Summary

Gepoolde CRISPR-gebaseerde genetische schermen in zoogdiercellen

Published: September 04, 2019
doi:

Summary

Crispr Cas9-technologie biedt een efficiënte methode om het genoom van zoogdieren in elk celtype nauwkeurig te bewerken en vertegenwoordigt een nieuw middel om genoom-brede genetische schermen uit te voeren. Hier vindt u een gedetailleerd protocol over de stappen die nodig zijn voor het succesvol uitvoeren van gepoolde CRISPR Cas9 schermen.

Abstract

Genoom bewerking met het crispr-CAS-systeem heeft de mogelijkheid om de genomen van verschillende organismen nauwkeurig te bewerken enorm uitgebreid. In de context van zoogdiercellen vertegenwoordigt deze technologie een nieuw middel om Genome-brede genetische schermen voor functionele genomics-onderzoeken uit te voeren. Bibliotheken van Guide RNAs (sgRNA) gericht op alle open Lees frames toestaan de facile generatie van duizenden genetische verstoringen in een enkele pool van cellen die kunnen worden gescreend voor specifieke fenotypes om de genfunctie en cellulaire processen in een zonder vooringenomen en systematische wijze. CRISPR-CAS schermen bieden onderzoekers een eenvoudige, efficiënte en goedkope methode om de genetische blauwdrukken voor cellulaire fenotypes te achterhalen. Bovendien kan differentiële analyse van schermen uitgevoerd in verschillende cellijnen en van verschillende kankersoorten genen identificeren die contextueel essentieel zijn in tumorcellen, waardoor potentiële doelen voor specifieke therapieën tegen kanker worden onthuld. Het uitvoeren van genoom-brede schermen in menselijke cellen kan ontmoedigend zijn, omdat dit de behandeling van tientallen miljoenen cellen inhoudt en een analyse van grote gegevenssets vereist. De details van deze schermen, zoals de karakterisering van de cellijn, overwegingen van CRISPR Library en het begrijpen van de beperkingen en mogelijkheden van CRISPR-technologie tijdens de analyse, worden vaak over het hoofd gezien. Hier is een gedetailleerd protocol voor de succesvolle prestaties van gegroepeerde genoom-Wide CRISPR Cas9 gebaseerde schermen.

Introduction

CRISPR-CAS, kort voor geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen en CRISPR-geassocieerde nuclease, bestaat uit een enkelvoudig Nuclease eiwit (bijv. Cas9) in complex met een synthetische gids RNA (sgRNA). Dit RiboNucleoProteïne complex richt zich op het Cas9 enzym om dubbel gestrande DNA-onderbrekingen te induceren bij een specifieke genomische Locus1. Dubbel-gestrande pauzes kunnen worden gerepareerd via homologie gerichte reparatie (HDR) of, meer in het algemeen, door niet-homologeuze end-aansluiting (NHEJ), een foutgevoelig reparatie mechanisme dat resulteert in inbrengen en/of verwijderingen (INDELS) die vaak de genfunctie verstoren 1. de efficiëntie en eenvoud van crispr maakt een eerder onbereikbaar niveau van genomische targeting mogelijk dat ver overtreft eerdere genoom bewerkings technologieën [d.w.z. zink vinger nucleasen (znf) of transcriptie Activator-achtige Effector nucleasen ( TALENS), die beide lijden aan een verhoogde ontwerp complexiteit, lagere transfectie-efficiëntie en beperkingen in multiplex Gene Editing2].

De basis onderzoekstoepassing van CRISPR single-Guide RNA-gebaseerde genoom Editing heeft wetenschappers toegestaan om de functies van individuele genen en de topologie van genetische interactie netwerken efficiënt en voordelig te ondervragen. De mogelijkheid om functionele genoom-brede schermen uit te voeren is sterk verbeterd door het gebruik van het CRISPR-CAS systeem, vooral in vergelijking met eerdere genetische perturbatie technologieën zoals RNA interferentie (RNAi) en Genval mutagenese. In het bijzonder lijdt RNAi aan hoge doel effecten en onvolledige knockdown, wat resulteert in een lagere gevoeligheid en specificiteit in vergelijking met crispr3,4,5, terwijl gentrap methoden alleen haalbaar zijn in haploïde cellen voor verlies-van-functie schermen, beperking van het bereik van celmodellen die kunnen worden verhoord6. Het vermogen van CRISPR om volledige genknock-out te genereren biedt een meer biologisch robuust systeem om Mutante fenotypes te ondervragen, met weinig ruis, minimale off-target effecten en consistente activiteit over reagentia5. Crispr Cas9 sgrna-bibliotheken die het hele menselijke genoom targeten, zijn nu algemeen beschikbaar, waardoor gelijktijdige opwekking van duizenden genknock-outs in een enkel experiment3,7,8,9 .

We hebben unieke CRISPR-Cas9 Genome-wide sgRNA lentivirale bibliotheken ontwikkeld, de Toronto knock-out (TKO) bibliotheken (beschikbaar via Addgene) die compact en sequence-geoptimaliseerd zijn om functionele genomics schermen met hoge resolutie te faciliteren. De nieuwste bibliotheek, TKOv3, richt zich op ~ 18.000 humane eiwit codering genen met 71.090 gidsen geoptimaliseerd voor het bewerken van efficiëntie met empirische data10. Daarnaast is TKOv3 beschikbaar als een bibliotheek met één component (LCV2:: TKOv3, Addgene ID #90294) die Cas9 en sgRNAs uitdrukken op een enkele vector, waardoor de noodzaak voor het genereren van stabiele Cas9-uitstellende cellen wordt verlicht, zodat het genoom-brede knock-out over een breed scala aan celtypen van zoogdieren. TKOv3 is ook beschikbaar in een vector zonder Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene ID # 125517) en kan worden gebruikt in cellen die Cas911uitdrukken.

Een genoom-brede CRISPR Cas9 bewerkte celpopulatie kan worden blootgesteld aan verschillende groeiomstandigheden, waarbij de overvloed aan Sgrna’s in de tijd wordt gekwantificeerd door de volgende generatie sequencing, waardoor een uitlezen wordt gegeven om de drop-out of verrijking van cellen te beoordelen met traceerbare genetische Verstoringen. CRISPR knock-out bibliotheken kunnen worden aangewend om genen te identificeren die, na perturbatie, cellulaire fitness defecten veroorzaken, matige geneesmiddel gevoeligheid (bijv. gevoelige of resistente genen), eiwit expressie reguleren (bijv., reporter), of zijn vereist voor een bepaalde Pathway functie en cellulaire toestand12,13,14. Differentiële fitness schermen in een kankercel lijn kunnen bijvoorbeeld zowel de uitputting als de reductie van oncogenen en verrijking of een toename van de tumor suppressors genen3,14,15identificeren. Evenzo kan het gebruik van tussenliggende doses therapeutische geneesmiddelen zowel de resistentie van de drug en sensibilisatie genen16,17onthullen.

Hier is een gedetailleerd screening protocol voor CRISPR-Cas9 verlies-van-functie screening met behulp van de Toronto knock-out libraries (TKOv1 of v3) in zoogdiercellen van bibliotheek generatie, screening van prestaties tot gegevensanalyse. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor screening met behulp van de Toronto knock-out Bibliotheken, het kan worden toegepast en schaalbaar te worden tot alle CRISPR sgRNA gepoolde bibliotheken.

Protocol

De hieronder beschreven experimenten moeten de richtlijnen van het Instituut voor milieu gezondheid en veiligheid volgen. 1. gepoolde CRISPR sgRNA lentivirale bibliotheek plasmide versterking Verdun de kant-en-klare CRISPR sgRNA plasmide DNA-bibliotheek tot 50 ng/μL in TE (bijv. TKOv3). Electroporate de bibliotheek met behulp van elektrocompetente cellen. Stel in totaal vier elektroporation reacties in zoals hieronder beschreven. Voeg 2 μL 50 ng/μL TKO-bibliothee…

Representative Results

Overzicht van de CRISPR-screening-workflow voor genoom schaal Afbeelding 1 illustreert een overzicht van de gepoolde crispr-screening-werkstroom, beginnend met infectie van doelcellen met crispr Library lentivirus bij een lage Moi om te zorgen voor enkelvoudige integratie gebeurtenissen en adequate bibliotheek representatie (meestal 200-tot 1000 -fold). Na infectie worden cellen beh…

Discussion

Vanwege de eenvoud van gebruik en hoge buigbaarheid, is CRISPR-technologie op grote schaal goedgekeurd als het instrument van keuze voor precieze genoom bewerking. Gepoolde CRISPR-screening biedt een methode om duizenden genetische verstoringen te ondervragen in één experiment. In gepoolde schermen dienen sgRNA-bibliotheken als moleculaire barcodes, omdat elke sequentie uniek is en wordt toegewezen aan het beoogde gen. Door het genomisch DNA van de celpopulatie te isoleren, kunnen genen die het fenotype van belang vero…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door Genome Canada, het Ontario Research Fund en de Canadian Institutes for Health Research (MOP-142375, PJT-148802).

Materials

0.22 micron filter
30°C plate incubator
37°C shaking incubator
37°C, 5% CO2 incubator
5 M NaCl Promega V4221
50X TAE buffer BioShop TAE222.4
6 N Hydrochloric acid solution BioShop HCL666.500
95% Ethanol
Alamar blue ThermoFisher Scientific DAL1025
Blue-light transilluminator ThermoFisher Scientific G6600
Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade Bioshop ALB001.250
Dulbecco's Modification of Eagles Medium Life Technologies 11995-065 Cel culture media
Electroporation cuvettes BTX 45-0134
Electroporator BTX 45-0651
Endura electrocompetent cells Lucigen 90293
Fetal Bovine Serum GIBCO 12483-020
HEK293T packaging cells ATCC CRL-3216 recommend passage number <15
Hexadimethrine Bromide (Polybrene) Sigma H9268 Cationic polymer to enhance transduction efficiency
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)
LB agar plates with carbenicillin
LB medium with carbenicillin
Low molecular weight DNA ladder New England Biolabs N3233S
Nanodrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONE-W
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544L
Opti-MEM Life Technologies 31985-070 Reduced serum media
Plasmid maxi purification kit Qiagen 12963
pMD2.G (envelope plasmid) Addgene Plasmid #12259 lentiviral system
psPAX2 (packaging plasmid) Addgene Plasmid #12260 lentiviral system
Puromycin Wisent 400-160-UG
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
Qubit dsDNA BR assay ThermoFisher Scientific Q32853
Qubit fluorometer ThermoFisher Scientific Q33226
RNAse A Invitrogen 12091021
S.O.C recovery medium Invitrogen 15544034
SYRB Safe DNA gel stain ThermoFisher Scientific S33102
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included Addgene Addgene ID #90203 Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA
Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 Addgene Addgene ID #125517 Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA
Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0
UltraPure agarose ThermoFisher Scientific 16500500
Wizard genomic DNA purification kit Promega A1120
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent Roche 06 365 809 001 Lipid based transfection reagent

References

  1. Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
  2. Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
  3. Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  4. Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
  5. Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  6. Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
  7. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  8. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  9. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
  10. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
  11. Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
  12. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  13. Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  14. Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
  15. Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
  16. Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
  17. Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
  18. Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
  19. Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
  20. Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , (2017).
  21. Pedregosa, F. V., G, , et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
  22. Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
  23. Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user’s guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
  24. Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
  25. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
  26. Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
  27. Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
  28. Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).

Play Video

Cite This Article
Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (151), e59780, doi:10.3791/59780 (2019).

View Video