom att uppnå en stabil block på vibratome utan agar stöd - Snitt skivor på 50 μm tjocklek. Ställ in mikrotomen på låg frekvens och hastighet.
Anmärkning: Sektioner kan förvaras i 0,1 M PB med 0,05% natriumazid vid 4 ° c under flera år. - Placera avsnitten i 0,1 M PB i en petriskål, Undersök avsnitten under ett dissektion Mikroskop och välj preparat för inbäddning
Anmärkning: Protokollet kan pausas här.
3. sköljning
Anmärkning: Det är viktigt att skölja preparatet efter fixering med aldehyder och före efterfixering med osmium, eftersom restfixeringsmedel kan ge osmium precipitater
- Pipettera 0,1 M PB till en kort, bred mun glas flaska med lock. Placera ett prov per injektions flaska. Täck preparatet helt så att det inte torkar.
Anmärkning: Förvara proverna i samma injektions flaska från detta steg genom alla lösnings förändringar av fixering, uttorkning och infiltration, tills de är redo för platt inbäddning. - Skölj preparatet i 0,1 M PB i 3 min x 2 och ta sedan bort PB med en mikropipett.
Anmärkning: Eftersom hjärnan hos den nyfödda råtta är djupt känslig för förändringar i osmolaritet12,35,36,37, utför tvättningarna i samma fordon som används i den fixerande blandningen
4. efter fixering med osmium
-
Beredning av osmium tetroxid (OsO4)
Anmärkning: Denna författarens Lab använder OsO4 4% levereras i en vatten lösning i glasampuller (5 ml av Oso4 4% i H2O). Andra labb har använt OsO4 kristaller framgångs rikt. Emellertid, flera timmar är nödvändiga för att lösa ut OsO4 kristaller i ett fordon.- Ta 5 mL (en ampull) med 4% OsO4/H2O, öppna den och placera den i en brun glas flaska
Anmärkning: OsO4 är ett starkt oxidations medel och lätt reduceras genom exponering för ljus. Reduktion kan undvikas under beredning genom att placera OsO4 i en brun glas flaska - Tillsätt 5 mL 0,2 M PB. Detta kommer att ge 10 mL 2% OsO4/0,1 M PB.
Anmärkning: Eftersom hjärnan hos den nyfödda råtta är djupt känslig för förändringar i osmolaritet, använda samma buffert för att förbereda aldehyd fixativ och Oso4 lösning12,35,36,37 - Tillsätt ytterligare 10 mL 0,1 M PB. Detta kommer att ge en slutlig lösning av 20 mL 1% OsO4 i 0,1 m PB.
- Använd en 20 mL spruta försedd med en lång nål för att dra 1% OsO4 och placera den i en brun glas flaska eller en Scint flaska täckt med aluminiumfolie.
Var försiktig: OsO4 är extremt flyktigt och dess ångor är giftiga för näsa, ögon och svalg. Allt arbete bör utföras i en Fume-huva med handskar och skyddskläder, och ingen kropps del bör utsättas för OsO4. Hantering och bortskaffande av avfall bör ske i enlighet med institutionens rikt linjer. Förvara oanvända OsO4 i en tätt tillsluten brun glas flaska med Teflon liner på glaset propp, Linda flaskan i dubbel aluminiumfolie och förvara i en dessicator. I närvaro av läckande ångor, kan OsO4 missfärgar interna ytor och innehållet i kyl skåpet. Enligt de ovan nämnda förvarings villkoren är OsO4 -lösningen stabil i flera månader. När lösningarna blir oxiderade under lagringen blir de gråa, i vilket fall de måste kasseras.
- Ta 5 mL (en ampull) med 4% OsO4/H2O, öppna den och placera den i en brun glas flaska
- Tillsätt 1% OsO4 i 0,1 M PB i preparat flaskan och Låt sitta i 1 h. extrahera Oso4 efter 1 h med en mikropipett.
Anmärkning: Innan du ansöker OsO4 till avsnittet, är det viktigt att vika och platta preparatet. Undvik applicering direkt ovanpå preparatet, Använd istället flaskans väggar för att försiktigt droppa OsO4 till botten av injektions flaskan. Preparatet blir brunt och stelt strax efter OsO4 -applicering. Hantera försiktigt från och med nu för att undvika vävnads skada
5. sköljning
Anmärkning: Det är viktigt att skölja preparatet efter efter fixeringen med OsO4 och före Dehydrering, eftersom restfixeringsmedel kan reagera med dehydratiseringsmedel37.
- Skölj med 0,1 M PB i 3 min x 3.
Anmärkning: Eftersom hjärnan hos den nyfödda råtta är djupt känslig för förändringar i osmolaritet, utföra tvättningar i samma fordon som används i den fixerande blandningen12,35,36,37. - Placera osmium lösningen och första två PB sköljs till OsO4 avfall och kassera det enligt din institutions rikt linjer.
6. sekventiell uttorkning och färgning med uranyl acetat
Anmärkning: Denna författarens laboratorium använder vatten-immiscible epoxihartser för inbäddning. När epoxihartser används, måste alla preparat fritt vatten bytas ut mot ett organiskt lösnings medel före infiltration av inbäddnings mediet. Vatten avlägsnas genom att provet passerar genom en serie lösningar av stigande koncentrationer av etanol och aceton12.
-
Beredning av uranyl acetat (UA)
- Placera en 200 mL volymetrisk glaskolv innehåll ande 100 mL EtOH 70% på en Omrörnings platta.
- Tillsätt 4 g UA till kolven. Linda in aluminiumfolie (UA fälltates när den utsätts för ljus) och rör om kontinuerligt.
Anmärkning: UA upplöses långsamt och ofullständigt i 70% EtOH. Låt oupplösta kristaller att bosätta sig innan du använder lösningen. UA-lösning ska filtreras med ett 0,45 μm filter före användning. UA kan förberedas i förväg och förvaras i en brun flaska insvept i aluminiumfolie vid 4 ° c i månader.
Var försiktig: UA är milt radioaktivt och mycket giftigt. Inandning av UA pulver kan orsaka övre luftvägs sjukdomar och lung sjukdom, lever och njurar. UA är farligt vid förtäring eller när det kommer i direkt kontakt med hud och slem hinnor. Allt arbete ska utföras i en Fume-huva med handskar och skyddskläder. Hantering och bortskaffande av avfall bör ske i enlighet med institutionens rikt linjer.
- Dehydrat i 50% EtOH för 1 min. ta bort 50% EtOH innan du lägger UA.
-
Tillsätt 4% UA i 70% EtOH. Låt sitta i 1 h eller över natten. Om natten, placera i kyl skåpet vid 4 ° c.
Anmärkning: lock injektions flaska för att undvika EtOH avdunstning och täck med aluminiumfolie för att undvika exponering för ljus. Protokollet kan pausas här.- Kassera UA-avfall och de två följande sköljseserna enligt institutionens rikt linjer.
- Dehydrat i 70% EtOH för 1 min.
- Dehydrat i 90% EtOH för 5 min.
- Dehydrat i 100% EtOH för 5 min x 2.
- Skölj preparatet i aceton i 2 min x 3.
7. infiltration och inbäddning
Anmärkning: Vävnader är inte tillräckligt stela för att skära i tunna sektioner utan ytterligare stöd av en harts matris. Därför måste infiltration och inbäddning föregå snittningen12.
-
Beredning av EPON harts
- Använd en spruta för 60 mL sonden. Ta bort sprutkolven och locket på sprutan med en säkerhetskanyl.
- Placera sprutan med den öppna sidan uppåt och tillsätt volymen av varje ingrediens i hartsblandningen stegvis. Tillsätt 22 mL av embed-812 (harts). Tillsätt DDSA (härdare) till en total volym på 37 mL. Tillsätt NMA (härdare) till en total volym på 50,5 mL. Tillsätt 525 μL DMP-30 (Accelerator) med en pipett. Flytta pipettens kolv mycket långsamt eftersom DMP är mycket trög flytande.
Obs: det är viktigt att lägga till inbäddnings reagenserna i den ordning som anges. Acceleratorn (DMP-30) måste läggas till sist. För att få en härdad block som har de önskade egenskaperna, är det viktigt att använda den exakta mängden av härdare och gas pedalen. Nyberedda inbäddnings blandningar föredras. - Sätt tillbaka kolven och placera sprutan på en rocker med kontinuerlig skakning i minst 30 min. färgen kommer att ändras från gult till gult.
Anmärkning: Alla ingredienser måste blandas mycket noggrant. Underlåtenhet att göra detta resulterar i ojämn impregnering av vävnadsprover och ett block av ojämn hårdhet
- Blanda 1 volym EPON harts med 1 volym aceton i en Scint injektions flaska och skaka för att blanda. Applicera den 1:1 EPON: aceton blandningen på vävnaden efter avlägsnande av den sista aceton skölj. Hålla täckt för att undvika aceton avdunstning. Ta bort den 1:1 blandningen av harts och aceton efter 2-4 h eller hålla över natten.
Obs: protokollet kan pausas här. - Ersätt blandningen av harts och aceton med full harts. Låt sitta i 4 h eller över natten. Lägg alla EPON avfall i en uppsamlings behållare under huven som skall polymeriseras och bortskaffas senare.
Obs: protokollet kan pausas här.
8. platta bäddar
Anmärkning: Proverna är platta inbäddade mellan två aclar filmer på ett Sandwich-liknande sätt.
- Skär två rektangulära bitar av tydliga aclar blad. Torka av filmerna rena med EtOH 70%. Trimma arken så att det finns minst 1,5 cm av vävnad-fri plast på varje sida av sektionen. Den aclar blad på toppen bör ha samma bredd som botten, och dess höjd bör vara cirka två tredjedelar av det undre arket.
- Luta injektions flaskan långsamt med preparatet och lyft försiktigt vävnaden från botten av injektions flaskan.
- Använd en mikro-flexibel spatel och en fin borste för att försiktigt flytta avsnittet längs injektions flaskans väggar och överför till aclar arket.
Anmärkning: Hantera sektioner med försiktighet för att undvika preparat skador. - Placera försiktigt det aclar arket ovanpå preparatet.
Anmärkning: Se till att det finns tillräckligt med harts mellan de två arken för att täta smörgås - Tryck försiktigt ut eventuella fångade luft bubblor utan att utöva direkt tryck på sektionen. Utplåna överskottet av EPON.
Anmärkning: Eli minering av luft bubblor är viktigt, eftersom deras närvaro gör visualisering av preparatet svårt och försvagar stabiliteten i hartsbindningarna. - Märk arken med en lösnings medels resistent penna och placera i ugnen på 60 ͦC för 2-3 dagar att polymerisera.
Obs: protokollet kan pausas här.
9. inbäddning av kapslar
Anmärkning: Ultramicrotomes levereras med chuckar för att hålla cylindriska block som erhållits från inbäddning av prover i kapslar. Cylindriska block har den ideala geometrin som minst påverkas av vibrationer som uppkommer vid snittning.
- Öppna försiktigt de inklämt aclar filmerna. Preparatet kommer att följa en av de två aclar ark.
- Använd en injektions penna som tål lösnings medel för att markera sidan av den aclar-plåt som innehåller sektionen. Mark nära vävnaden.
Anmärkning: Det är viktigt att utföra detta steg innan stansning ut vävnaden av intresse. - Använd en skiva punch för att få ett cirkel prov av avsnittet. Penn märket ska vara en del av den utstansade vävnaden.
- Förbered locket på en inbäddnings kapsel sida upp på en kapsel hållare. Placera en droppe harts på locket.
- Placera den stansade skivan innanför locket med vävnads sektionen vänd uppåt. Penn markeringen lyser när ljuset lyste på preparatet.
- Sätt in en kapsel i locket och Använd fin pincett för att sätta in etiketter. Rulla och sänk en tryckt 2 cm lång pappers bit i kapseln. Gör etiketten så att den passar till krökningen av sido väggarna på kapseln. Vänta tills polymerisation att vara komplett, så att etiketten blir permanent inbäddade i kådan.
- Häll inkapslingkådan inuti kapseln och fyll tills kanten på kapseln.
- Skjut vävnads provet ner till botten av kapseln med hjälp av en spetsig träpinne och placera i ugnen vid 60 ° c i 2-3 dagar.
Anmärkning: Var noga med att inte pressa vävnaden för hårt, i stället låta den ligga löst så att ett tunt lager av inbäddnings mediet är närvarande mellan vävnaden och kapseln ytan. Protokollet kan pausas här.
10. trimning av block ansikte
Anmärkning: Liten storlek och lämplig form av blocket ansikte är förutsättningar för tillfredsställande snittning. Därför är trimning av preparat blocket en nödvändighet.
- Använd ett skarpt rakblad med en kant. Rengör med aceton omedelbart före användning.
- Montera kapsel blocket i en block hållare och placera block hållaren på ett stereomicroscope-Stadium.
Anmärkning: Trimnings proceduren ska utföras under Mikroskop kikare och sned belysning. - Ta bort den aclar ark från spetsen av kapseln med hjälp av ett rakblad. Den aclar blad visas som ett glänsande lager under ljuset av dissekera omfattning.
- Håll rakbladet i en vinkel på 45 grader och gör nedskärningar fyra sidor av kapsel blocket.
Anmärkning: Bättre kontroll av trimningen uppnås om klingan hålls med båda händerna. - Gör genvägar så att blocket tar formen av en kort Pyramid med vägg vinklar på cirka 45 °.
Anmärkning: Preparat ytan stöds mycket bättre om sidorna som leder till den hålls korta. Om block spetsen är för tunn och lång kommer den att vibrera under tunn snittning. Helst bör området av intresse vara centrerad i blocket ansiktet. - Trimma spetsen på kapseln för att kassera överflödig vävnad och endast bevara området av intresse.
Anmärkning: Ingen del av sektionen ska vara utan vävnad, eftersom variationer i densiteten av blocket ansikte är en viktig orsak till svårighet i snittning. Helst bör ytan av kapsel ansiktet vara högst 1 mm2. - Trimma kapseln ansiktet i form av en scalenus trapezoid. Eftersom det i en scalenus trapetsoid ingen sida är lika, denna form är bäst att orientera området av intresse i förhållande till resten av preparatet.
Anmärkning: Under snittning, är den trapezoid-formade ansikte stöds mycket bättre än någon annan form.
11. mikrotom snittning
Anmärkning: De flesta biologiska prover är för tjocka i sitt naturliga tillstånd för att kunna penetreras av en elektron stråle. Därför måste materialet skäras i tunna sektioner som kan penetreras av elektron strålen.
- Skär tunna snitt (Silver interferensfärg, 600-900 Å) på en ultramicrotome på plan parallellt med ytan.
- Placera avsnitten på rutnät. Denna författarens labb använder koppar galler av 3,05 mm i ytterdiameter.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här.
12. efter färgning med uranyl acetat
- Förbered 2% UA i destillerat vatten. Placera en 200 mL volymetrisk glaskolv innehåll ande 100 mL destillerat vatten på en Omrörnings platta. Tillsätt 2 g UA till kolven. Linda in aluminiumfolie (UA fälltates när den utsätts för ljus) och rör om kontinuerligt.
Anmärkning: För information om UA-beredning, se avsnitt 6 i detta protokoll. - Placera flera enskilda droppar av 2% UA på ett rent ark av Dental vax i en petriskål.
- Flyta rutnätet med preparatet (sektions sidan nedåt) på en droppe UA för 25 min.
Anmärkning: Flyta varje rutnät på en separat droppe UA. - Håll i rutnätet vid dess kant med pincett och skölj två gånger under en mild stråle av kokt destillerat vatten vid rums temperatur från en plast tvätt flaska.
Anmärkning: Låt inte gallret torka innan du färglägger med bly.
13. efter färgning med bly
- Förbered en CO2-fri kammare (co2 i luften är den primära källan till bly nederbörd). Placera en bit filter papper indränkt med 1 N NaOH i en petriskål. Placera ett litet blad av ren tand vax ovanpå filtret papper och placera flera NaOH pellets på ena sidan av skålen. Täck skålen.
Anmärkning: Förbered denna inställning innan rutnäten är färgade med UA, så att atmosfären i kammaren är fri från CO2 och redo för bly färgning av den tid UA färgning är klar. - Gör 4% NaOH. Tillsätt 0,2 g NaOH till 5 mL destillerat vatten.
- Förbered Sato ' s trippel bly lösning. För beredning av 10 mL, tillsätt 0,1 g bly nitrat, 0,1 g blycitrat, 0,1 g blyacetat och 0,2 g natriumcitrat i en glas flaska. Tillsätt 8,2 mL destillerat vatten och skaka kraftigt i 5 min. Sonikera för 30 s, tillsätt sedan 1,8 mL nygjord 4% NaOH.
- Placera flera droppar av Sato: s bly på vaxet i petriskål.
- Placera rutnätet färgas med UA (avsnitt sida ner) på droppe bly.
Anmärkning: Varje rutnät bör vara flöd på en separat droppe bly. Varje droppe bör vara tillräckligt liten för att låta nätet flyta ovanpå kupolen på Drop istället för att glida ner på sidorna. - Täck skålen och låt fläcken i 5 min.
- Håll i rutnätet vid dess kant med pincett och tvätta grundligt under en mild stråle av kokt destillerat vatten vid rums temperatur från en plast tvätt flaska.
- Blot torka rutnätet på filter papper och lagra rutnätet.
Anmärkning: Se till att sektionen inte kommer i direkt kontakt med filter papperet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Allmänna kriterier som oftast godtas som indikation på tillfredsställande eller defekt bevarande av preparat för TEM har fastställts. Dessa kriterier exemplifieras i fyra utvalda elektronmikrografer (två exempel på optimala förberedelser, två exempel på defekt preparering) som erhölls genom behandling av unga råtta hjärn vävnad enligt de metoder som beskrivs i detta protokoll.
I allmänhet, en god kvalitet elektron mikrograf visas som en ordnad, distinkt och övergripande gråaktig bild. I ett tillfredsställande preparerat prov bör mellanrum mellan membranen fyllas med granulärt material och får inte vara tomma. På samma sätt bör inga tomma utrymmen finnas i det cytoplasmatiska jord ämnet eller inom organeller (jämför figur 1a och figur 2A med figur 3 och figur 4). Det är dock viktigt att notera att det centrala nerv systemet hos mycket unga djur visar en viss grad av utvidgning av extracellulära utrymmen jämfört med den vuxna hjärnan, med lösare kopplingar mellan celler och en övergripande vitare, mindre elektron täta utseendet. Membranen ska vara kontinuerlig, utan förvrängning eller brott (figur 1a och figur 2A). Den stroma av mitokondrier bör visas enhetlig och tät, utan tomma utrymmen. Cristae ska vara intakt och inte svullen, och det mitokondriella yttre dubbla membranet bör vara obruten (jämför figur 1a med figur 3). För att under lätta morphometriska analys av pre-synaptisk vesikel organisation, pre-och post-synaptiska membran måste vara intakt och i huvudsak parallellt med varandra (se figur 1). Synaptiska vesikler bör vara spårbara och bundna av ett sammanhängande enda membran (se figur 2).
Viktigt, även när bästa praxis följs, behandling av preparatet med fixativ, fläckar och hartser introducerar artefakter. Eftersom artefakter inte kan elimineras, är det viktigt att förstå vilken process som härstammar från dem, så att utseendet på preparatet kan tolkas med avseende på den behandling som den genomgick12. Ett exempel på en artefakt-bland flera som kan genereras under preparatet förberedelse för tem-är en myelin siffra, en membranös lamellär inkludering som liknar myelin slidor. Även om myelin siffror kan ses i patologiska förhållanden12, de oftast beror på extraktion av membran lipider under fixering med aldehyder (se figur 4).
Figur 1: Elektronmikrograf representativ för tillfredsställande bevarande av cell strukturen (exempel 1). (A) neuronala cell membran är skiktad och utan raster. Cytoplasman är finkornig och utan tomma utrymmen. Mitokondrier är varken svullna eller krympt. Deras yttre dubbla membran bevaras, och inre cristae är intakt. (B) detalj av panel A, exemplifiera en metod för att mäta avståndet mellan synaptiska vesikler från pre-synaptiska membranet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Elektronmikrograf representativ för tillfredsställande bevarande av cell strukturen (exempel 2). (A) synaptiska vesikler är distinkta och kantade av ett obruten enda membran. För att möjliggöra morphometriska analys av synaptisk vesikler distribution, pre-synaptiska och post-synaptiska membran måste vara parallella och deras kontinuitet bevaras. (B) detalj av panel A, exemplifiera räkning av synaptiska vesikler inom pre-synaptic terminalen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Elektronmikrograf representativ för defekt bevarande av vävnads strukturen (exempel 1). Notera distorsion och brott av neuronala cell membran och förekomsten av markant förstorade extracellulära utrymmen (markerade med *). Mitokondrier verkar utspänd och har svullen cristae (markerad med pil). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Elektronmikrograf representativ för defekt bevarande av vävnads strukturen (exempel 2). Notera närvaron av stora vita tomma utrymmen inom cytoplasman (märkt med ǂ), i stället för finkornig Cytoplasmatisk substans. Extracellulära utrymmen verkar för sto rad. En artefakt membranös trissan (myelin figur), sannolikt till följd av mobilisering av lipider under fixering med glutaraldehyd, är märkt med förkortningen MF. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hantering av vävnads sektioner under preparat preparering för TEM kräver en avsevärd grad av finess, koncentration och tålamod. När du använder en mikropipett för att lägga till och ta bort lösningar, kan proverna sugs in i pipettspetsen med ytspänning, så du bör vara noga med att undvika vävnads skada genom pipetten. Också, vissa steg i dehydratiseringssekvensen kan vara så snabb som 1 min, därav operatören måste arbeta snabbt för att säkerställa att nästa Dehydrering steg startas i tid och preparatet inte torkar eller skrynklas. Ett förfarande som kräver särskild uppmärksamhet är post-fixering med osmium. Avsnitten blir stela efter behandling med osmium och kan lätt skadas. Innan du lägger osmium, är det viktigt att avsnitten är tillplattade på botten av injektions flaskan, annars någon vika kommer att resultera i vävnads fraktur. Hantering av osmicated vävnad är särskilt utmanande när man överför sektioner på aclar filmer för platt inbäddning. Särskild försiktighet behövs när du lyfter preparatet från botten av injektions flaskan för att undvika fragmentering, och när du trycker luft bubblor ur filmen smörgås. Även om det är viktigt att driva ut någon fångad luft, eftersom det gör visualisering av preparatet svårt och försvagar stabiliteten i harts obligationer, direkt tryck på osmicated vävnad kan lätt orsaka skador. Ett annat steg som nödvändiggörs extra vård är beredning av hartsblandningen för preparat infiltration och inbäddning. EPON, den mest använda inbäddning harts, kan härdas med tillsats av en härdare och en Accelerator. Det är absolut nödvändigt att använda den exakta mängden härdare och Accelerator för att få en härdad block med de önskade egenskaperna. Både gravimetriska och volymetriska metoder har beskrivits för att mäta viskösa hartser. Även gravimetriska metoder traditionellt har ansetts mer exakt12, har denna författarens laboratorium haft god framgång med volymetriska lägen (dvs., att lägga till volymen av varje ingrediens i hartsblandningen stegvis med hjälp av en sonder spruta) . Efter hartskomponenterna har noggrant mätts, måste de blandas mycket grundligt för att åstadkomma en enhetlig impregnering, eftersom de besitter olika viskositeter och frekvenser av polymerisation. Underlåtenhet att uppnå fullständig blandning kommer att resultera i ett block av ojämn hårdhet som är olämplig för tunn snittning.
Markerade förändringar i Tonicity av de lösningar som används för att behandla avsnitt av unga råtta hjärna kan orsaka krympning och/eller svullnad av det extracellulära utrymmet och cellulära komponenter12,35,36,37 . Under fixering erhålls de bästa resultaten när det osmotiska trycket i parfymen hålls så likt det som möjligt av den vävnad som studeras. Råtta hjärna osmolalitet är ca 330 mOsm. En 2% glutaraldehyd i 0,1 M PB lösning är bara något hypertonisk (400-450 mosm) och minimerar expansion av extravaskulär utrymme12. Särskilt, membran förblir känsliga för förändringar i osmotiska trycket i sköljning och Dehydrering lösningar efter fixering med aldehyder. Därför är det också viktigt att minimera skillnaderna mellan fixeringsverktylens osmolaritet och de lösningar som används därefter12,35,36,37. Av denna anledning används samma fordon (0,1 M PB, ungefärlig osmolaritet 440 mOsM) som lösnings medel för alla lösningar i detta protokoll. Det bör dock noteras att flera olika buffertar har använts framgångs rikt under preparat förberedelse för TEM och ingen enskild buffert kan göra anspråk på universell överlägsenhet över de andra. När buffertar för lägre tonicitet föredras, andra laboratorier har valt att öka osmolaritet med elektrolyter eller icke-elektrolyter12.
Flera steg i detta protokoll kräver användning av kemikalier som kan vara giftiga när de inte hanteras på rätt sätt. Vikten av att arbeta under en Fume-huva och bära personlig skyddsutrustning vid hantering av aldehyder, osmium, uran och bly föreningar kan inte överskattade. Medan automatiserade kontrasterande system kan bidra till att dämpa en del av risken och är kommersiellt tillgängliga, de kan vara ganska dyrt och kan inte vara överkomligt av laboratorier som inte gör rutinmässig användning av TEM. Även om elektron Mikroskop laboratoriet potentiellt kan vara en farlig plats, är preparat bearbetningen för TEM generellt sett säker när den utförs rigoröst.
Nyligen, införandet av super-upplösning ljus mikroskopi har ökat optisk avbildning lösa makt till ca 15 nm34. Men när målet är att utföra morphometriska analys av synaptisk vesikel rumsliga organisation vid pre-synaptiska terminaler, ger ingen teknik samma grad av morfologiska detaljer. Viktigt är att TEM begränsas av behovet av preparatet att vara död innan den kan bearbetas och visualiseras. Därför, när studien målet är att undersöka dynamiska eller funktionella aspekter av synaptisk vesikel trafficking och exocytos, andra verktyg än TEM bör övervägas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta manuskript stöddes av NIH/NIGMS K08 123321 (till N.L.) och av medel från Institutionen för anestesiologi vid University of Virginia. Författarna vill tacka alev Erisir (Institutionen för biologi, University of Virginia, Charlottesville, VA) för utmärkt utbildning och teknisk assistans med TEM, och för hennes ovärderliga manuskript kritik. Författarna tackar också Advanced Electron Microscopy anläggningen vid University of Virginia för teknisk hjälp med preparat snittningen och efter färgning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | "size 00, flat (cut bottom)" |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats. Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).
- Sanchez, V., et al. General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain. Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).
- Boscolo, A., et al. The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity. Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).
- Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study. Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).
- Akert, K., Sandri, C. Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses. Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. Santini, M. , Raven Press. NY. 387-399 (1975).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy. Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid. Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).
- Burry, R. W., Lasher, R. S. A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA. Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).
- Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique. Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).
- Pfenninger, K. H. The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method. Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).
- Hayat, M. A. Chemical fixation. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. Hayat, M. A. , Cambridge University Press. 4-84 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. Hayat, M. A. , Academic Press. San Diego. (1981).
- Behrman, E. J., et al. The chemistry of osmium tetroxide fixation. The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. Revel, J. P., et al. , Scanning Electron microscopy Inc, AMF. O’Hare, Chicago. 1-5 (1983).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins. Journal of Hystochemistry & Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).
- Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands. Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).
- Zobel, C. R., Beer, M. The use of heavy metal salts as electron stains. International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).
- Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy. Experientia. 24 (10), 1074 (1968).
- Terzakis, J. A. Uranyl acetate, a stain and a fixative. Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).
- Feldman, I., Jones, J., Cross, R. Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides. Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).
- Shah, D. O. Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer. Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).
- Daems, W. T., Persijn, J. P. Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue. Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&4), 199-201 (1963).
- Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).
- Derksen, J. W., Meekes, H. Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate. Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).
- Frasca, J. M., Parks, V. R. A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts. Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).
- Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. A stable lead by modification of Sato’s method. Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).
- Sato, T. A modified method for lead staining of thin sections. Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).
- Lever, J. D. A method of staining tissues with lead for electron microscopy. Nature. , 810-811 (1960).
- Derek, G., et al. Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy. Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).
- Richards, J. G. Ultrastructural histochemistry of nervous tissue. Techniques in Neuroanatomical Research. Heyn, C., Forssmann, W. G. , Springer. Berlin. 277-292 (1981).
- Wood, R. L., Luft, J. H. The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide. Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).
- Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer. Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).
