Summary
CRISPR-Cas9 teknolojisi, memeli lerin genomunu herhangi bir hücre tipinde tam olarak dizmek için etkili bir yöntem sağlar ve genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç tır. Havuzlu genom genişliğindeCRISPR-Cas9 ekranlarının başarılı bir şekilde performans alabildikleri adımları tartışan ayrıntılı bir protokol burada verilmiştir.
Abstract
CRISPR-Cas sistemini kullanarak genom düzenleme, çeşitli organizmaların genomlarını tam olarak düzenleme yeteneğini büyük ölçüde ilerletmiştir. Memeli hücreleri bağlamında, bu teknoloji fonksiyonel genomik çalışmalar için genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç temsil eder. Tüm açık okuma çerçevelerini hedefleyen kılavuz RNA'ların (sgRNA) kütüphaneleri, gen fonksiyonunu ve hücresel süreçleri bir tarafsız ve sistematik bir şekilde. CRISPR-Cas ekranlar, araştırmacılara hücresel fenotiplerin genetik planlarını ortaya çıkarmak için basit, verimli ve ucuz bir yöntem sunar. Ayrıca, çeşitli hücre hatları ve farklı kanser türlerinde gerçekleştirilen ekranların diferansiyel analizi tümör hücrelerinde bağlamsal olarak gerekli olan genleri belirleyebilir, belirli antikanser tedavileri için potansiyel hedefleri ortaya koymaktadır. İnsan hücrelerinde genom genişliğinde ekranlar yapmak göz korkutucu olabilir, çünkü bu on milyonlarca hücrenin işlenmesini gerektirir ve büyük veri kümelerinin analizini gerektirir. Hücre satırı karakterizasyonu, CRISPR kitaplık konuları ve analiz sırasında CRISPR teknolojisinin sınırlamalarını ve yeteneklerini anlama gibi bu ekranların ayrıntıları genellikle göz ardı edilir. Burada havuzlu genom çapında CRISPR-Cas9 tabanlı ekranların başarılı performans için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır.
Introduction
CRISPR-Cas, kümelenmiş düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar ve CRISPR ilişkili nükleaz ın kısaltması, sentetik bir kılavuz RNA (sgRNA) ile kompleks halinde tek bir nükleaz proteininden (örn. Cas9) oluşur. Bu ribonükleoprotein kompleksi Cas9 enzimini hedef alarak belirli bir genomik lokus1'deçift iplikçikli DNA kırıklarına neden olur. Çift iplikli molalar homoloji yönelimli onarım (HDR) veya daha yaygın olarak, homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) yoluyla onarılabilir, sık sık gen fonksiyonunu bozan ekleme ve/veya silme (INDELS) ile sonuçlanan hataya açık bir onarım mekanizması 1. CRISPR'ın etkinliği ve basitliği, önceki genom düzenleme teknolojilerini (örneğin, çinko parmak çekirdekleri (ZNF) veya transkripsiyon aktivatör benzeri efektör çekirdekleri aşan daha önce ulaşılmaz bir genomik hedefleme düzeyisağlar ( TALENS), her ikisi de artan tasarım karmaşıklığı muzdarip, düşük transfection verimliliği, ve multipleks gen düzenleme sınırlamaları2].
CRISPR tek kılavuzLu RNA tabanlı genom düzenleme temel araştırma uygulaması bilim adamları verimli ve ucuza bireysel genlerin işlevlerini ve genetik etkileşim ağlarının topoloji sorgulamak için izin verdi. Özellikle RNA paraziti (RNAi) ve gen kapanı mutagenezi gibi daha önceki genetik pertürbasyon teknolojileri ile karşılaştırıldığında, crispr-Cas sisteminin kullanımı yla fonksiyonel genom çapındaki ekranlar gerçekleştirebilme yeteneği büyük ölçüde artırılmıştır. Özellikle, RNAi yüksek off-hedef etkileri ve eksik nakavt muzdarip, CRISPR göre daha düşük duyarlılık ve özgüllük sonuçlanan3,4,5, gen tuzak yöntemleri haploid sadece uygulanabilir iken fonksiyon kaybı ekranlar için hücreler, sorgulanabilir hücre modellerinin kapsamını sınırlayan6. CRISPR'ın tam gen nakavtı üretme yeteneği, mutant fenotipleri sorgulamak için daha biyolojik olarak sağlam bir sistem sağlar, düşük gürültü, minimum hedef dışı etkiler ve reaktifler arasında tutarlı aktivite5. Tüm insan genomunu hedefleyen CRISPR-Cas9 sgRNA kütüphaneleri artık yaygın olarak mevcuttur, tek bir deneyde binlerce gen nakavtının aynı anda üretilmesine izinverir 3,7,8,9 .
Toronto Knock-out (TKO) kütüphaneleri (Addgene aracılığıyla temin edilebilir) adı verilen ve yüksek çözünürlüklü genomik ekranları kolaylaştırmak için kompakt ve dizi optimize edilmiş benzersiz CRISPR-Cas9 genom çapındaki sgRNA lentiviral kütüphaneler geliştirdik. En son kütüphane, TKOv3, hedef ~ 18,000 insan protein kodlama genleri ile 71.090 kılavuzları ampirik veri10kullanarak düzenleme verimliliği için optimize edilmiştir. Buna ek olarak, TKOv3 tek bileşenli bir kütüphane olarak kullanılabilir (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) tek bir vektör üzerinde Cas9 ve sgRNA'ları ifade ederek, geniş bir yelpazede genom çapında nakavt sağlayan, kararlı Cas9 ifade eden hücreler üretme ihtiyacını hafifleterek memeli hücre tipleri. TKOv3 cas9 olmadan bir vektör de mevcuttur (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID # 125517) ve Cas911ifade hücrelerde kullanılabilir.
Genom çapında crispr-Cas9 düzenlenmiş hücre popülasyonu farklı büyüme koşullarına maruz kalabilir, zaman içinde sgRNA bolluğu yeni nesil sıralama ile ölçülür, izlenebilir genetik hücrelerin terk veya zenginleşmesi değerlendirmek için bir okuma sağlayan tedirginlikler. CRISPR nakavt kütüphaneleri, tedirginlik üzerine hücresel fitness bozukluklarına, orta derecede ilaç duyarlılığına (örneğin, hassas veya dirençli genler) neden olan, protein ekspresyonunu (örn. muhabir) düzenleyen veya belirli bir yol fonksiyonu ve hücresel durum12,13,14. Örneğin, bir kanser hücresi hattında diferansiyel fitness ekranları hem tükenmesi veya onkogenlerin azaltılması ve zenginleştirme veya tümör bastırıcıgenler genlerin bir artış tespit edebilirsiniz3,14,15. Benzer şekilde, terapötik ilaçların ara dozlarda kullanarak hem ilaç direnci ve duyarlılık genleri ortaya çıkarabilir16,17.
Burada verilen genom ölçekli CRISPR-Cas9 fonksiyon kaybı tarama için ayrıntılı bir tarama protokolü Toronto Knock-out kütüphaneleri kullanarak (TKOv1 veya v3) kütüphane nesil memeli hücrelerde, veri analizi için tarama performansı. Bu protokol Toronto Knock-out kitaplıkları kullanılarak tarama için optimize edilmiş olsa da, uygulanabilir ve tüm CRISPR sgRNA havuzlu kütüphaneler için ölçeklenebilir hale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda özetlenen deneyler, enstitünün Çevre Sağlığı ve Güvenliği Ofisi yönergelerine uymalıdır.
1. Havuzlu CRISPR sgRNA lentiviral kütüphane plazmid amplifikasyon
- Hazır CRISPR sgRNA plazmid DNA kitaplığını TE'de 50 ng/μL'ye seyreltin (örn. TKOv3).
- Elektro-yetersiz hücreleri kullanarak kütüphaneyi elektroporate. Aşağıda açıklandığı gibi toplam dört elektroporasyon reaksiyonu ayarlayın.
- 2 μL 50 ng/μL TKO kitaplığına 25 μL çözülmüş elektroyit hücrelerini önceden soğutulmuş cuvettelere (1,0 mm) buz üzerinde ekleyin.
- Üreticiprotokolü tarafından önerilen optimum ayarları kullanarak elektroporate. Darbenin 10 s içinde, cuvette için Kurtarma Orta (veya SOC orta) 975 μL ekleyin.
- Elektrohaplı hücreleri bir kültür tüpüne aktarın ve 1 mL Kurtarma Ortamı ekleyin. 37 °C'de 1 saat için 250 rpm bir sallayarak inkübatör tüpleri.
- Kitaplığı titretlemek ve dönüşüm verimliliğini tahmin etmek için bir seyreltme plakası ayarlayın.
- 8 mL'lik tüm hücreleri birleştirin ve iyice karıştırın. Havuzlanmış hücrelerin 10 μL'sini 800 kat seyreltme için 990 μL'lik Kurtarma Ortamı'na aktarın ve iyice karıştırın.
- Önceden ısıtılmış 10 cm LB + carbenicillin (100 μg/L) agar plaka üzerine seyreltmenin 20 μL'si. Bu dönüşüm verimliliğini hesaplamak için kullanılacak dönüştürücülerin 40.000 kat seyreltilmesi ile sonuçlanır.
- Toplam 20 önceden ısıtılmış 15 cm LB + carbenicillin agar plakası boyunca her plakaüzerinde kurtarılan hücrelerin plaka400 μL' si. Plakaları 30 °C'de 14-16 h'ye inkübedin.
NOT: Bu düşük sıcaklıktaki büyüme, uzun terminal tekrarları (LTR)18arasındaki rekombinasyon en aza indirir. - Dönüşüm verimliliğini hesaplamak için, 40.000 kat seyreltme plakası üzerindeki koloni lerin sayısını sayın (adım 1.3.2). Tüm plakalarda toplam koloni sayısını elde etmek için 40.000 ile sayılan kolonilerin sayısını çarpın. Toplam koloni sayısı sgRNA başına en az 200x koloniye eşdeğer bir kitaplık kapsamını temsil ediyorsa devam edin (en uygun u500-1000x).
- Örneğin, TKOv3 kütüphanesi (71.090 sgRNA) için en az koloni numarası 1.4 x 107'dirve bu sayı sgRNA başına 200x koloniye eşittir. Koloni temsili yetersizse, minimum kütüphane kapsamını elde etmek için seyreltme plakasındaki kolonilerin sayısına bağlı olarak 1.2.
- Aşağıda açıklandığı gibi kolonileri hasat
- Her 15 cm plaka için, 7 mL LB + carbenicillin (100 μg/L) orta ekleyin, sonra bir hücre yayıcı ile kolonileri kazıyın. 10 mL'lik pipetle, kazınmış hücreleri steril 1 L konik şişeye veya şişeye aktarın.
- Bir kez daha 5 mL LB + carbenicillin orta ile plakayı durulayın ve çözeltiyi şişeye aktarın.
- Tüm tabaklar için 20 tabaktan steril bir şişeye hücreleri bir araya getirin.
- Toplanan hücreleri oda sıcaklığında 1 saat (RT) boyunca bir karıştırma çubuğuyla karıştırarak hücre kümelerini ayırın. Hücreleri önceden tartılmış santrifüj şişelerine ve 7.000 x g'de pelet bakterisine aktarın, sonra da ortamı atın.
- Isliç hücre peletini tartın ve ıslak peletin son ağırlığını belirlemek için santrifüj şişesinin ağırlığını çıkarın. Her sütunun işleyebileceği bakteriyel pelet miktarına bağlı olarak bir maxi veya mega ölçekli plazmid arıtma kiti kullanarak plazmid DNA arındırın.
2. Büyük ölçekli CRISPR sgRNA kütüphane lentivirus üretimi
NOT: Protokolün bu bölümündeki tüm adımlar Sınıf II, Tip A2 biyogüvenlik kabininde bir BSL2+ tesisinde gerçekleştirilir.
- Virüs üretimi için gereken 15 cm plaka sayısını, genellikle 15 cm'lik bir plakadan 18 mL virüs hasat edildiği tahminine göre hesaplayın.
- Hek-293T ambalaj hücrelerini düşük antibiyotikli büyüme ortamlarında (DMEM + %10 FBS + isteğe bağlı: 0,1x kalem/strep) 15 cm'lik plaka başına 8 x 106 hücrede 20 mL'lik ortama tohumlayarak hücreleri transfeksiyona hazırlayın. 37 °C, %5 CO2'debir gecede inkübasyon hücreleri . Kaplamalı hücrelerin %70-%80 oranında aksadığından ve transfeksiyon anında eşit olarak yayıldığından emin olun.
- Ertesi gün, 15 cm plakalar için Tablo 1'de belirtildiği gibi üç transfection plazmid karışımı hazırlayın. Bir transfeksiyon için gerekli plazmid miktarını hesaplayın ve plaka sayısı için plazmidkarışımı yapmak, artı bir transfected olmak.
- Tablo 2'de belirtildiği gibi her transfeksiyon için lipid bazlı transfeksiyon reaktifi hazırlayın. Aliquot, serum ortamını tek tek 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe indirgeyerek transfected plaka sayısını azalttı. Transfeksiyon reaktifi ekleyin, hafifçe karıştırın ve RT 5 dakika kuluçka.
- 5 dk inkübasyon dan sonra, transfeksiyon reaktifine bir transfeksiyon reaktifine bir transfeksiyon reaktifi için gerekli DNA miktarını ekleyin. Yavaşça karıştırın ve RT 30 dakika kuluçka.
NOT: Sonraki transfeksiyonlar, zaman ayarı için optimize etmek ve aşırı kuluçkadan kaçınmak için 5 dakika aralıklarla beş veya daha az sethalinde hazırlanabilir. - Kuluçka 30 dakika sonra, dikkatle ambalaj hücrelerinin her plaka her transfection karışımı aktarın. Hücre monolayer rahatsız etmeden dairesel, zikzak hareket içinde 1 mL pipet ucu dropwise kullanarak tüm karışımı ekleyin. 37 °C'de %5 CO2'de18 saat boyunca kuluçka ya.
- Viral hasat ortamı hazırlayın: 500 mL DMEM orta + 32 mL BSA stoku (20 g/100 mL, DMEM'de çözünmüş, 0,22 μm filtre ile sterilize edilmiş) + 5 mL 100x kalem/strep.
- 18 saat sonra, ortam kaldırın (imha dan önce 30 dakika boyunca % 1 sodyum hipoklorit inkübasyon gibi lentivirus atıkların uygun kullanımı kullanın). Her plakaya 18 mL viral hasat ortamı ile hafifçe değiştirin. 37 °C'de %5 CO2'de18 saat boyunca kuluçka ya.
- 24 saat sonra, iyi bir virüs üretiminin bir göstergesi olarak anormal ve erimiş morfoloji için ambalaj hücreleri kontrol edin. Sonra, tüm supernatant toplayarak ve steril konik santrifüj tüp içine transfer lentivirus hasat.
- Virüs içeren medyayı 5 dk için 300 x g'de döndürün ve ambalaj hücrelerini peletleyin. Aliquot pelet rahatsız etmeden steril bir polipropilen tüp içine supernatant.
- Virüsü kısa süreler için 4 °C'de (1 haftadan az) veya uzun süreli depolama için hemen -80 °C'de saklayın. Aliquot büyük ölçekli virüs, donma/çözülmeyi önlemek için uzun süreli depolama için tek kullanım hacimlerine hazırlanır.
3. Tarama için hücre çizgisi karakterizasyonu
- İstenilen hücre satırını seçin.
- Hücrelerin yaklaşık iki katına çıkarma süresini ölçün ve kaydedin.
- Tercih edilen bir doku kültürü damarında (örn. 15 cm doku kültürü plakaları) her 3-4 hücrede bir hücre nin doku kaplamayoğunluğunu belirlemek.
- Puromisin direnç belirteci içeren TKO kütüphanelerinin seçimi için istenilen hücre hattında kullanılacak puromisin konsantrasyonu aşağıdaki gibi belirleyin:
- 72 saat sonra biraraya ulaşmak için gerekli yoğunlukta 12 kuyu plakası tohum hücreleri, daha sonra bir gecede kuluçka (37 °C,% 5 CO2).
- Ertesi gün, 0,5 g/mL'lik artışlarla 0 μg/mL'den 10 g/mL'ye kadar seyreltme püromisin konsantrasyonları içeren bir ortama geçiş. Hücreleri 48 saat kuluçkaya yatırın.
- 48 saat sonra, hücre sayma veya alamarBlue boyama ile hücre canlılığını ölçün.
- 48 h. 4.6 ve 5.2.6 adımlarında CRISPR kitaplığı transduced hücre popülasyonları için seçmek için bu konsantrasyonu kullanın.
NOT: Daha uzun katlama süresine sahip hücre hatları için puromisin ile daha uzun kuluçkalara tolere edilebilir. Bu gibi durumlarda, <3 hücre ikikatına için gerekli kuluçka süresi için öldürme eğrisini belirleyin. Tarama başlamadan önce temel genlerin terk önlemek için seçim için süre en aza indirin.
- Püromisin duyarlılığını ölçmek için kullanılan yöntemle bir doz yanıt eğrisi gerçekleştirerek hücreleri hekaksimethrine bromüre (8 g/mL'ye kadar) duyarlılığı kontrol edin (adım 3.2). Heksadimethrine bromür <8 μg/mL ile toksisite gözlenirse kullanmayın.
4. MOI tayini için havuzlu CRISPR lentivirus kütüphanesinin fonksiyonel titrasyonu
- Havuzlu CRISPR sgRNA kütüphane lentivirus taze bir aliquot çözülme (örneğin, LCV2::TKOv3) ve buz üzerinde tutmak.
- 0-2 mL (yani 0 mL, 0,25 mL, 0,5 mL, 1 mL ve 2 mL) aralığını test etmek için bir dizi virüs hacmi tasarla.
- 72 saat içinde biraraya ulaşmak için gerekli yoğunlukta 15 cm plakalar hedef hücreleri ve tohum hücreleri hasat.
- Test edilecek her virüs hacmi için, yinelenen plakalar hazırlayın. Hücreleri, virüs, hekaksimethrine bromür (8 μg/mL) ve 20 mL'lik son bir sese ortam ekleyin. Plakaları iyice karıştırın, plakaları kuvözde düz bir şekilde oturun ve 24 saat (37 °C, %5 CO2)kuluçkaya yatırın.
- 24 saat sonra, medya içeren virüs kaldırmak ve bertaraf (lentivirus atık ların taşınması için biyogüvenlik önlemleri kullanın). İsteğe bağlı olarak, hafifçe yabancı virüs kaldırmak için sıcak PBS ile plaka yıkayın.
- Her virüs durumu için, bölüm 3 hücreleri öldürmek için belirlenen konsantrasyonu kullanarak puromisin içeren medya 20 mL ile değiştirin, bir çoğaltma plaka. Diğer plaka için, puromisin olmadan taze medya 20 mL ekleyin. 48 saat (37 °C, %5 CO2)için kuluçka makinesi .
- 48 saat sonra, püromisin ile tedavi edilen tüm enfekte olmayan hücrelerin (0 mL virüs durumu) ölü olup olmadığını kontrol edin. Tüm tabakları tek tek hasat edin ve tekrarlanan nazik pipetleme ile hücreleri dağıtın.
- Tüm plakalardan hücreleri sayın ve her virüs hacmi için moi'yi puromisin (yani +/- puromisin) içermeyen hücre sayılarıyla püromisin seçimiyle karşılaştırarak hesaplayın.
- Puromisin seçimi ile %30-40 hücre sağkalımını sağlayan virüs hacmini belirlemek için grafik sonuçları. Aynı doku kültürü koşulları altında ekran sırasında 0.3-0.4 moi elde etmek için bu virüs hacmi kullanın.
5. Primer ekran enfeksiyonu, seçimi ve hücre geçişi
- Ekran boyunca muhafaza edilecek CRISPR sgRNA kitaplık kapsamını seçin (en az 200 kat önerilir).
- Kütüphane kapsamına bağlı olarak, sgRNA başına bu kapsama alanını korumak için gereken hücre sayısını ve MOI 0.3'te(Tablo 3)enfeksiyon için gerekli olan hücre sayısını belirleyin.
- Enfeksiyonu ayarlamak için gereken plaka sayısını belirleyin(Tablo 4).
- CRISPR kitaplığı ile hücreleri enfekte etme
- Hasat hücreleri ve tohum her 15 cm plaka için gerekli hücre numarası.
- Tüm plakalara hexadimethrine bromür (8 g/mL) ekleyin.
- Virüs moi 0.3 için gerekli hacimde tarama ve Kontrol 2 plakaları ekleyin. Denetim 1 için virüs eklemeyin ve bu birimi medyayla değiştirin.
- Plakaları yatırarak iyice karıştırın. Plakaları kuvöze yerleştirin, düz olduğundan emin olun.
NOT: Toplu enfeksiyonlar, virüs, medya ve hexadimethrine bromür karışımını kaplamadan önce süspansiyondaki hücrelere birleştirerek yapılabilir. - Ortamı çıkarın ve 3.2.4'te belirlenen konsantrasyonda puromisin içeren taze ortamla değiştirin ve virüs enfeksiyonundan sonra 1 plakayı 24 saat kontrol edin. Kontrol 2 plaka hiçbir puromisin ile taze medya ekleyin. 48 saat (37 °C, %5 CO2)için kuluçka hücreleri.
- Puromisin eklenmesinden sonra 48 saat, tüm enfekte olmayan hücrelerin ölü olduğundan emin olun (kontrol 1) puromisin aktivitesini onaylamak için, sonra enfekte hücreleri hasat.
- Enfekte hücre popülasyonu ve hücre geçişi hasat
- Tüm tarama plakalarından puromisin seçilmiş hücreleri tek bir steril kap içine hasat. Her kontrol plakasından hücreleri ayrı ayrı toplayın. Hücreleri nazik tekrarlı pipetleme ile dağıtın.
- Havuzlu tarama hücrelerinden hücreleri sayın, 1'i kontrol edin ve 2'yi ayrı ayrı kontrol edin ve 1 mL'deki hücre sayısını hesaplayın.
- MOI'yi hesaplayın ve elde edilen kapsamı aşağıdaki gibi katlayın:
- Genomik DNA çıkarma için seçilen kütüphane kapsama toplanan hücrelerden hücre peletlerinin üç kopyasını toplayın. 5 dk. PBS ile yıkayın için 500 x g hücreleri santrifüj. Tüpleri etiketleyin ve hücre peletlerini -80 °C'de dondurun (bunlar T0 referans örnekleridir).
- Virüslü hücrelerin havuzunu üç çoğaltma grubuna bölün (örneğin, A'yı çoğaltmak, B çoğaltmak, C'yi çoğaltmak), her çoğaltma içinde kitaplık kapsamını koruyarak. Tohum hücreleri aynı tohumlama yoğunluğunda normalde onları genişletirken kullanılacak. Her çoğaltma plakası için aynı sayıda hücre ve çoğaltmalar arasında aynı toplam hücre sayısını kullanın.
- Hücreleri geçiş ve yukarıdaki gibi havuzlu enfekte hücrelerin her çoğaltma hücre pelet üç çoğaltma hasat devam, her 3-8 gün hücre hattına bağlı olarak, 15-20 hücre iki katına kadar. Her geçitte, her çoğaltma grubundaki tüm plakalardan alınan hücreleri birbiriyle toplayın (örneğin, çoğaltma A plakalarından tüm hücreler birbirine yeniden karıştırılır, B plakalarını çoğaltan tüm hücreler yeniden karıştırılır, vb.).
- Her peleti bir zaman (T) ile etiketlendirin ve atamayı çoğaltın. Bu, T0 sonrası gün sayısına karşılık gelir pelet toplanır (örneğin, T3_A, T3_B, T3_C, vb.
- Negatif seçim ilaç ekranları için, hücrelerin tedaviden önce T0 sonra en az bir geçiş için kurtarmak için izin. T3 veya T6'da, her çoğaltma grubundaki hücreleri (A, B, C) 5.3.5 adımında kullanılan aynı tohumlama yoğunluğunu kullanarak ilaç tedavisi ve kontrol popülasyonlarına bölün.
- Ayrıca, ilaç tedavi grubundaki her çoğaltma için kitaplık kapsamı için gereken hücre sayısını ayrı ayrı birleştirin. Ara konsantrasyonlarda ilaç ekleyin (IC20-IC50). Hücreleri tohumve kuluçka (37 °C, 5% CO2) sonraki geçişe kadar.
- Araç kontrol grubundaki her çoğaltma için kitaplık kapsamı için gereken hücre sayısını ayrı ayrı birleştirin. İlaçla aynı hacmi kullanarak araç kontrolünü ekleyin (<%0.5 v/v). Hücreleri tohumve kuluçka (37 °C, 5% CO2) sonraki geçide kadar.
- Her pasajda ilaç veya araç ferahlatıcı iken, her adım 5.3.5 açıklandığı gibi genomik DNA için hücre pelet leri her 3 günde bir hücreleri geçiş ve hasat devam edin.
- Pozitif seçim veya ilaç direnci ekranları için, her çoğaltma grubunu kitaplık kapsamı için gereken hücre sayısına göre bölün. Her çoğaltmak IC90 ilaç konsantrasyonları ekleyin. IC90'dahücrelerin çoğu öldürülecek. Genomik DNA çıkarma için dirençli popülasyonların büyümesine ve hücre peletlerinin (1-2 x 107 hücre) toplanmasına izin verin.
6. CRISPR numune hazırlama ve sıralama
- Genomik DNA arınması
- Çözülmüş hücre peletlerini 5-10 dakika boyunca RT'de eritmek için kuluçkaya yatırın.
- Hücre peleti içeren 50 mL'lik santrifüj tüpüne 1,4 mL PBS ekleyin. Girdap 20 s hücreleri yeniden askıya almak ve 1 dakika dinlenmek için. Gerekirse, kalan hücre kümeleri kırmak için P1000 ile pipet 15x. Hücreleri 15 mL veya 1,5 mL'lik bir tüpten aktarıyorsanız, 1 mL PBS ile hücreleri yeniden askıya alın, ardından hücreleri 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve orijinal tüpü 400 μL PBS ile durulayın.
- Resuspended hücrelere 5 mL Çekirdek Lisis Çözeltisi ekleyin. 10 mL'lik pipet kullanarak, numuneyi 5 x yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın.
- Nükleer lysate'ye 32 μL RNase A (20 mg/mL; son konsantrasyonu elde etmek için 100 g/mL) ekleyin ve tüpü 5x ters çevirerek numuneyi karıştırın. Karışımı 37°C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın ve numunenin RT'de 10 dakika soğumasını bekleyin.
- 20 s. Küçük protein kümeleri karıştırıldıktan sonra görülebilir.
- RT'de 10 dk için 4.500 x g santrifüj.
- 10 mL'lik pipet kullanarak süpernatantı 5 mL izopropanol içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. DNA gözlemlenene kadar çözeltiyi 10x'i ters çevrilerek hafifçe karıştırın.
NOT: DNA, görünür bir kütle oluşturan beyaz, iplik benzeri iplikler olarak görülebilir. - 4.500 x g'de sentrifuge 5 dk RT'de DNA'yı peletlemek için.
- 10 mL'lik pipet kullanarak, süpernatantı dikkatlice çıkarın ve DNA peletini çıkarmaktan kaçının. DNA'ya RT'ye 5 mL %70 etanol ekleyin. Dna peletini ve santrifüj tüpünün kenarlarını yıkamak için tüpü yavaşça döndürün.
- RT 5 dakika için 4.500 x g centrifuge.
- 10 mL'lik pipet kullanarak% 70 etanol çıkarın ve DNA pelet inislodging kaçının. RT'de 10 dakika boyunca hava kurugenomik DNA.
- Tüpe 400 μL TE çözeltisi ekleyin ve 1 saat boyunca 65 °C'de kuluçkaya yatarak DNA'nın erimesine izin verin. DNA tamamen çözünmezse, tüpü 65 °C'de 1 saat ek olarak inkübüne, tüpü 15 dakikada bir hafifçe hareket ettirin ve gece boyunca 4 °C'de bırakın.
- RT'de 1 dakika için 4.500 x g'de santrifüj ve genomik DNA'yı 1,5 mL düşük bağlayıcı bir tüpe aktarın.
- Genomik DNA'nın saflığını hem spektrofotometrede (toplam nükleik asit içeriği için) hem de florometrede (çift iplikçikli DNA içeriği için) ölçün ve ölçün.
- İsteğe bağlı olarak, aşağıdaki gibi sgRNA downstream PCR amplifikasyon ile ilgili sorunlar varsa genomik DNA çökelti.
- 400 μL genomik DNA'yı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın.
- 18 μL 5 M NaCl (0,2 M son konsantrasyon) ve 900 μL%95 etanol ekleyin.
- Tüp 10x iyice karıştırılır kadar ters tüp, sonra 16.000 x g 10 dakika RT için santrifüj.
- Dikkatle supernatant çıkarın ve DNA pelet islodging kaçının. DNA peletini %70 etanol500 μL ile yıkayın. DNA peletini yıkamak için tüpü yavaşça döndürün.
- CENTRIFUGE 16.000 x g 5 dk RT için.
- Dikkatle supernatant kaldırmak ve DNA pelet sökme kaçının. RT'de 10 dakika boyunca hava kurugenomik DNA.
- 6.1.12 adımlarında açıklandığı gibi DNA'yı eritmek için 300 μL TE ekleyin.
- Adım 6.1.14'te açıklandığı gibi genomik DNA'nın saflığını ölçün ve ölçün.
- CRISPR sıralama kitaplığı hazırlama
- Toplam 100 μg genomik DNA kullanarak Tablo 5'te belirtildiği gibi PCR 1'i ayarlayın. 50 μL reaksiyon başına 3,5 g genomik DNA ekleyin ve istenilen kapsama alanını elde etmek için aynı 50 μL reaksiyonları ayarlayın. Tablo 6, LCV2 amplifikasyon için astar dizileri örneklerini listeler::TKOv3 sıralama kitaplıkları. Tablo 7 pLCKO2 amplifikasyon için astar dizileri örnekleri listeler::TKOv3 sıralama kütüphaneleri.
- Tablo 8'deözetlenen programı kullanarak bir termocycler PCR 1 reaksiyonlarını artırın.
- PCR ürününün 2 μL'sini %1 agarose jel üzerinde çalıştırarak PCR 1 amplifikasyonu kontrol edin. PCR 1 600 bp'lik bir ürün verir.
- Her genomik DNA örneği için tüm bireysel 50 μL reaksiyonları bir araya ve girdap ile karıştırın.
- Tablo 9'da özetlenen her örnek için bir PCR 2 reaksiyonu (50°L) ayarlayın ve havuzlu PCR 1 ürününün 5 μL'sini şablon olarak kullanarak. Kitaplık örneklerinin birleştirilmesine izin vermek için her bir örnek için benzersiz dizin astar kombinasyonları kullanın.
- Tablo 10'daözetlenen programı kullanarak bir termocycler PCR 2 reaksiyonu yükseltmek.
- Bir jel döküm önce 10 dakika için 0,1 N HCl ile güçlendirilmiş ürünleri arındırmak için agarose jel ekipman temizleyin. PCR 2 güçlendirilmiş ürünleri arındırmak için DNA lekesi içeren %2'lik agarose jel hazırlayın.
- PCR 2 ürününü %2'lik agarose jelüzerinde düşük voltajda (1,0-1,5 saat çalıştırın) çalıştırın. PCR 2 200 bp'lik bir ürün verir.
- PCR ürünlerini mavi ışık transilluminator üzerinde görselleştirin. 200 bp bandı çıkarmak ve bir jel çıkarma kiti kullanarak agarose jel dilim DNA arındırMak. Sıralama kitaplığı saflığını hem spektrofotometre hem de florometrede ölçün ve ölçün.
NOT: Tipik bir jel-saflaştırılmış sıralama kütüphanesi konsantrasyonu 5-10 ng/μL arasında değişmekte ve toplam verim 150-300 ng arasında değişmektedir.
- Yüksek iş ortası sıralaması
- CRISPR dizilimini yeni nesil sıralayıcılarda sıralayın.
- 400-500 kat kitaplık kapsama daha yüksek okuma derinliğinde sırareferans T0 örnekleri. En az 200 kat okuma derinliğinde açılan ekranlar için deneysel zaman noktası örneklerini sıralayın. Güçlü pozitif seçim ekranları için, zenginleştirilmiş sgRNA'ların tanımlanması için en az 50 kat kapsama alanı okuma derinliği yeterlidir.
NOT: Belirli bir ekran için kitaplık gösterimini belirlemek ve zaman içinde sgRNA kıvrım değişikliklerini belirlemek için bir referans olarak hizmet vermek için T0 örneğini sıralamak önemlidir.
7. Veri analizi
- Sırayı eşlemek için Bowtie gibi programları kullanarak sırayı hizalayın aşağıdaki parametreleri kullanarak başvuru kitaplığına okur: -v2 (iki uyuşmazlık lara izin verir) ve -m1 (kitaplıkta birden fazla sıraya eşlenen herhangi bir okumayı atmak).
- Belirli bir örnek için her bir sgRNA için örnek başına 10 milyon okuma için benzersiz eşlenen okuma sayısını aşağıdaki gibi normalleştirin:
107 000
- T0 örneğine (Tn/T0) kıyasla her zaman noktasında (Tn) her çoğaltma için her sgRNA'nın log2 kat değişimini hesaplayın. Sıfırlardan süreksizlikleri önlemek için tüm okuma sayımlarına 0,5 okuma sahtesini ekleyin. Kat değiştirme hesaplamasından ve akış aşağı analizinden T0 örneğinde <30 ham okuma içeren SGRNA'ları hariç titibarıyla hariç t.c.
- Gen Özgünlük Bayes analizi (BAGEL) algoritması
- BF puanlarını kullanarak ekran performansı değerlendirmesi için hassasiyeti ve geri çağırmayı hesaplayın. Python için Scikit-learn kitaplığı'nın precision_recall_curve işlevi için yukarıdaki BF puan alt kümesiyle birlikte 7.4 adımdaki temel seti kullanın. Alternatif olarak, R'deki PRROC paketini kullanarak aynı şeyi gerçekleştirin.
- Her gen için tüm kılavuzların ortalama kıvrım değişimini hesaplayın. R veya eşdeğer yazılımda temel ve gerekli olmayan genler için yoğunluk çizimleri oluşturun (bkz. adım 7.4). R'de, x.ess temel genlerin günlük kıvrım değişim değerlerini içeren bir vektörse ve x.nonEss gerekli olmayan genler içeriyorsa, aşağıdaki komutu kullanarak çizim yapın:
plot( yoğunluk( x.ess), xlab="ortalama logFC",col="red",lwd=2 )
çizgiler ( yoğunluk( x.nonEss), col="mavi",lwd=2 )
NOT: Python sürüm detayları ve kullanılan paketler için bkz: scikit-learn v0.19.1: (Pedregosa ve ark.21tarafından yayımlandı).
107 000
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom ölçeğinde CRISPR tarama iş akışına genel bakış
Şekil 1, tek entegrasyon olayları ve yeterli kütüphane gösterimi (genellikle 200- 1000) sağlamak için düşük bir MOI CRISPR kütüphane lentivirus ile hedef hücrelerin enfeksiyonu ile başlayan, havuzlu CRISPR tarama iş akışı genel bir bakış göstermektedir -katlayın). Enfeksiyon dan sonra, hücreler transduced hücreler için seçmek için antibiyotik puromisin ile tedavi edilir. Seçimden sonra, taramanın başlangıcında kitaplık dağılımını değerlendirmek için bir temel T0 hücre peleti toplanır. Genetik tedirginliklerin heterojen bir popülasyonundan oluşan kalan hücreler, gen düzenlemesi ve ortaya çıkan etkilerin ortaya çıkması için 15-20 katlama için her 3-4 günde bir istenilen kütüphane gösteriminde geçirilir. İlaç tedavileri ile ekranlar genellikle t3 veya T6 hücreleri virüs enfeksiyonu ve puromisin seçimi kurtarıldı sonra eklenir. Hücreler genomik DNA için her pasajda istenilen kütüphane gösteriminde hasat edilir, istenilen zaman noktalarında yeni nesil sıralama ile kılavuz bolluğunu belirlemek için.
Akış aşağı sıralama kitaplığı hazırlama adımlarında oluşabilecek herhangi bir hata durumunda birden çok örnek toplanması önerilir. Havuzlu ekranlar genellikle temel sgRNA'ların pozitif veya negatif seçimi için tasarlanmış canlılık temelli tahlillerdir. Pozitif ekranlar, belirli bir seçim basıncı altında direnç gösteren veya sağkalımı artıran genleri tanımlar (örn. ilaçlar veya mutant hücre hattı). Bu durumda, çoğu hücre seçiminden ölecek ve kalan hücreler, test edilen ilaç veya duruma dirençli genleri hedef alan sgRNA'lar için zenginleştirilmiş olacaktır. Negatif seçim ekranları veya "bırakma" ekranları, ekran seçim basıncı altında daha fazla duyarlılık veya sağkalım kaybına sahip gen nakavtlarını tanımlar. Büyüme kusuru gibi henotypik etkiye sahip tedirginlikleri belirlemek için, her zaman noktasında rehber bolluğu yeni nesil sıralama ile ölçülür ve ekran boyunca kılavuzların açılır veya zenginleştirilmesini değerlendirmek için T0 ile karşılaştırılır. Analiz platformları kullanılarak kılavuzlar için günlük kıvrım değişiklikleri ölçülür ve gen isabetlerinin derecesini sağlamak için SIMEL gibi algoritmalar uygulanabilir.
Havuzlu CRISPR ekranlarda kütüphane temsilinin kütüphane amplifikasyonu ve bakımı
Şekil 2, plazmid kitaplığın amplifikasyonundan sonra kılavuzların beklenen dağılımını göstermektedir. TKOv3 kütüphanesi 71.090 sgRNA'dan oluşur ve gen başına dört sgRNA içerir ve ~18.000 protein kodlama geni10'uhedeflemektedir. İdeal bir kütüphane de her bir sgRNA benzer miktarlarda temsil edilmelidir. Bu nedenle, güçlendirilmiş kitaplıktaki kılavuzların dağıtımını yeni nesil sıralama ile onaylamaları önerilir. Burada gösterilen sgRNA'ların çok sıkı dağılımına sahip güçlendirilmiş bir kütüphanedir ve tüm sgRNA'ların %95'inin 4 kat dağılım aralığında olduğunu doğrular (Şekil 2). SGRNA'ların daha geniş bir dağılımı, kütüphane kılavuzlarının bolluğunun eşit olarak temsil edilemediğini ve havuzlu ekranlardaki gürültüye katkıda bulunabileceğini gösterir.
Ekran performansının değerlendirilmesi
Şekil 3, bir ekranın performans kalitesinin, tüm sgRNA'nın temel (684 gen) ve gereksiz genlerin (926 gen) altın standart referans listesine göre kat değişim dağılımının değerlendirilerek değerlendirilebileceğini ve hassas geri çağırma eğrileri10. Altın standart referans setleri kullanılarak, Bayes Factor (BF) puanları ekran bitiş noktası için hesaplanır ve hassas geri çağırma eğrileri çizilir. BF puanları, bilinen temel ve gerekli olmayan kılavuz kümelerinin dağılımlarını karşılaştırmak için Bayesçerçevesi (daha önce19açıklanan BAGEL algoritması) kullanılarak bir geni hedefleyen tüm kılavuzların günlük kıvrım değişikliği analiz edilerek hesaplanır. Yanlış bulma oranları (FDR), aynı altın standart referans kümeleri kullanılarak ampirik olarak türetilmiştir. Yüksek performanslı bir ekran, çoğu eğride keskin bir "dirsek" ve Şekil 3A'daki mavi çizgide gösterildiği gibi terminal noktasına doğru düz bir çizgi ile kanıtgörüldüğü üzere, BF >6 ve FDR <%5 eşiğinde çok sayıda temel geni kurtarmalıdır. Temel ve gereksiz genleri hedefleyen kılavuzların okulu bırakması da incelenmelidir (Şekil 3B). Referans gereksiz genleri hedefleyen kılavuzlar, Şekil 3B'dekikesik çizgide gösterildiği gibi, sıfır da ortalanmış günlük kıvrım değişikliklerinin büyük ölçüde simetrik dağılımını göstermelidir. Temel genleri hedefleyen kılavuzların kıvrım değişimi dağılımı, Şekil 3B'dekikatı çizgide gösterildiği gibi, gereksiz genleri hedefleyen kılavuzların dağılımına göre güçlü bir negatif kayma göstermektedir.
Temel genler
Havuzlu genom çapındaki açılır ekranların temel uygulamalarından biri temel genleri belirlemektir. Temel genler, fitness genlerinin bir alt kategorisi, olan pertürbasyon hücre öldürücüneden olan genler, aynı zamanda gevşek çoğalma genleri olarak kabul edilir. Kanser biyolojisi bağlamında, belirli bir tümör hücre hattı için bağımlılıkları belirlemek için bağlam-özel temel belirlemek mümkündür. Şekil 4,BAGEL algoritmasından elde edilen Bayes Factor skorları kullanılarak temel genlerin gen sıralamasını gösterir. Bayes Factor (BF), gen nakavtın bir fitness kusuruyla sonuçlansın bir güven ölçüsüdür. Daha olumlu skorlar, tedirginlik fitness bir azalmaya neden olduğu daha yüksek güven gösterir.
Pozitif seçim ekranı
Genom çapında nakavt havuzları bastırıcı / direnç genleri aramak için aşırı ilaç ajan varlığında kültürlü olabilir. Burada gösterilen HCT116 hücreleri G1/S tutuklama3bastırıcılar aramak için timidin varlığında taranır bir örnektir. Bu ekranın ayrıntıları bir önceki yayında bulunabilir3. Kısaca, CRISPR kütüphane enfekte hücrelerin seçiminden 6 gün sonra, hücreler kütüphane kapsama korumak çoğaltmalar bölündü ve timidin ile tedavi edildi. Genomik DNA örneklemesi için yeterli dirençli hücre bulununcaya kadar hücreler ilaç varlığında geçirildi. Pozitif seçimler negatif ekranlara göre daha düşük kapsama alanı içinde sıralanabilir (okuma derinliği), kılavuzların yalnızca küçük bir kısmı güçlü seçici basınç nedeniyle kalacaktır. Bu örnekte, birkaç milyon okuma ile sıralama elde edilmiş ve timidin kizazını (TK1) hedefleyen 12 sgRNA'dan 11'i kurtarıldı ve beklendiği gibi zenginleştirildi(Şekil 5).
| Tutarlar 1:1:1 molar oranına göre belirlendi | ||
| Bileşen | 15 cm plaka başına miktar bir | |
| LCV2::TKOv3 | pLCKO2::TKOv3 | |
| psPAX2 | 4.8 g | 7.0 g |
| pMD2.G | 3,8 g | 4.0 g |
| TKOv3b | 8.0 g | 5.0 g |
| bir TKO kütüphanesi için 1:1:1 molar oranında en verimli plazmid kombinasyonuna göre belirlenen tutarlar | ||
| b CRISPR kütüphane vektör omurgasını temel alan miktar TKO plazmid. LCV2 hepsi bir arada vektör =13 kb, Cas9 pLCKO2 vektör = 7,6 kb | ||
Tablo 1: TKOv3 transfeksiyonu için önerilen plazmid miktarı.
| Bileşen | 15 cm plaka başına miktar |
| Opti-MEM | 800 μL |
| Transfeksiyon reaktifi | 48 μL |
Tablo 2: Lipid bazlı transfeksiyon reaktif kurulumu.
| Kat kapsamı | sgRNAb başına hücre sayısı | Enfeksiyon için gerekli hücre sayısıb |
| (sgRNA kütüphane boyutubir × kat kapsama) | (sgRNA kütüphane boyutu × kat kapsama ÷ 0.3 MOI) | |
| 200 | 1,5 x 107 | 5 x 107 |
| 500 | 3,6 x 107 | 1.2 x 108 |
| 1000 | 7.1 x 107 | 2,4 x 108 |
| bir TKOv3 kütüphane büyüklüğüne göre = 71.090 sgRNA | ||
| b Sayılar yuvarlanır | ||
Tablo 3: TKOv3 CRISPR kitaplık enfeksiyonu ve hücre kaplaması için gerekli hücre sayılarının çeşitli kat kapsama alanı olarak belirlenmesi.
| Tedavi | Enfeksiyon için gerekli plaka sayısı | |
| Tarama plakaları | Virüs, + puromisin | (sgRNA kütüphane boyutu × 200 kat) ÷ 0.3 MOI ÷ enfeksiyon da hücre tohumlama yoğunluğu = plaka sayısı gereklibir |
| Kontrol 1 | Hayır virüs, + puromisin (%0 sağkalım kontrolü) | 1 |
| Kontrol 2 | Virüs, + Hayır puromisin (%100 sağkalım kontrolü) | 1 |
| a MOI dalgalanmaları ve büyüme oranları karşılamak için ekstra plakalar dahil | ||
Tablo 4: Enfeksiyon kurulumu için hesaplama.
| Reaktif | 1x reaksiyon başına miktar |
| 2x Master Mix | 25 μL |
| 10 mM PCR 1 LCV2 ileri astar | 2,5 μL |
| 10 mM PCR 1 LCV2 ters astar | 2,5 μL |
| Genomik DNA | 3,5 g |
| Su | 50 μL'ye kadar |
| Toplam | 50 μL |
Tablo 5: PCR 1 kurulumu.
Tablo 6: LCV2 amplifikasyon için PCR astar::TKOv3 sıralama kütüphaneleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 7: pLCKO2 amplifikasyon için PCR astar::TKOv3 sıralama kütüphaneleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Adım | Sıcaklık | Zaman | |
| 1 | 98°C | 30 sn | |
| 2 | 98°C | 10 sn | 25 döngü (adım 2 – 4) |
| 3 | 66°C | 30 sn | |
| 4 | 72°C | 15 sn | |
| 5 | 72°C | 2 dk | |
| 6 | 10°C | Tutun |
Tablo 8: PCR 1 çevrim parametreleri.
| Reaktif | 1x reaksiyon başına miktar |
| 2x Master Mix | 25 μL |
| 10 mM i5 ileri astar | 2,5 μL |
| 10 mM i7 ters astar | 2,5 μL |
| PCR 1 ürün | 5 μL |
| Su | 15 μL |
| Toplam | 50 μL |
Tablo 9: PCR 2 kurulumu.
| Adım | Sıcaklık | Zaman | |
| 1 | 98°C | 30 sn | |
| 2 | 98°C | 10 sn | 10 döngü (adım 2 – 4) |
| 3 | 55°C | 30 sn | |
| 4 | 65°C | 15 sn | |
| 5 | 65°C | 5 dk | |
| 6 | 10°C | Tutun |
Tablo 10: PCR 2 çevrim parametreleri.
Ek tablo S1. TKO referans gen setleri Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 1: Havuzlu tarama iş akışına şematik genel bakış. (A) Hedef hücre popülasyonu, çoğu hücrenin bir viral tümleştirme aldığından ve kitaplık gösteriminin korunmasını sağlamak için düşük MOI'de CRISPR kitaplık lentivirüs ile enfekte olur. Farklı renkler her viral parçacık farklı sgRNA temsil eder. Genetiği değiştirilmiş hücre havuzları seçilir. Seçim tamamlandıktan sonra, hücreler T0 referansı için örneklenir ve seri olarak geçitlenir. (B) T0'dan sonraki ilk geçişte hücreler enfeksiyondan kurtulmuş ve gerekirse ilaç tedavileri eklenebilir. Tedaviden sonra hücre popülasyonları birkaç hafta boyunca seri olarak geçişe geçilir. Her pasaj sırasında hücreler genomik DNA için toplanır ve sgRNA kütüphanesinin gerekli kat kapsama alanına yeniden tohumlanır. (C) İki tip ekran yapılabilir: 1) belirli seçim basıncı altında direnç gösteren veya sağkalımda artış gösteren mutant hücreleri tanımlayan pozitif seçim ekranları (örn. uyuşturucu veya mutant hücre hattı), ekran; veya 2) ekran sırasında kaybolacağı için ekran seçim basıncı altında artan duyarlılık veya hayatta kalma kaybı ile mutant hücreleri tanımlamak negatif seçim ekranları. (D) Genomik DNA hasat edilir ve PCR-kılavuz bölgeler için zenginleştirmek için amplifiye. (E) Kılavuz bolluğu yeni nesil sıralama ile ölçülür ve zenginleştirilmiş, ya da tükenmiş kılavuzları "vurmak" tanımlama için belirlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Amplifiye CRISPR sgRNA kütüphanesinin kalitesi. Güçlendirilmiş kütüphane plazmidleri yeni nesil sıralama ile analiz edilir (önerilen okumalar: 30 milyon okuma, kütüphanenin ~400 kat temsiline karşılık gelir). Burada gösterilen 4 kat dağıtım aralığında tüm sgRNA'ların %>95'ine sahip, sgRNA'ların sıkı dağılımına sahip bir kütüphanedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Altın standart temel gen referans setleri kullanılarak açılan ekran kalitesinin değerlendirilmesi. (A) BF >6 ve FDR%5 eşiğinde temel genlerin kurtarılmasında tarama sonuçlarının hassas geri çağırma analizi. Yüksek performanslı ekran mavi çizgi ile temsil edilir ve düşük performanslı ekranlar kırmızı çizgi ile temsil edilir. (B) Temel genleri (solid line) ve gereksiz olmayan genleri (noktalı çizgiler) hedefleyen sgRNA dağılımını katlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Gen özgünlük lerinin belirlenmesi. Bayes Factor belirli bir ekranda gen sıralaması. Bayes Factor (BF), gen nakavtın bir fitness kusuruyla sonuçlansın bir güven ölçüsüdür. Yüksek Bayes Faktörler gen nakavt fitness defekti sonuçları artan güven gösterir, (kırmızı noktalar). Düşük Bayes Factor puanları nakavt büyüme avantajı (mavi nokta) sağlar öneririz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: HCT116 hücrelerinde timidin bloğunun bastırıcısı için pozitif seçim ekranı. T0'daki tüm sgRNA'lar için normalleştirilmiş okuma sayıları ortalama normalleştirilmiş okuma sayımları timinin tedavi edilen numuneler için. Pozitif seçim ekranları için (yani, ilaç bir IC90 konsantrasyonu kullanarak), ilaca direnç verecek tedirginlik sayısı nın küçük olması bekleniyor. Bu nedenle, okuma derinliği negatif ekranlar için gerekenden daha düşük olabilir, whch kütüphanenin en temsil edilmesi bekleniyor. TK1 sgRNA'ları kırmızı daire içine alınır. Bu rakam önceki bir yayından değiştirilmiştir3. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kullanım kolaylığı ve yüksek esnekliği sayesinde CRISPR teknolojisi hassas genom düzenleme için tercih edilen bir araç olarak yaygın olarak benimsenmiştir. Havuzlu CRISPR taraması, tek bir deneyde binlerce genetik tedirginliği sorgulamak için bir yöntem sağlar. Havuzlu ekranlarda, sgRNA kitaplıkları moleküler barkod görevi görehizmet eder, çünkü her dizi benzersizdir ve hedeflenen genle eşlenir. Genomik DNA'nın hücre popülasyonundan izole edilmesiyle, ilgi fenotipine neden olan genler, sgRNA bolluğunun yeni nesil dizileme ile ölçülmesi ile belirlenebilir. Örneklerdeki sgRNA'ları ölçmek için kitlesel paralel sıralama yöntemleri kullanılır, yani birden fazla bağımsız hücre popülasyonu maliyeti en aza indirmek için aynı sıralama şeridinde biraraya getirilebilir.
Büyük ölçekli bir tarama projesine başlamadan önce, iyi karakterize edilmiş ve teknik olarak optimize edilmiş bir modele sahip olmak önemlidir. Genetik arka plan, büyüme hızı ve transdüksiyon verimliliği tarama için hücre hatları seçerken önemli faktörlerdir. Örneğin, büyüme oranları ve düzenleme verimliliği modelin ölçeklenebilirliğini ve teknik uygunluğunu belirleyecektir. Büyük sgRNA kitaplıklarını yeterince temsil edebilmek için, on milyonlarca hücre gereklidir, bu nedenle hücre sayısı, daha yavaş iki katına sahip hücre hatları veya iyi proliferatif kapasiteye sahip olmayan hücreler için fizibilite taramasında sınırlayıcı bir faktör olabilir (örn. birincil hücreler). Büyüme oranlarına bağlı olarak, tarama için hücre tohumlama yoğunluğu ve plaka büyüklüğü gibi hücre kültürü koşulları buna göre seçilmelidir. Bu ekran için pratik ve teknik olarak uygulanabilir en büyük damar kültür hücrelerine tavsiye edilir.
Lentivirus transdüksiyon verimliliği hücre tipleri arasında farklılık gösterir, çünkü hücreler doğal enfektelik te sayılsa. Sonuç olarak, bir hücre tipinde yeterli enfeksiyon elde etmek için gerekli virüs hacmi mutlaka başka bir aynı olmayacaktır. Bu nedenle, hücre hattında üretilen lentivirus kitaplığın her bir partisinin, kütüphanenin yeterli kapsama alanını ve hücre başına çoğunlukla tek transdüksiyon olaylarını 0,3 civarında daha düşük MOI'lere aktararak taranması işlevsel olarak önemlidir (bölüm 4). Transdüksiyon verimliliği de hücre kültürü koşullarından etkilenebilir; bu nedenle, fonksiyonel titreler ekranda kullanılacak aynı hücre koşulları kullanılarak belirlenmelidir. Yani, aynı doku kültürü damarları, medya bileşenleri ve hacim, hücre kaplama yoğunluğu ve virüs preps önceden çözülme olmadan kullanmak önemlidir. Farklı biçimlerde veya koşullarda yapılan ölçümler, tarama biçimine güvenilir bir şekilde ölçeklendirilmeyecektir.
LCV2::TKOv3 gibi hepsi bir arada CRISPR-Cas9 kılavuz kitaplıklarını kullanmanın avantajına rağmen, Cas9'u kodlayan gen oldukça büyüktür ve bu da viral partiküllere (105-106 TU/mL) verimli bir şekilde paketlemi zorlaştırır. Daha düşük lentiviral titreler teslim etmek, transduce zor hücre hatları için bir sınırlama olabilir, onlar all-one-CRISPR kütüphaneleri ile daha da zorluk olacak gibi. Bunu azaltmak için Cas9 hücre hattında önceden ifade edilmeli ve ardından sadece sgRNA içeren CRISPR kütüphanelerinin teslimi (örneğin, pLCKO2::TKOv3), çok daha yüksek titrelerde (107-108 TU/mL) yapılabilir. Bir hücre hattının ploidi de önemlidir, bu değiştirilmesi gereken hedef loci sayısını belirler gibi. Haploid hücrelerde tam nakavt üretme yeteneği, belirli bir genin birden fazla kopyasına sahip hücrelere göre daha etkilidir. Bu nedenle, haploid hücrelerde ekranlar daha duyarlı olabilir ve diploid veya aneuploid hücre hatları nda gerçekleştirilen ekranlar daha yüksek kaliteli veri verim6. Fenotip ile bağlantılı bilinen genlerin test edilmesi, hücre hattı modelinin ekran yeteneğini belirlemeye yardımcı olacaktır. Örneğin, özgünlük ekranları için, 26S proteozom, PSMD1 (Addgene: plazmid #74180) bir alt birimini hedefleyen kılavuzlar, PSMD1'in tedirginliği olarak hücre hatlarının düzenleme verimliliğini ve enfektibiliyesini test etmek için kullanılabilir. hücre ölümüyle sonuçlanır.
Havuzlu ekranların sağlamlığı sgRNA gösterimine bağlıdır. Bu, ekran sırasında kitaplık performansını ve isabetleri tanımlama yeteneğini belirleyen önemli bir ölçümdür. Kütüphane çeşitliliği her sgRNA temsilönyargılı; bu nedenle, taranacak ve analiz edilecek hücrelerin popülasyonu yeterince az temsil edilen sgRNA'ların yakalanmasını sağlamak için yeterince büyük olmalıdır6. Her sgRNA 200- 1000 kat temsil i (yani, sgRNA başına 200-1000 hücreleri)10,15yayınlanan ekranlarda kullanılan tipik bir kapsama alanıdır. Bu gösterim, kütüphane plazmidini (bölüm 1) ve ekran boyunca istenilen kitaplık kapsamını temsil etmek için gerekli hücre numarasını (bölüm 5) enfekte edip geçirerek ve kitaplık sıralama sırasında yükseltilirken sağlanmalıdır. hazırlık (protokol 6), protokol boyunca açıklandığı gibi. Örneğin, TKOv3 kitaplığı ~ 200 kat kapsama elde etmek için seçim ve 15 milyon enfekte hücrelerin passaging gerektirir. Sıralama sırasında, diploid bir insan genomunun genom başına ~7.2 pg ve 1 sgRNA içerdiğini varsayarsak, 15 milyon dizi okumaiçin sıralama kitaplığını oluşturmak için toplam 100 μg genomik DNA gerekir. Kapsama alanının kararı kitaplığın boyutuna bağlıdır, çünkü daha büyük kitaplıkların kapsamı, teknik olarak pratik olmayan, bakımı zor olan daha fazla sayıda hücrenin kültüre alınmasını gerektirecektir. TKOv3 kütüphanelerinde en az 200 kat kapsama alanı tavsiye edilir, çünkü 200 kat çok sayıda hücrenin taranması ve sınırlı sayıda gerçek biyolojik sgRNA çıkışlarını tespit etmek için yeterli dinamik aralığın korunması arasında optimum bir denge sağlar rasgele tükenmeleri gürültü22,23. Daha yüksek kat kitaplık gösterimleri daha iyi tekrarlanabilirlik neden olur ve sgRNA bolluk değişiklikleri algılamak için yeterli pencere sağlamak, özellikle negatif seçimler için. Negatif ekranların sınırlayıcı bir özelliği, tedirginliğin yalnızca başlangıç kitaplığı24'temevcut olduğu ölçüde tükenmiş olmasıdır. Buna karşılık, pozitif seçim ekranlarının dinamik aralığı çok daha büyüktür, çünkü hücrelerin zenginleşmesine güvenirler ve son popülasyonun %100'ünü zenginleştirebilir23. Bu nedenle, pozitif seçim ekranları için (örneğin ilaç direnci ekranları), kütüphane kapsamı ve okuma derinliği sadece küçük bir hücre popülasyonunhayatta kalması beklendiği için 50 ila 100 kat temsil indirilebilir.
Burada açıklanan sıralama kitaplık protokolü, hem vektör omurgalarında hem TKOv3 CRISPR kitaplıkları için optimize edilmiş ve Illumina sıralama platformunda sıralanmış iki aşamalı bir PCR'dir. Bu sıralama kitaplıkları, Hart ve ark.3'teaçıklanana benzer tek bir PCR protokolü kullanılarak da oluşturulabilir. Diğer hazır kütüphaneler için, bu kütüphaneler için sağlanan astar ve sıralama protokollerine başvurulmalıdır. Genomik DNA ve PCR numuneleri hazırlanırken kontaminasyon önlemlerinin dikkate alınması esastır. Örneğin, genomik DNA arınması için özel bir alan şiddetle tavsiye edilir. Ayrıca genomik DNA örneklerinde bulunan ortak kirleticiler olan bakteriyel plazmid preps, fiziksel olarak farklı olmalıdır. PCR reaksiyonları özel bir PCR başlık kurulmalıdır, Bu plazmidler ve diğer sıralama kütüphaneleri kirlenmeyi en aza indirecektir gibi. İyi bir uygulama için, PCR kontaminasyonunu izlemeye yardımcı olmak için şablonsuz negatif denetim eklenebilir.
Bu veri kümelerinin boyutu ve çeşitliliği göz önüne alındığında, ekranlardan sıralama okumalarını çevirmek için veri analizi önemsiz olmayan bir görevdir. Sıra okumalar hizalandıktan ve normalleştirildikten sonra, ekran performansını değerlendirmeye yardımcı olmak için çeşitli biyoinformatik araçlar mevcuttur (Şekil 3) ve isabet tanımlaması(Şekil 4). BAGEL bu protokolde veri analizi için anahtar araç olarak tanımlanmıştır. BAGEL, bilinen temel ve temel olmayan gen kümelerinin dağılımlarını bir geni hedefleyen tüm kılavuzların oturum kıvrımı değişimiyle karşılaştırmak için Bayes çerçevesini kullanır. Bu yöntem Hart ve ark3ayrıntılı olarak açıklanmıştır. BAGEL'e ek olarak, MAGeCK25 gibi zenginleştirilmiş ve tükenmiş SGRNA'ları tanımlamak için tasarlanmış diğer algoritmalar da kullanılabilir. İlaç ekranları için, hem sinerjik hem de bastırıcı kimyasal genetik etkileşimleri belirlemek için DrugZ algoritmasının kullanılması önerilir. DrugZ aynı zaman noktasında bir tedavi edilmemiş nüfussgRNA göreli bolluğu ile tedavi edilen bir popülasyonda sgRNA göreli bolluk karşılaştırmak için tasarlanmıştır20.
CRISPR ekranların bir sınırlama cas9 her zaman bir knock-out yol açmaz, her zaman oluşturulan indels in-frame mutasyonlar olduğunu olasılığı olduğu gibi, gen fonksiyonu bozulmadan bırakarak13. Bu karışık bir nüfus, ekran "gürültülü" ve veri yorumlanması zor hale sonuçlanır. Bir geni hedefleyen birden fazla bağımsız sgRNA kullanmak, düşük aktivite ile sgRNA'ların etkisini azaltarak artıklık oluşturabilir. CRISPR çalışmalarına ek bir uyarı cas9 nükleaz tarafından oluşturulan çift iplikçik kırıkları etkisi, hedeflenen gen bağımsız hücresel öldürücülük yol açabilir. Bu anti-proliferatif etki hedef site kopya numarası ile artar, yüksek amplifikatör bölgeleri içinde genlerin yanlış pozitif tanımlama yol26. KOPYA numarası efektleri27'yidüzeltmek için CERES gibi hesaplama yöntemleri geliştirilmiştir. Bu iş akışları, knock-out tabanlı özgünlük ekranlarında gen bağımlılığı düzeylerini tahmin etmek için kopya numarası etkisini dikkate alır. Yükseltilmiş bölgelerde ki hit genlerin genomik konumlarının dikkatli bir şekilde incelenmesi, kesme etkilerinin çokluğu nedeniyle yanlış pozitif lerin belirlenmesine yardımcı olabilir13. Birincil ekranlar yalnızca olası isabetleri tanımlayabilir. Isabetleri doğrulamak ve hedefteki leri hedef dışı etkilerden ayırmak, yanlış pozitifleri saymak ve etkisiz tedirginlikler nedeniyle zayıf puan alan genlerin yanlış olarak geride bırakılmamasını sağlamak için ikincil bir ekran veya protokolle takip etmek önemlidir. negatifler23.
Bu protokol, çalışma durumunun hücrelerin çoğalması veya ölümüne yol açması gereken canlılık temelli tarama yaklaşımlarına odaklanmalıdır. Hücresel canlılıkta bir değişikliğe yol açmayan işlemler için, canlılık tabanlı havuzlu tarama yöntemi kısıtlayıcı olabilir. Alternatif olarak, muhabir veya işaretleyici bazlı tahliller ve floresan aktif hücre sıralama (FACS) yaklaşımları ile zenginleştirme kullanarak ekranlar gerçekleştirmektir. Marker tabanlı seçim ekranlarında, fenotip hücre sağlığı yerine marker gen ekspresyonunu düzenleyen mutasyonlara dayanır13,23. Dizili CRISPR biçimleri de iyi tarama başına bir gen için kullanılabilir. Dizili biçimler karmaşık veya mikroskopi tabanlı okuma çıkışlarına daha uygun. Ancak, dizili biçimler otomatik ekipman ve reaktifler büyük miktarda28gerektirir.
Burada tartışılan tarama protokolü, genetik ekranlar için en yaygın olarak kullanılan ve birçok kütüphanenin bulunduğu null alel oluşturmak için S. pyogenes Cas9 nükleazını kullanmaktadır (Addgene: Havuzlu Kütüphaneler). Knock-out kütüphaneler için alternatif seçenekler de mevcuttur, hangi bir katalitik ölü dCas9 kromatin değiştirici proteinlere bağlı kullanmak (CRISPRi) veya aktive (CRISPRa) genlerin transkripsiyonu. RNAi benzer, CRISPRi farklı gen dozlarında ve tam knock-out tahammül edemez temel genlerde meme etkileri çalışma yeteneği sunuyor, CRISPRa fonksiyon kazanım ekranları gerçekleştirmek için kullanılabilir iken. Bu teknolojilerin her birinin avantajları vardır, ancak genel olarak CRISPR nakavt yaklaşımı en gelişmiş yaklaşımdır. Bu düşük gürültü ile iyi performans kanıtlanmıştır, minimal off-hedef etkileri, ve deneysel tutarlılık, özellikle öldürücü tabanlı temel gen ekranları, ya CRISPRi ve shRNAS kullanarak knock-down yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında5. Bugüne kadar ki kapsamlı uygulanabilirliğine rağmen CRISPR tarama teknolojisi henüz erken aşamalarında dır. CRISPR'ın temel bileşenlerinden yeni araçlar üretilmeye devam edilmektedir. Bunlar arasında birden fazla genomik lokusu hedef leyabilen kombinatoryal gen düzenleme stratejileri, ortogonal Cas enzimlerinin optimizasyonu ve Cas9 aktivitelerini çeşitlendirmek için kromatin fonksiyonel etki alanlarıile yapılan değişiklikler yer almaktadır. CRISPR teknolojisi büyümeye devam ettikçe, genetik tarama yaklaşımlarına bağlı lığı genetikte fonksiyonel keşif için güçlü bir platform görevi görede olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.
Acknowledgments
Bu çalışma Genom Kanada, Ontario Araştırma Fonu ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (MOP-142375, PJT-148802) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) - non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
References
- Jiang, F., Doudna, J. A.
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
- Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
- Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
- Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
- Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
- Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
- Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
- Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
- Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , Available from: https://doi.org/10.1101/232736 (2017).
- Pedregosa, F. V., G,, et al.
- Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
- Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
- Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
- Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
- Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
- Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).
