رواية نيكوتيناميد الدينين الدينوكليوتيد طريقة تصحيح لقياس Ca2 + داخل الخلايا مع Fura-2-التناظرية في الخلايا الحية
Summary
ونظراً للتداخل الطيفي لموجات الإثارة والانبعاثات لنظائر NADH وfura-2، فإن تداخل الإشارة من كلتا الكيميائيتين في الخلايا الحية أمر لا مفر منه أثناء القياس الكمي [Ca2+]. وهكذا، تم تطوير طريقة تصحيح جديدة عبر الإنترنت لتداخل إشارة NADH لقياس [Ca2+] .
Abstract
ولقياس [Ca2+] كمياً، كثيراً ما تُستخدم النظائر fura-2، التي هي مركبات فلورية قياسية النسبية. ومع ذلك، فإن استخدام الصبغة محدود في جوهره في الخلايا الحية بسبب تداخل الفلورة الذاتية، وذلك أساسا من نيكوتيناميد الدينوكليوتيد (NADH). وبشكل أكثر تحديدا، وهذا هو عقبة رئيسية عند قياس الميتوكوندريا [كاليفورنيا2 +] كميا باستخدام النظير fura-2 لأن غالبية NADH في الميتوكوندريا. إذا كان تركيز صبغة الفلورسنت هو نفسه، يجب أن تنتج كثافة الإثارة معينة نفس كثافة الانبعاثات. ولذلك، ينبغي أن تكون نسبة كثافة الانبعاثات لاثنين من الأطوال الموجية المختلفة ثابتة. وبناء على هذا المبدأ، تم تطوير طريقة تصحيح جديدة على الإنترنت لتداخل إشارة NADH لقياس [Ca2+] ويمكن الحصول على كثافة الإشارة الحقيقية لNADH وfura-2. وعلاوة على ذلك، تم تطوير معادلة جديدة لحساب [Ca2+] مع الإثارة isosbestic أو الإثارة في 400 نانومتر. مع هذه الطريقة، يمكن قياس التغييرات في الميتوكوندريا [Ca2+] بنجاح. وبالإضافة إلى ذلك، مع مجموعة مختلفة من الإثارة والموجات الموجية للانبعاثات، يمكن قياس معلمات متعددة، بما في ذلك NADH، [Ca2+] وإمكانية وجود غشاء الميتوكوندريا(M)في وقت واحد. تم قياس الميتوكوندريا [Ca2+]وM أو الرقم الهيدروجيني باستخدام fura-2-FF وtetramethylrhodamine إيثيل إستر (TMRE) أو كاربوكسي-seminaphtorhodafluor-1 (كاربوكسي-SNARF-1).
Introduction
ومن المعروف على نطاق واسع الدور الهام للداخل الخلايا كاليفورنيا2 + 1. القياس الكمي لـ [Ca2+] ضروري لفهم عمليات الوظائف الفسيولوجية الخلوية. Fura-2 النظير مفيدة جدا لأنها متحمسة في نطاق الأشعة فوق البنفسجية (<400 نانومتر)، ويمكن تطبيق طريقة قياس النسب للقياس الكمي. لذلك، يمكن قياس المعلمات الفسيولوجية الأخرى مثل درجة الحموضة، وإمكانات الغشاء، وما إلى ذلك، مع الأصباغ الفلورية الأخرى. ويقال إن نطاق تركيز الميتوكوندرياCa2+ ([Ca2+]m)كان 0.08−20 μM2و3و4و5. بين fura-2 النظير، fura-2-FF هو مناسب لقياس هذا النطاق من [Ca2+]. ومع ذلك، تحتوي الخلايا الحية للأسف NADH / NADPH لعملياتها الأيضية، وNADH يولد تداخل إشارة بسبب الإثارة المتداخلة وأطياف الانبعاثات مع التناظرية fura-2. هذا التداخل يحد إلى حد كبير من استخدام النظير fura-2. على وجه التحديد، إذا تم تطبيق التناظرية لقياس الميتوكوندريا [كاليفورنيا2+] ، وهذا التدخل هو أكبر عقبة لأن أعلى كمية من NADH هو في الميتوكوندريا. ومما يزيد من تعقيد هذا الأمر التغيرات التي تحدثها NADH المرتبطة بإمكانية غشاء الميتوكوندريا(م)ويؤثر تغيير M [Ca2+] م6و7و8 , 9.وعلاوة على ذلك، لدراسة [Ca2+]م ديناميات، فمن الضروري أن نعرف حالة المعلمات الميتوكوندريا الأخرى، مثل NADH،م،والرقم الهيدروجيني.
الانبعاثات في 450 نانومتر و 500 نانومتر مع الإثارة في 353 نانومتر, 361 نانومتر, و 400 نانومتر تحتوي على إشارات من NADH وfura-2-FF, والمعادلات هي كما يلي. هنا, 353 نانومتر و 361 نانومتر هي النقاط isosbestic من fura-2-FF للانبعاثات في 450 نانومتر و500 نانومتر, على التوالي.
F361,450 = F361,450,NADH + F361,450,Fura Equation 1
F353,500 = F353,500,NADH + F353,500,Fura Equation 2
F400,500 = F400,500,NADH + F400,500,Fura Equation 3
حيث Fx,y هو كثافة الانبعاثات المقاسة في y-nm بواسطة x-nm الإثارة، Fx،y، NADH يمثل كثافة الانبعاثات المعتمدة على NADH نقية، وFx،y، Fura يمثل كثافة الانبعاثات النقية fura-2-FF-تعتمد على. تحت نفس التركيز من صبغة الفلورسنت، ينبغي أن تنتج كثافة الإثارة معينة نفس كثافة الانبعاثات. ولذلك، ينبغي أن تكون نسبة كثافة الانبعاثات لاثنين من الأطوال الموجية المختلفة ثابتة. Ca2+ وfura-2 لم يؤثر على خصائص الفلورة NADH; ولذلك، فإن نسبة الانبعاثات عند 450 نانومتر و500 نانومتر من NADH كانت ثابتة في أي موجة إثارة. ويمكن استخدام نفس القاعدة لfura-2-FF على أساس افتراض أن NADH أو [Ca2+] لا يؤثر على الأطياف الانبعاثات والإثارة من fura-2-FF. ومع ذلك، تسبب Ca2+ في تحول طيفي لانبعاث الفوا-2-FF. لذلك، لإزالة تأثير Ca2+، الإثارة isosbestic، وهو مستقل عن Ca2+، يحتاج إلى استخدامها. كل موجة الانبعاثات (أي، 450 نانومتر و 500 نانومتر) لديه نقطة isosbestic مختلفة، ومن الإعداد التجريبي لدينا، 353 نانومتر في 500 نانومتر و 361 نانومتر في 450 نانومتر تم اختيار. من هذه المعادلات التالية صالحة10.
Rf = F361,450,Fura/F353,500,Fura Equation 4
RN1 = F400,500,NADH/F361,450,NADH Equation 5
RN2 = F353,500,NADH/F361,450,NADH Equation 6
مع هذه الثوابت، المعادلات التالية من (المعادلة 1) (المعادلة 2) و (المعادلة 3) صالحة.
F361,450 = F361,450,NADH + Rf × F353,500,Fura Equation 7
F353,450 = RN2 × F361,450,NADH + F353,500,Fura Equation 8
F400,500 = RN1 × F361,450,NADH + F400,500,Fura Equation 9
من هذه المعادلات، إذا كان Rf،RN1،و RN2 معروفة، يمكن الحصول على إشارات نقية من NADH وfura-2 على النحو التالي.
F361,450,NADH = (F361,450 – Rf × F353,500)/(1− Rf × RN2)المعادلة 10
F353,500,Fura = (RN2 × F361,450 − F353,500)/(Rf × RN2 − 1) المعادلة 11
F400,500,Fura = F400,500 − RN1 × F361,450,NADH Equation 12
RFura = F353,500,Fura/F400,500,Fura Equation 13
كان شكل Ca2+من المنضم من fura-2-FF غير فلورسنت عمليا ً في الطول الموجي للإثارة 400 نانومتر. استناداً إلى هذه الخاصية، يمكن اشتقاق معادلة المعايرة الجديدة التالية.
[Ca2+] = Kd ∙ (F400,500,max/F353,500,max)× (RFura − Rmin)Equation 14
حيث Kd هو ثابت التفكك، F400،500، ماكس و F353،500، كحد أقصى هي القيم القصوى للإشارات المنبعثة في 500 نانومتر مع الإثارة في 400 نانومتر و 353 نانومتر، على التوالي، وRدقيقة هو الحد الأدنى RFura في كاليفورنيا2 +خالية من الشرط. بما أنّ الإثارة [إسوسبستيك] كان استعملت, المعادلة يستطيع كنت بسّطت أبعد [أس فولّووس].
[Ca2+] = Kd ∙ (1/ Rmin)∙ (RFura − Rmin)المعادلة 15
لذلك، يجب فقط قيمالحد الأدنى Kd و R لحساب [Ca2+].
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم تطوير طريقة تصحيح التداخل بنجاح لقياس إشارات NADH وfura-2 التناظرية. القياس الدقيق للإشارات ضروري للتصحيح الدقيق. ومع ذلك، فإن الطبيعة المتأصلة في جهاز الفلورسنت تنتج إشارة خلفية لا علاقة لها بإشارة NADH من fura-2. يمكن لفلتر تمرير النطاق الأعلى جودة تمرير ما يصل إلى 10−8 فقط من الأطوال …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل برنامج بحوث العلوم الأساسية من خلال المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) بتمويل من وزارة التعليم (2018R1A6A3A01011832)، من قبل وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي (NRF-2016M3C1A6936606) ومن قبل وزارة التجارة والصناعة والطاقة (10068076).
Materials
| 2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipment, 640±11nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590±15nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500±20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipment, 450±30nm |
| Calcium chloride solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
| DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Sigma-aldrich | D5030 | Chemicals |
| EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid | Sigma-aldrich | E4378 | Chemicals |
| FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Chemicals |
| field diaphragm | Nikon | 86506 | Equipment |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | chemicals |
| Green tube | DWM | test tube | |
| HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| High-speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipment, 50:50 |
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Equipment, 750±100nm |
| Oil immersion lens | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipment |
| Photon counter unit | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
| Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936 | Chemicals |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-aldrich | P4494 | Chemicals |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
| Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemicals |
| TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Molecular probes | T669 | Chemicals |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Miyata, H., et al. Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes. American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).
- Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).
- Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium. Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).
- Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).
- Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
- Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes. Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).
- Brandes, R., Bers, D. M. Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae. Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).
- Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).
- Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat. Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).
- Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
- Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism. Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).
- Page, E. Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology. American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).
- Page, E., McCallister, L. P., Power, B. Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
