מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים
Summary
CRISPR-Cas9 הטכנולוגיה מספקת שיטה יעילה בדיוק לערוך את הגנום היונקים בסוג תא כלשהו ומייצג את האמצעים הרומן לבצע מסכי גנטי רחב הגנום. פרוטוקול מפורט לדון בצעדים הנדרשים עבור ביצועים מוצלחים של מסכי CRISPR-Cas9 הגנום הרחב מסופק כאן.
Abstract
עריכת הגנום באמצעות מערכת crispr-Cas יש מתקדם מאוד את היכולת לערוך בדיוק את גנום של אורגניזמים שונים. בהקשר של תאים מיונקים, טכנולוגיה זו מייצגת את האמצעים החדשניים לבצע הגנום-רחב מסכים גנטיים למחקרים גנומיקה תפקודית. ספריות של rnas מדריך (sgrna) מיקוד כל מסגרות הקריאה הפתוחה להתיר את הדור נתיישב של אלפי רטבאליות גנטית בבריכה אחת של תאים שניתן הוקרן עבור פנוטיפים ספציפיים כדי לסבך את הפונקציה גן ותהליכים סלולריים ב דרך לא משוחדת ושיטתית. CRISPR-Cas מסכי לספק לחוקרים עם שיטה פשוטה, יעילה, זולה לחשוף את התוכניות הגנטיות עבור פנוטיפים סלולריים. יתר על כן, ניתוח דיפרנציאלי של מסכי שבוצעו קווי תאים שונים מסוגים שונים של סרטן יכול לזהות גנים כי הם הכרחיים בתאי הגידול, חשיפת מטרות פוטנציאליות עבור טיפולים ספציפיים נגד סרטן. ביצוע מסכי הגנום כלל בתאים אנושיים יכול להיות מרתיע, כמו זה כרוך בטיפול של עשרות מיליוני תאים ודורש ניתוח של קבוצות גדולות של נתונים. הפרטים של המסכים האלה, כגון אפיון קו התא, שיקולי הספרייה של CRISPR, והבנת המגבלות והיכולות של טכנולוגיית CRISPR במהלך הניתוח, מתעלמים לעתים קרובות. בתנאי כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור ביצוע מוצלח של במאגר הגנום CRISPR-Cas9 מבוססי מסכי.
Introduction
Crispr-Cas, קיצור עבור מקובצים באופן קבוע במרווחים של palindromic קצר ולאחר מכן ו crispr הקשורים נוקלאז, מורכב חלבון נוקלאז יחיד (למשל, Cas9) מורכב עם מדריך סינתטי RNA (sgrna). זה מורכב ribonucleoprotein מטרות האנזים Cas9 כדי לגרום להפסקות DNA כפול שנתקע על לוקוס גנומית מסוימת1. כפול תקועים הפסקות ניתן לתקן דרך הומולוגיה תיקון מכוון (HDR) או, בדרך כלל, באמצעות שאינם הומוולוגיים הצטרפות (NHEJ), שגיאה מועדת תיקון מנגנון כי תוצאות ההוספה ו/או מחיקות (INDELS) כי לעתים קרובות לשבש את פונקציית הגן 1. היעילות והפשטות של CRISPR מאפשר רמה בעבר בלתי מושג של גנומית מיקוד כי הרבה עולה מעל הגנום הקודם לעריכת טכנולוגיות [i.e., האצבעות אבץ נוקלאוסיס (הזפה) או שעתוק activator כמו הנוקלאוסים ( TALENS), שניהם סובלים ממורכבות עיצוב מוגבר, יעילות החצייה הנמוכה יותר, ומגבלות בתוך מעגל העריכה של הקולנוע2].
היישום מחקר בסיסי של CRISPR בודד מדריך מבוסס RNA הגנום המבוסס על עריכת מדענים ביעילות ובזול לחקור את הפונקציות של גנים בודדים וטופולוגיה של רשתות אינטראקציה גנטית. היכולת לבצע מסכי הגנום הפונקציונלי היה משופר מאוד על ידי שימוש במערכת CRISPR-Cas, במיוחד כאשר בהשוואה לטכנולוגיות מוקדמות יותר גנטי כגון התערבות RNA (RNAi) ומוטזיס גנים מלכודת. בפרט, rnai סובל השפעות גבוהות מחוץ למטרה ואת הנוק-אין שלם, וכתוצאה מכך רגישות נמוכה יותר וספציפיות לעומת crispr3,4,5, בעוד שיטות מלכודות גנטי ניתן רק בהפלואיד תאים עבור מסכי אובדן-פונקציה, הגבלת היקף דגמי התא שניתן לחקור6. היכולת של CRISPR לייצר הגן המלא לנקוש לכבות מספק מערכת חזקה יותר ביולוגית לחקור פנוטיפים מוטנטים, עם רעש נמוך, השפעות מינימליות מחוץ ליעד ופעילות עקבית על פני ריאגנטים5. Crispr-Cas9 sgrna ספריות המטרה הגנום האנושי כולו זמינים כעת נרחב, המאפשר דור סימולטני של אלפי גנים להוריד בניסוי אחד3,7,8,9 .
פיתחנו מאוד CRISPR-Cas9 הגנום-wide sgRNA בספריות ויראליות בשם טורונטו לנקוש-out (TKO) ספריות (זמין דרך Addgene) כי הם קומפקטי רצף ממוטב כדי להקל על ברזולוציה גבוהה מסכי גנומיקה תפקודית. הספרייה העדכנית ביותר, TKOv3, מטרות ~ 18,000 האדם בקידוד הגנים עם מדריכים 71,090 ממוטב לעריכת יעילות באמצעות נתונים אמפיריים10. בנוסף, TKOv3 זמין כספרייה חד-קומפוננטי (LCV2:: TKOv3, מזהה Addgene #90294) המבטא Cas9 ו sgRNAs על וקטור יחיד, הקלה על הצורך ליצור תאים Cas9 ביטוי יציב, המאפשר הגנום רחב לנקוש על פני מגוון רחב של סוגי תאים ממיונקים. TKOv3 זמין גם בווקטור ללא Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene מזהה 125517) והוא יכול להיות מנוצל בתאים לבטא Cas911.
הגנום-wide CRISPR-Cas9 לערוך אוכלוסיית התאים ניתן לחשוף לתנאי גדילה שונים, עם שפע של sgRNAs לאורך זמן ככמת על ידי הדור הבא רצף, מתן הבדיקה כדי להעריך את הירידה או העשרה של תאים עם המעקב גנטי רטבאליות. הספריות של CRISPR מעלף ניתן לרתום כדי לזהות גנים כי, על פי הטורבציה, לגרום לפגמים בכושר הסלולר, רגישות מתונה תרופות (למשל, גנים רגישים או עמידים), להסדיר ביטוי חלבון (למשל, עיתונאי), או נדרשים עבור מסוים פונקציית מסלול ומדינה. סלולרית12,13,14 לדוגמה, מסכי כושר דיפרנציאלי בקו התאים של סרטן יכול לזהות גם דלדול או הפחתה של אונאוגנים והעשרה או גידול של דכאי הגידול גנים3,14,15. באופן דומה, שימוש במינונים בינוניים של תרופות טיפוליות יכול לחשוף הן עמידות לסמים והן גנים הרגישות16,17.
בתנאי כאן הוא פרוטוקול הקרנה מפורטת עבור CRISPR-בקנה מידה-Cas9 אובדן הפונקציה של ההקרנה באמצעות הספריות של טורונטו-out (TKOv1 או v3) בתאי היונקים מהדור הספרייה, הקרנת ביצועים לניתוח נתונים. למרות שפרוטוקול זה הותאם במיוחד להקרנה באמצעות הספריות לדפיקה בטורונטו, ניתן להחילם ולהפוך לניתן להרחבה לכל הספריות הנמצאות במאגר.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשל הפשטות של השימוש שלה pliability גבוהה, הטכנולוגיה CRISPR כבר אומץ נרחב ככלי הבחירה עבור עריכת הגנום מדויק. ההקרנה CRISPR במאגר מספק שיטה לחקור אלפי רטבאליות גנטית בניסוי אחד. במסכים במאגר, ספריות sgRNA לשמש כברקודים מולקולריים, כמו כל רצף הוא ייחודי ממופה הגן המיועד. על ידי בידוד ה-DNA גנומית מאוכלוסי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי הגנום קנדה, קרן מחקר אונטריו, ואת המוסדות הקנדיים לחקר הבריאות (מגב-142375, PJT-148802).
Materials
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
References
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
- Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
- Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
- Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
- Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
- Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
- Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
- Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
- Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , (2017).
- Pedregosa, F. V., G, , et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
- Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
- Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user’s guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
- Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
- Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
- Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
- Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).
