Summary
ونظراً للتداخل الطيفي لموجات الإثارة والانبعاثات لنظائر NADH وfura-2، فإن تداخل الإشارة من كلتا الكيميائيتين في الخلايا الحية أمر لا مفر منه أثناء القياس الكمي [Ca2+]. وهكذا، تم تطوير طريقة تصحيح جديدة عبر الإنترنت لتداخل إشارة NADH لقياس [Ca2+] .
Abstract
ولقياس [Ca2+] كمياً، كثيراً ما تُستخدم النظائر fura-2، التي هي مركبات فلورية قياسية النسبية. ومع ذلك، فإن استخدام الصبغة محدود في جوهره في الخلايا الحية بسبب تداخل الفلورة الذاتية، وذلك أساسا من نيكوتيناميد الدينوكليوتيد (NADH). وبشكل أكثر تحديدا، وهذا هو عقبة رئيسية عند قياس الميتوكوندريا [كاليفورنيا2 +] كميا باستخدام النظير fura-2 لأن غالبية NADH في الميتوكوندريا. إذا كان تركيز صبغة الفلورسنت هو نفسه، يجب أن تنتج كثافة الإثارة معينة نفس كثافة الانبعاثات. ولذلك، ينبغي أن تكون نسبة كثافة الانبعاثات لاثنين من الأطوال الموجية المختلفة ثابتة. وبناء على هذا المبدأ، تم تطوير طريقة تصحيح جديدة على الإنترنت لتداخل إشارة NADH لقياس [Ca2+] ويمكن الحصول على كثافة الإشارة الحقيقية لNADH وfura-2. وعلاوة على ذلك، تم تطوير معادلة جديدة لحساب [Ca2+] مع الإثارة isosbestic أو الإثارة في 400 نانومتر. مع هذه الطريقة، يمكن قياس التغييرات في الميتوكوندريا [Ca2+] بنجاح. وبالإضافة إلى ذلك، مع مجموعة مختلفة من الإثارة والموجات الموجية للانبعاثات، يمكن قياس معلمات متعددة، بما في ذلك NADH، [Ca2+] وإمكانية وجود غشاء الميتوكوندريا(M)في وقت واحد. تم قياس الميتوكوندريا [Ca2+]وM أو الرقم الهيدروجيني باستخدام fura-2-FF وtetramethylrhodamine إيثيل إستر (TMRE) أو كاربوكسي-seminaphtorhodafluor-1 (كاربوكسي-SNARF-1).
Introduction
ومن المعروف على نطاق واسع الدور الهام للداخل الخلايا كاليفورنيا2 + 1. القياس الكمي لـ [Ca2+] ضروري لفهم عمليات الوظائف الفسيولوجية الخلوية. Fura-2 النظير مفيدة جدا لأنها متحمسة في نطاق الأشعة فوق البنفسجية (<400 نانومتر)، ويمكن تطبيق طريقة قياس النسب للقياس الكمي. لذلك، يمكن قياس المعلمات الفسيولوجية الأخرى مثل درجة الحموضة، وإمكانات الغشاء، وما إلى ذلك، مع الأصباغ الفلورية الأخرى. ويقال إن نطاق تركيز الميتوكوندرياCa2+ ([Ca2+]m)كان 0.08−20 μM2و3و4و5. بين fura-2 النظير، fura-2-FF هو مناسب لقياس هذا النطاق من [Ca2+]. ومع ذلك، تحتوي الخلايا الحية للأسف NADH / NADPH لعملياتها الأيضية، وNADH يولد تداخل إشارة بسبب الإثارة المتداخلة وأطياف الانبعاثات مع التناظرية fura-2. هذا التداخل يحد إلى حد كبير من استخدام النظير fura-2. على وجه التحديد، إذا تم تطبيق التناظرية لقياس الميتوكوندريا [كاليفورنيا2+] ، وهذا التدخل هو أكبر عقبة لأن أعلى كمية من NADH هو في الميتوكوندريا. ومما يزيد من تعقيد هذا الأمر التغيرات التي تحدثها NADH المرتبطة بإمكانية غشاء الميتوكوندريا(م)ويؤثر تغيير M [Ca2+] م6و7و8 , 9.وعلاوة على ذلك، لدراسة [Ca2+]م ديناميات، فمن الضروري أن نعرف حالة المعلمات الميتوكوندريا الأخرى، مثل NADH،م،والرقم الهيدروجيني.
الانبعاثات في 450 نانومتر و 500 نانومتر مع الإثارة في 353 نانومتر, 361 نانومتر, و 400 نانومتر تحتوي على إشارات من NADH وfura-2-FF, والمعادلات هي كما يلي. هنا, 353 نانومتر و 361 نانومتر هي النقاط isosbestic من fura-2-FF للانبعاثات في 450 نانومتر و500 نانومتر, على التوالي.
F361,450 = F361,450,NADH + F361,450,Fura Equation 1
F353,500 = F353,500,NADH + F353,500,Fura Equation 2
F400,500 = F400,500,NADH + F400,500,Fura Equation 3
حيث Fx,y هو كثافة الانبعاثات المقاسة في y-nm بواسطة x-nm الإثارة، Fx،y، NADH يمثل كثافة الانبعاثات المعتمدة على NADH نقية، وFx،y، Fura يمثل كثافة الانبعاثات النقية fura-2-FF-تعتمد على. تحت نفس التركيز من صبغة الفلورسنت، ينبغي أن تنتج كثافة الإثارة معينة نفس كثافة الانبعاثات. ولذلك، ينبغي أن تكون نسبة كثافة الانبعاثات لاثنين من الأطوال الموجية المختلفة ثابتة. Ca2+ وfura-2 لم يؤثر على خصائص الفلورة NADH; ولذلك، فإن نسبة الانبعاثات عند 450 نانومتر و500 نانومتر من NADH كانت ثابتة في أي موجة إثارة. ويمكن استخدام نفس القاعدة لfura-2-FF على أساس افتراض أن NADH أو [Ca2+] لا يؤثر على الأطياف الانبعاثات والإثارة من fura-2-FF. ومع ذلك، تسبب Ca2+ في تحول طيفي لانبعاث الفوا-2-FF. لذلك، لإزالة تأثير Ca2+، الإثارة isosbestic، وهو مستقل عن Ca2+، يحتاج إلى استخدامها. كل موجة الانبعاثات (أي، 450 نانومتر و 500 نانومتر) لديه نقطة isosbestic مختلفة، ومن الإعداد التجريبي لدينا، 353 نانومتر في 500 نانومتر و 361 نانومتر في 450 نانومتر تم اختيار. من هذه المعادلات التالية صالحة10.
Rf = F361,450,Fura/F353,500,Fura Equation 4
RN1 = F400,500,NADH/F361,450,NADH Equation 5
RN2 = F353,500,NADH/F361,450,NADH Equation 6
مع هذه الثوابت، المعادلات التالية من (المعادلة 1) (المعادلة 2) و (المعادلة 3) صالحة.
F361,450 = F361,450,NADH + Rf × F353,500,Fura Equation 7
F353,450 = RN2 × F361,450,NADH + F353,500,Fura Equation 8
F400,500 = RN1 × F361,450,NADH + F400,500,Fura Equation 9
من هذه المعادلات، إذا كان Rf،RN1،و RN2 معروفة، يمكن الحصول على إشارات نقية من NADH وfura-2 على النحو التالي.
F361,450,NADH = (F361,450 - Rf × F353,500)/(1− Rf × RN2)المعادلة 10
F353,500,Fura = (RN2 × F361,450 − F353,500)/(Rf × RN2 − 1) المعادلة 11
F400,500,Fura = F400,500 − RN1 × F361,450,NADH Equation 12
RFura = F353,500,Fura/F400,500,Fura Equation 13
كان شكل Ca2+من المنضم من fura-2-FF غير فلورسنت عمليا ً في الطول الموجي للإثارة 400 نانومتر. استناداً إلى هذه الخاصية، يمكن اشتقاق معادلة المعايرة الجديدة التالية.
[Ca2+] = Kd ∙ (F400,500,max/F353,500,max)× (RFura − Rmin)Equation 14
حيث Kd هو ثابت التفكك، F400،500، ماكس و F353،500، كحد أقصى هي القيم القصوى للإشارات المنبعثة في 500 نانومتر مع الإثارة في 400 نانومتر و 353 نانومتر، على التوالي، وRدقيقة هو الحد الأدنى RFura في كاليفورنيا2 +خالية من الشرط. بما أنّ الإثارة [إسوسبستيك] كان استعملت, المعادلة يستطيع كنت بسّطت أبعد [أس فولّووس].
[Ca2+] = Kd ∙ (1/ Rmin)∙ (RFura − Rmin)المعادلة 15
لذلك، يجب فقط قيمالحد الأدنى Kd و R لحساب [Ca2+].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية الحيوانات واستخدامها على جميع البروتوكولات التجريبية.
1. إعداد الحلول
- إعداد واحد خلايا القلب معزولة حديثا11.
ملاحظة: قد يكون لكل مختبر حل تخزين خلية مختلفة. هنا، يتم تخزين الخلايا العضلية في وسط الثقافة (DMEM). - إعداد 100 مل من Ca2 +حل الحرة(الجدول 1).
- إعداد 50 مل من وسط الثقافة في كوب 50 مل. Aliquot 5 مل ووضعها في حمام مائي في 37 درجة مئوية. الحفاظ على الحل المتبقي في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد 50 مل من محلول الصابونين عن طريق إضافة 5 ملغ من الصابونين إلى 50 مل من Ca2 +خالية من الحل.
ملاحظة: يستخدم الصابونين لنفاذ خلايا القلب، لإزالة المقصورات السيتوسالية، وتصور الفلورة الميتوكوندريا فقط. - إعداد 16 ميكرولتر من 1 م/2-FF-AM المذاب في كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO).
ملاحظة: جعل 1 مليون متر حل الأسهم من fura-2-FF-AM حل في DMSO وaliquot 16 € L في أنبوب 2 مل. تخزينها في -20 درجة مئوية حتى استخدامها. - إعداد 50 مل من CAخالية منNADH 2 + خالية من الحل(الجدول 1)و 50 مل من CA2 +خالية من NADH - حل المشبعة(الجدول 1)عندما يتم قياس النقاط isosbestic. ضبط الحموضة إلى 7.0 مع KOH.
ملاحظة: يحتوي حل Ca2+الخالي من NADH(الجدول 1)على 10 ميكرومتر FCCP و100 درجة مئوية من ADP دون أي ركائز الميتوكوندريا لتقليل NADH في الميتوكوندريا. - إعداد 50 مل من Ca2 +خالية من الحل، 50 مل من محلول مالات، 50 مل من محلول بيروفات، 50 مل من محلول مالات بيروفات، و 50 مل من محلول روتينون لاستخدامها في قياسات عامل التصحيح NADH(الجدول 1).
2- إجراء تحميل المسبار الفلوري في الميتوكوندريا
- إعداد حل صبغ التحميل عن طريق إضافة 2 مل من وسط الثقافة إلى 16 درجة مئوية من 1 mm fura-2-FF-AM.
ملاحظة: صبغة الفلورسنت هشة تحت الضوء. إعداد الحل قبل الاستخدام مباشرة. الحفاظ على الحل الذي يحتوي على صبغة الفلورسنت في مكان مظلم. التركيز النهائي من fura-2-FF-AM هو 8 μM. إذا تم استخدام كاربوكسي-SNARF-1، وإعداد حل تحميل صبغ مع 2 μM carboxy-SNARF-1-AM. - خذ 2 مل من الخلايا المعزولة ووضعها في أنبوب اختبار 5 مل في وضع مستقيم.
- انتظر 15 دقيقة لخلايا mys لتغرق في الجزء السفلي وإزالة supernatant.
ملاحظة: قد يحتوي supernatant على حطام الخلية. لا تطرد الأنبوب لتجنب تلف الخلايا. - إضافة 2 مل من محلول تحميل صبغ.
- احتضان حل صبغ التحميل مع الخلايا لمدة 60 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- ثم، وضع أنبوب الاختبار في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في وضع مستقيم.
- إزالة supernatant، وإضافة 4 مل من وسط الثقافة prewarmed من 37 درجة مئوية. حضانة الخلايا لمدة 60 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- وأخيرا، إزالة supernatant، إضافة 4 مل من وسط الثقافة في درجة حرارة الغرفة والحفاظ على أنبوب في درجة حرارة الغرفة.
3 - إدخال نظام القياس متعدد القياسات
ملاحظة: يظهر الشكل 1 رسم تخطيطي للنظام بأكمله.
- للحصول على مصدر ضوء الإثارة، استخدم أحادي اللون السريع (متعدد الألوان II) الذي يمكنه تغيير الضوء في غضون 3 مللي ثانية.
- استخدم عدسة غمر الزيت (40x, NA 1.3) مع مجهر مقلوب لزيادة شدة الإشارة.
- استخدم عامل تصفية شبه بالأشعة تحت الحمراء وكاميرا جهاز مقترن بالشحن (CCD) لمراقبة حقل الكائن دون تداخل إشارة الفلورسنت.
- التقاط صورة حقل الكائن للحصول على المنطقة.
- ضبط حقل الكائن في شاشة العرض باستخدام الحجاب الحاجز الحقل فقط لإظهار الخلية لتقليل الخلفية.
- استخدم أربعة أنابيب مضاعف ضوئي مع كل مرشح تمرير النطاق (450، 500، 590، و 640 نانومتر) للكشف عن أطوال موجية الانبعاثات مع طريقة عد الفوتون. استخدم المرايا الديكروية المناسبة لتقسيم وإعادة توجيه ضوء الانبعاثات.
ملاحظة: ضوء الإثارة قوي جداً بالمقارنة مع ضوء الانبعاثات. وبالتالي، اختر مرشح تمرير النطاق مع أعلى خصائص حظر لتقليل الخلفية. يتكون نظام عد الفوتون من مزيج من PMTs ووحدات عداد الفوتون وعداد عالي السرعة. للتحكم في النظام وتذوق البيانات، تم استخدام برنامج قيادة مخصص. من الضروري إيجاد طريقة لتطبيق هذه الطريقة مع أنظمة أخرى.
4. طرق تصحيح NADH مع نظام قياس متعدد البارامترية
- تحديد النقاط الأيوسبيستية من فورا-2-FF في الموقع.
ملاحظة: ذكرت العديد من التقارير أنه يتم تغيير خصائص الفلورسنت في الخلايا. لذلك، تنفيذ كافة الإجراءات للحصول على المعلمات لتصحيح التداخل في الموقع.- جبل خلية محملة بالصبغة على المجهر وانتظر لمدة 3 دقائق لإغراق الخلايا إلى أسفل.
ملاحظة: ضبط أرقام الخلايا لرؤية حول خلية واحدة لكل حقل هدف واحد مع عدسة موضوعية 40x. - انفخ الحل الخالي من CA2+الخالي من NADH عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
- بعد استهداف الخلية، قم بقياس الخلفية الخالية من الخلايا ومنطقة الخلية كما هو موضح في القسم 4-1. حساب خلفية الخلية من منطقة الخلية.
ملاحظة: يجب تصحيح كل من إشارات الخلفية في كل تجربة. - قم بمزج محلول الصابونين لمدة 60 ق والعودة إلى الحل الخالي من CA2+الخالي من NADH.
- قياس Fura-2-FF-المنبعثة إشارات في 450 نانومتر و 500 نانومتر في وقت واحد من قبل المسح الضوئي الإثارة من 350 نانومتر إلى 365 نانومتر مع خطوة 0.1 نانومتر.
- قم بمزج محلول Ca2+الخالي من NADH وكرر الخطوة 4.2.5.
- طرح الإشارات في الحل Ca2+المشبعة من الإشارات في ظروف Ca2+خالية.
- كرر الإجراءات من 4.2.2 إلى 4.2.7 مع خلايا القلب واحدة أخرى.
ملاحظة: إذا أصبحت شدة الإشارة أضعف، كرر من 4.2.1. كرر الإجراء لـ 5 خلايا مختلفة على الأقل. - من جميع الإشارات التي تم الحصول عليها، حساب الانحرافات المعيارية للانبعاثات في كل إثارة واختيار الطول الموجي الإثارة التي تبين الحد الأدنى من قيمة الانحراف المعياري (SD) كنقطة isosbestic.
ملاحظة: ترد الأرقام التمثيلية في الشكل 2.
- جبل خلية محملة بالصبغة على المجهر وانتظر لمدة 3 دقائق لإغراق الخلايا إلى أسفل.
- الكشف عن إشارة الخلفية وطرق التصحيح مع منطقة الخلية
ملاحظة: هناك نوعين من الخلفيات. واحد يأتي من الخلايا والآخر يأتي من انعكاس على زلة غطاء (خلفية خالية من الخلايا). ويلزم تصحيح كلتا الخلفيات في كل تجربة.- جبل الخلايا الخالية من الصبغة في الحمام على المجهر والانتظار لمدة 3 دقائق لإغراق الخلايا إلى أسفل. Perfuse NADH خالية من Ca2 +حل خالية من حوالي 5 دقائق.
ملاحظة: معدل التسريب الحل هو 2-3 مل / دقيقة في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: ضبط أرقام الخلايا لرؤية حول خلية واحدة لكل حقل هدف واحد مع عدسة موضوعية 40x. - تعيين حقل الكائن لتغطية الخلية المستهدفة.
- بعد نقل الخلية خارج الحقل، قم بقياس إشارات الخلفية للنافذة الخالية من الخلايا وتعيينها كإزاحات.
ملاحظة: الإشارة تعني الإشارة الضوئية التي سيتم الكشف عنها في نظام عد الفوتون. - إرجاع الخلية إلى الموضع الأولي وقياس إشارات خلفية الخلية ومنطقة الخلية.
ملاحظة: على الرغم من أنه يتم تصفية ضوء الإثارة مع عامل تصفية شريط، فإنه لا يزال يحتوي على كمية كبيرة جداً من الضوء الذي تمت تصفيته. يتم تفريق هذا الضوء عند ضرب الخلايا ويسبب إشارة خلفية كبيرة لأن نظام العد الفوتون حساس للغاية. ولا بد من تصحيحه.
ملاحظة: قد يتم حساب منطقة الخلية مع صورة خلية تم التقاطها وبرنامج تصوير متوفر. وحدة منطقة الخلية يمكن أن تكون أي وحدة بما في ذلك عدد بكسل. فقط التوحيد ضروري. - كرر من 4.1.1 إلى 4.1.4 لمدة 10 مرات للحصول على العلاقة بين منطقة الخلية وإشارات خلفية الخلية.
ملاحظة: لاحقاً، يمكن حساب إشارات خلفية الخلية من منطقة الخلية من العلاقة. منذ المصباح الكهربائي الإثارة تصبح الشيخوخة، وهذا الإجراء يحتاج إلى تكرار، على الأقل، كل شهر.
- جبل الخلايا الخالية من الصبغة في الحمام على المجهر والانتظار لمدة 3 دقائق لإغراق الخلايا إلى أسفل. Perfuse NADH خالية من Ca2 +حل خالية من حوالي 5 دقائق.
- قياس عوامل R
- حساب الترددات اللاسلكية مع المعادلة 4 من الإشارات التي تم الحصول عليها في القسم 4.2.
- قم بتركيب الخلايا الخالية من الصبغة على المجهر وثقب الحل الخالي من Ca2+.
- قياس الإشارات مثل F361، 450، NADH،F400، 500، NADH،F361، 450، NADH،و F353، 500،NADH.
- Perfuse الحل مالات وتكرار 4.3.3. وقياس الإشارات.
- Perfuse الحل بيروفات وكرر 4.3.3. وقياس الإشارات.
- يُسكب محلول الماليت-بيروفات ويُكرّر 4.3.3. وقياس الإشارات.
- Perfuse الحل روتينون وتكرار 4.3.3. وقياس الإشارات.
ملاحظة: يظهر في الشكل 3مثال إشارة NADH المسجلة على البيروفات 5 mM، و5 ملات بالإضافة إلى 5 مليون متر بيروفات، وإضافة روتينون 10 ميكرومتر. - حساب كل ميل من F361، 450، NADH مقابلF 400، 500، NADH و F361، 450، NADH مقابلF 353، 500، NADH. كما هو مبين في الشكل 3. يشير كل ميل إلى RN1 و RN2.
5. اختيار الإثارة وضوء الانبعاثات لTMRE أو carboxy-SNARF-1
- إذا تم استخدام TMRE لقياس إمكانات الميتوكوندريا بالإضافة إلى ذلك، استخدم الطول الموجي للإثارة 530 نانومتر والطول الموجي للانبعاثات 590 نانومتر.
- إذا تم استخدام carboxy-SNARF-1 لقياس إمكانات الميتوكوندريا بالإضافة إلى ذلك، استخدم الطول الموجي للإثارة من 540 نانومتر وموجات الانبعاثات من 590 نانومتر و 640 نانومتر12.
6. اختيار Kd قيمة fura-2-FF
- يمكن أن يؤثر تغيير الرقم الهيدروجيني على قيم Kd لـ Ca2+ binding على fura-2-FF10. استخدم قيمة Kd البالغة 5.28 في pH 7.5 للميتوكوندريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الميتوكوندريا Ca2+ التغييرات بسبب تصحيح10
ويبين الشكل 4 التغييرات في [Ca2+]م قبل التصحيح وبعده. وأظهرت النتائج بوضوح التغييرات الكبيرة في [كاليفورنيا2+]م. كان تركيز الكالسيوم الميتوكوندريا يستريح دون Ca السيتوسول2+ Ca([2+]ج)1.03 ± 0.13 μM (متوسط ± S.E., n = 32), والحد الأقصى [Ca2+]م في 1-μM [Ca2+]c كان 29.6 ± 1.61 μM ( يعني ± S.E., n = 33)(الشكل 5).
قياس متزامن من NADH، [كاليفورنيا2+] ،و10 م
يمكن توزيع TMRE المشحونة بشكل إيجابي بطريقة تعتمد على الغشاء المحتمل. يمكن حساب إمكانات الغشاء باستخدام معادلة Nernst مع التركيز في كل حجرة. تم رصد TMRA الميتوكوندريا مع التسريب من TMRE 2-nM. وكان من المفترض أن تكون الـ M الأولية -150 مليفي،وتم حساب تغيير m على أساس ذلك. تطبيق Ca2+ انخفض NADH ولكن أثرت علىم فقط negligibly(الشكل 6).
الميتوكوندريا الرقم الهيدروجيني التغييرات من قبل التغيير في [كاليفورنيا2+] م10
تم رصد الرقم الهيدروجيني الميتوكوندريا مع التحميل الإضافي من carboxy-SNARF-1 بعد التغييرات Ca2 + (الشكل 7). لم يتأثر الرقم الهيدروجيني الميتوكوندريا بالزيادة في [Ca2+]م. وكان درجة الحموضة الميتوكوندريا يستريح 7.504 ± 0.047 (متوسط ± S.E., n = 13). من هذه النتائج، كان 5.28 درجة مئوية القيمة Kd المختارة من fura-2-FF في درجة الحموضة 7.5.
الشكل 1: نظام قياس الفلورة الدقيقة للقياس متعدد البارامترية
تم عرض الرسم التخطيطي لنظام قياس الفلورة الدقيقة. تم تصور الخلايا المثبتة عن طريق كاميرا CCD. تم الكشف عن أربعة أضواء الانبعاثات المختلفة مع أربعة PMTs عن طريق نظام العد الفوتون. وقد تم استنساخ هذا الرقم بإذن من المجلة الكورية لعلم وظائف الأعضاء والصيدلة10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحديد النقاط الأيوسبيستية
(أ)يشير السهم الأحمر إلى نقطة isosbestic في الطول الموجي الانبعاثات 450 نانومتر. يظهر Fura-2 FF في الحالة غير المنضمة مع خط منقط وفي حالة Ca2+ المنضمة مع خط صلب. (B)يشار السهم الأحمر إلى نقطة isosbestic في الطول الموجي الانبعاثات 500 نانومتر. (C)يتم عرض البيانات المطروحة للإشارة في 450 نانومتر في Ca2+خالية من الشروط من Ca2+خالية من الظروف المشبعة. (D)يتم عرض البيانات المطروحة للإشارة عند 500 نانومتر في Ca2+- الشروط الخالية من Ca2+خالية من الظروف المشبعة. (E)يتم عرض بيانات الانحراف المعياري من الرسم البياني C. (F)يتم عرض بيانات الانحراف المعياري من الرسم البياني D. وقد تم استنساخ هذا الرقم بإذن من المجلة الكورية لعلم وظائف الأعضاء والصيدلة10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: قياس عوامل RN.
(أ)تم قياس التغيرات في إشارة NADH دون صبغ الفلورسنت عن طريق تطبيق مختلف ركائز الميتوكوندريا في 361 نانومتر الإثارة و 450 موجات الانبعاثات نانومتر. )ب(رصد تداخل NADH في إشارات fura-2-FF،و٥٠٠ ٤٠٠ F )∙∙( و F٥٠٠ ٣٥٣ (-). (ج)تظهر العلاقات بين F361,450,NADH و F400,500,NADH (○) وبين F361,450,NADH و F353,500,NADH (●). يتم تمثيل المنحدرات التي تم الحصول عليها كما RN1 و RN2،على التوالي. وقد تم استنساخ هذا الرقم بإذن من المجلة الكورية لعلم وظائف الأعضاء والصيدلة10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نتائج تصحيح التداخل بين NADH وfura-2-FF
تغيير الإشارات من قبل التصحيح (كما هو موضح في اللوحات اليسرى) إلى ما بعد التصحيح (كما هو موضح في اللوحات اليمنى). (A)إشارات NADH في الطول الموجي الانبعاثات 450 نانومتر. (B)إشارات Fura-2-FF في الطول الموجي للانبعاثات 500 نانومتر. ويبين الرقم 500 400 فرنك ف(- -)،و500 353 فرنك فرنسي (----)، ونسبة الفوا-2-FF (-). (ج)تركيز الكالسيوم الميتوكوندريا. يشير الخط المنقط الأحمر إلى الصفر. وقد تم استنساخ هذا الرقم بإذن من المجلة الكورية لعلم وظائف الأعضاء والصيدلة10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: يستريح [Ca2+]م دون كاليفورنيا السيتوسية2+ والحالة القصوى الثابتة [Ca2+]م في 1 μm Cytosolic Ca2+
تم تنشيط الميتوكوندريا مع التسريب من محلول الماليت بيروفات. الحالة الثابتة [Ca2+]م في Ca2+شروط خالية وفي 1 μM Ca2+ تم عرض الشروط. إضافة 5 MM Na+ تعافى NADH وخفض [كاليفورنيا2+]م إلى خط الأساس. وقد تم استنساخ هذا الرقم بإذن من المجلة الكورية لعلم وظائف الأعضاء والصيدلة10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: القياس المتزامن لـ NADH، [Ca2+]م،وM
تم تنشيط الميتوكوندريا مع التسريب من محلول الماليت بيروفات. تم عرض التغييرات من NAHD، [كاليفورنيا2 +]م وM. إضافة 1 μM Ca2+ انخفض NAHD وزيادة [Ca2+]م ولكن لم يتغيرم بشكل كبير. وقد تم استنساخ هذا الرقم بإذن من المجلة الكورية لعلم وظائف الأعضاء والصيدلة10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: القياس المتزامن لـ NADH، [Ca2+]م،والرقم الهيدروجيني
التطبيق المتكرر من Ca2+ يمكن أن يؤدي إلى انخفاض NADH وزيادة [Ca2+]م ولكن لم يتأثر الرقم الهيدروجيني الميتوكوندريا من قبل تطبيق Ca2+. إضافة Na + يمكن أن ترجع NADH و [Ca2+]م إلى خط الأساس. وقد تم استنساخ هذا الرقم بإذن من المجلة الكورية لعلم وظائف الأعضاء والصيدلة10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم الحلول | التركيز (mM) | |||||||||
| KCl | HEPES | فى هذا العنونة | كاليفورنيا2 | م | ف | R | FCCP | Adp | الصابونين | |
| Ca2+- مجانا | 150 | 10 | 1 | |||||||
| خاليمن NADH | 150 | 10 | 1 | 0.01 | 0.1 | |||||
| Ca2+- مجانا | ||||||||||
| خاليمن NADH | 135 | 10 | 1 | 0.01 | 0.1 | |||||
| Ca2+- مشبعة | ||||||||||
| الصابونين | 150 | 10 | 1 | 0.1mg / مل | ||||||
| مالات | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| بيروفات | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| مالات بيروفات | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | |||||
| روتنون | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | 0.01 | ||||
| وسط الثقافة | دولبكو في النسر المعدل المتوسط (DMEM) | |||||||||
| صبغ التحميل | إضافة 1mM Fura-2-FF-AM الأسهم (16 مل) في وسط الثقافة (2 مل) | |||||||||
الجدول 1: الحلول
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم تطوير طريقة تصحيح التداخل بنجاح لقياس إشارات NADH وfura-2 التناظرية. القياس الدقيق للإشارات ضروري للتصحيح الدقيق. ومع ذلك، فإن الطبيعة المتأصلة في جهاز الفلورسنت تنتج إشارة خلفية لا علاقة لها بإشارة NADH من fura-2. يمكن لفلتر تمرير النطاق الأعلى جودة تمرير ما يصل إلى 10−8 فقط من الأطوال الموجية غير المرغوب فيها للضوء. ومع ذلك، إشارة الفلورسنت من خلية واحدة صغيرة جداً، وانعكاس ضوء الإثارة بعد مرشح تمرير الفرقة لا تزال قوية بما فيه الكفاية لتلويث إشارات الفلورسنت الفعلية. لذلك، من الضروري تصحيح دقيق لإشارة الخلفية.
Fura-2 لديه مشكلة تحميل لقياس الميتوكوندريا كاليفورنيا2 +. أولا، ليس من السهل تحميل الصبغة على وجه التحديد في الميتوكوندريا، وتحميل غير محدد في organelle آخر يمكن أن يكون خاطئا. تركيز الميتوكوندريا Ca2+ هو عموما أعلى من ذلك من السيتوسول، واستخدام fura-2-FF معقيمة D K عالية يمكن تجنب تلوث التغيرات السيتوسولية كاليفورنيا2 +. أما الجهاز الآخر الذي يمثل إشكالية فهو الشبكية الساركوبلاسية (SR). ومع ذلك، فإن فروق حجم التوزيع (3.5٪ مقابل الميتوكوندريا 34٪ - 36٪ في الخلايا البطينية للفئران)13،14 وإزالة ATP في التجارب يمكن أن تعوض عن التلوث من ريال سعودي.
لدينا معادلة المعايرة (المعادلة 14 و 15) لديها العديد من الخصائص المفيدة على معادلة Grynkiewicz15 على النحو التالي:
1) فإنه يتطلب ثلاثة معلمات فقط: دينار كويتي، F400،500، ماكس/ F353،500، كحد أقصى،وR دقيقة.
2) هناك خطية من قيمة النسبة إلى تركيز Ca2 + في الرقم الهيدروجيني ثابت.
3) هناك معلمة نسبيا خالية من الأخطاء في F400،500، ماكس/ F353،500، كحد أقصى مقارنة مع SF2/ SB215.
4) في المعادلة 15، مطلوب فقط Kd و Rدقيقة إذا تم استخدام الإثارة isosbestic.
5) إجراء المعايرة للحصول على المعلمة هو أبسط بكثير مع المعادلة 15.
ومع ذلك، هناك قيود لأن Ca2+المشبعة fura-2-FF يولد انبعاث صغير جدا. يؤدي إلى خطأ. يمكن تطبيق المعادلة الجديدة على [Ca2+] تركيزات تصل إلى 50x من Kd.
وفي الختام، وُضع بروتوكول لحل المشكلة القائمة المتمثلة في التدخل في مجال مكافحة الهناد وفورا-2-FF بنجاح. يمكن لهذا الأسلوب قياس ديناميكيات Ca2+ بشكل أكثر دقة. نظام القياس متعدد القياسات، وخاصة في الميتوكوندريا، سيساعد على فهم فسيولوجيا الميتوكوندريا بطريقة كمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل برنامج بحوث العلوم الأساسية من خلال المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) بتمويل من وزارة التعليم (2018R1A6A3A01011832)، من قبل وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي (NRF-2016M3C1A6936606) ومن قبل وزارة التجارة والصناعة والطاقة (10068076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipment, 640±11nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590±15nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500±20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipment, 450±30nm |
| Calcium chloride solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
| DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Sigma-aldrich | D5030 | Chemicals |
| EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid | Sigma-aldrich | E4378 | Chemicals |
| FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Chemicals |
| field diaphragm | Nikon | 86506 | Equipment |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | chemicals |
| Green tube | DWM | test tube | |
| HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| High-speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipment, 50:50 |
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Equipment, 750±100nm |
| Oil immersion lens | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipment |
| Photon counter unit | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
| Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936 | Chemicals |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-aldrich | P4494 | Chemicals |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
| Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemicals |
| TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Molecular probes | T669 | Chemicals |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Miyata, H., et al. Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes. American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).
- Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).
- Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium. Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).
- Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).
- Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
- Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes. Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).
- Brandes, R., Bers, D. M. Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae. Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).
- Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).
- Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat. Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).
- Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
- Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism. Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).
- Page, E. Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology. American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).
- Page, E., McCallister, L. P., Power, B. Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
