Summary
På grunn av en Spectral som overlapper eksitasjon-og utslipps bølgelengdene til NADH-og fura-2-analogs, er signalforstyrrelser fra begge kjemikaliene i levende celler uunngåelig under kvantitativ måling av [ca2 +]. Således, en roman online rettelsen metoden av NADH signal innblanding å mål [ca2 +] var bebygget.
Abstract
For å måle [ca2 +] kvantitativt, fura-2 analogs, som er ratiometrisk fluoroprobes, brukes ofte. Imidlertid er Dye behandling egentlig begrenset i levende celler på grunn av autofluorescence interferens, hovedsakelig fra nikotinamid adenine dinucleotide (NADH). Mer spesifikt, er dette en stor hindring ved måling av mitokondrie [ca2 +] kvantitativt bruker fura-2 analogs fordi FLERTALLET av NADH er i mitokondrier. Hvis den fluorescerende farge konsentrasjonen er den samme, bør en viss eksitasjon intensitet produsere samme utslipps intensitet. Derfor bør utslipps intensitet forholdet mellom to forskjellige eksitasjon bølgelengder være konstant. Basert på dette prinsippet, en roman online korreksjon metode for NADH signal interferens å måle [ca2 +] ble utviklet, og den virkelige signal INTENSITETEN av NADH og fura-2 kan fås. Videre ble en roman ligning for å kalkulere [ca2 +] utviklet med isosbestic eksitasjon eller eksitasjon ved 400 nm. Med denne metoden kan endringer i mitokondrie [ca2 +] måles. I tillegg, med et annet sett av eksitasjon og utslipps bølgelengder, flere parametre, inkludert NADH, [ca2 +], og pH eller mitokondrie membran potensial (Ψm), kan måles samtidig. Mitokondrie [ca2 +] og Ψm eller pH ble målt ved hjelp av FURA-2-FF og TETRAMETHYLRHODAMINE etanol Ester (TMRE) eller carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (carboxy-snarf-1).
Introduction
Den viktige rollen intracellulære ca2 + er viden kjent1. Kvantifisering av [ca2 +] er avgjørende for å forstå prosessene i cellulære fysiologiske funksjoner. Fura-2 analogs er ganske nyttige fordi de er glade i UV-serien (< 400 nm), og ratiometrisk metoden kan anvendes for den kvantitative målingen. Derfor kan andre fysiologiske parametre som pH, membran potensial, etc., måles med andre fluorescerende fargestoffer. Mitokondrie ca2 + konsentrasjon ([ca2 +]m) range ble angivelig 0.08 − 20 μM2,3,4,5. Blant fura-2 analogs er fura-2-FF egnet for å måle dette spekteret av [ca2 +]. Imidlertid, det bo celler beklageligvis inneholde NADH/NADPH for deres metabolic prosesser, og NADH utvikler signal innblanding med hensyn til det overlappe eksitasjon og utstråling Spectra med det fura-2 analog. Denne forstyrrelsen i stor grad begrenser bruken av fura-2 analogs. Spesielt hvis analog brukes til å måle mitokondrie [ca2 +], er denne forstyrrelsen den største hindringen fordi det høyeste beløpet av NADH er i mitokondrier. Dette er ytterligere komplisert av NADH endringer som er relatert til mitokondrie membran potensialet (Ψm) og endring av Ψm påvirker [ca2 +]m6,7,8 , 9. videre, for å studere [ca2 +]m dynamikk, er det viktig å vite status for andre mitokondrie parametre, slik som NADH, Ψm, og pH.
Utslippene på 450 nm og 500 NM med excitations på 353 NM, 361 NM, og 400 nm inneholde signaler fra NADH og fura-2-FF, og likninger er som følger. Heri, 353 NM og 361 NM er isosbestic punkter fura-2-FF for utslipp på 450 nm og ved 500 NM, henholdsvis.
F361 450 = f361450, NADH + f361450, fura ligning 1
F353 500 = f353500, NADH + f353500, fura ligning 2
F400 500 = f400500, NADH + f400500, fura ligning 3
der Fx, y er den målte utslipps intensiteten på y-NM ved x-NM eksitasjon, Fx, y, NADH representerer den rene NADH-avhengige utslipps intensiteten, og fx, y, fura representerer den rene fura-2-FF-avhengige utslipps intensiteten. Under samme konsentrasjon av fluorescerende fargestoff, en viss eksitasjon intensitet bør produsere samme utslipps intensitet. Derfor bør utslipps intensitet forholdet mellom to forskjellige eksitasjon bølgelengder være konstant. Ca2 + og fura-2 påvirket ikke NADH fluorescens egenskaper; Derfor var forholdet mellom utslippene ved 450 nm og ved 500 NM for NADH konstant ved enhver eksitasjon bølgelengde. Den samme regelen kan brukes for fura-2-FF basert på antagelsen om at NADH eller [ca2 +] ikke påvirker utslipp og eksitasjon Spectra av fura-2-FF. Men ca2 + forårsaket en Spectral forskyvning av fura-2-FF utslipp. Derfor, for å fjerne effekten av ca2 +, isosbestic eksitasjon, som er uavhengig av ca2 +, må brukes. Hvert utslipps bølgelengde (dvs. 450 nm og 500 NM) har et annet isosbestic punkt, og fra vårt eksperimentelle oppsett, 353 NM ved 500 NM og 361 NM på 450 nm ble valgt. Fra disse er følgende ligninger gyldige10.
Rf = f361450, fura/F353500, fura ligning 4
RN1 = F400500, NADH/F361450, NADH ligning 5
RN2 = F353500, NADH/F361450, NADH ligning 6
Med disse konstantene er følgende ligninger fra (formel 1) (formel 2) og (formel 3) gyldige.
F361 450 = f361450, NADH + Rf × f353500, fura ligning 7
F353 450 = RN2 × F361450, NADH + F353500, fura ligning 8
F400 500 = RN1 × F361450, NADH + F400500, fura ligning 9
Fra disse ligninger, hvis Rf, rN1, og RN2 er kjent, rene signaler av NADH og fura-2 kan fås som følger.
F361450, NADH = (F361 450 -rf × f353 500)/(1 − rf × rN2) ligning 10
F353500, fura = (rN2 × F361 450 − f353 500)/(rF × rN2 − 1) ligning 11
F-400500, fura = f400 500 − RN1 × F-361450, NADH ligning 12
Rfura = F353500, fura/F400500, fura ligning 13
Ca2 +-bundet form av fura-2-FF var praktisk talt ikke-fluorescerende på 400 nm eksitasjon bølgelengde. Basert på denne egenskapen kan følgende nye kalibrerings ligning utledes.
[Ca2 +] = Kd ∙ (F400500, maks/f353500, maks.) × (rfura − rmin) ligning 14
der Kd er en dissosiasjon konstant, f400500, Max og F353500, Max er de maksimale verdiene av de slippes signalene på 500 NM med excitations på 400 nm og 353 NM, henholdsvis, og Rmin er minimum rfura i ca2 +-fri tilstand. Siden isosbestic excitations ble brukt, kan ligningen forenkles videre som følger.
[Ca2 +] = Kd ∙ (1/Rmin) ∙ (rfura − rmin) ligning 15
Derfor kreves bare Kd -og Rmin -verdier for å beregne [ca2 +].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle protokoller ble godkjent av den lokale institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen.
1. forberedelse av løsningen
- Forbered én fersk isolert CARDIAC myocytter11.
Merk: hvert laboratorium kan ha en annen celle lagringsløsning. Her lagres myocytter i kultur medium (DMEM). - Klargjør 100 mL av ca2 +-gratis løsning (tabell 1).
- Forbered 50 mL kultur medium i et 50 mL beger. Alikvot 5 mL og legg den i et vannbad ved 37 ° c. Oppbevar den resterende løsningen ved romtemperatur.
- Klargjør 50 mL saponin oppløsning ved å tilsette 5 mg saponin til 50 mL ca2 +-gratis løsning.
Merk: saponin brukes til å permeabilize CARDIAC myocytter, å fjerne cytosolic rom, og å visualisere mitokondrie fluorescens bare. - Forbered 16 μL av 1 mM fura-2-FF-AM oppløst i dimethyl sulfoxide (DMSO).
Merk: lag 1 mM lagerløsning av fura-2-FF-AM oppløst i DMSO og alikvot 16 μL i et 2 mL rør. Oppbevar dem ved-20 ° c til bruk. - Forbered 50 mL NADH-Free ca2 +-gratis løsning (tabell 1) og 50 ml av NADH-Free ca2 +-mettet oppløsning (tabell 1) når isosbestic punkter skal måles. Juster pH til 7,0 med KOH.
Merk: NADH-Free ca2 +-gratis løsning (tabell 1) inneholder 10 μM FCCP og 100 μM ADP uten noen mitokondrie UNDERLAG for å minimere NADH i mitokondrier. - Forbered 50 mL ca2 +-gratis løsning, 50 ml av Malate løsning, 50 ml pyruvat oppløsning, 50 ml av Malate-pyruvat løsning, og 50 ml rotenon løsning som skal brukes for NADH korreksjon faktor målinger (tabell 1).
2. Fluoroprobe lasting prosedyren inn i mitokondrier
- Klargjør løsningen for farge lasting ved å tilsette 2 mL av kultur mediet til 16 μL av 1 mM fura-2-FF-AM.
Merk: fluorescerende fargestoff er skjør under lyset. Klargjør løsningen like før bruk. Hold løsningen som inneholder fluorescerende fargestoff på et mørkt sted. Den endelige konsentrasjonen av fura-2-FF-AM er 8 μM. Hvis carboxy-SNARF-1 ble brukt, klargjør du løsningen for farge lasting med 2 μM carboxy-SNARF-1-AM. - Ta 2 mL av de isolerte cellene og plasser det i et 5 mL reagensrør i oppreist stilling.
- Vent 15 min for myocytter å synke ned til bunnen og fjern supernatanten.
Merk: supernatanten kan inneholde celle rusk. Ikke sentrifuger røret for å unngå celle skade. - Tilsett 2 mL av løsningen for farge lasting.
- Ruge oppløsning med celler i 60 min. ved 4 ° c.
- Sett deretter reagensglasset i et vannbad på 37 ° c i 30 minutter i oppreist stilling.
- Fjern supernatanten, og tilsett 4 mL av prewarmed kultur medium på 37 ° c. Ruge cellene i 60 min i et vannbad på 37 ° c.
- Til slutt, fjerne supernatanten, tilsett 4 mL kultur medium ved romtemperatur og holde røret ved romtemperatur.
3. innføring av multiparametric målesystem
Merk: figur 1 viser et diagram over hele systemet.
- For en eksitasjon lyskilde, bruk en rask monokromator (polykrom II) som kan endre lyset innen 3 MS.
- Bruk et objektiv for olje nedsenking (40x, NA 1,3) med et invertert mikroskop for å øke signal intensiteten.
- Bruk et nær-infrarødt filter og et kamera med ekstrautstyr (CCD) til å overvåke objektfeltet uten fluorescerende signalforstyrrelser.
- Capture objektet feltet bildet for å få området.
- Juster objektfeltet på skjermen med et felt membran bare for å vise cellen for å redusere bakgrunnen.
- Bruk fire photomultiplier rør med hvert båndpassfilter (450, 500, 590 og 640 NM) for å oppdage utslipps bølgelengder med Foton tellemetode. Bruk riktig dichroic speil for å splitte og omdirigere utslipps lyset.
Merk: det eksitasjon lyset er veldig sterkt i forhold til utslipps lyset. Dermed velger du band-pass-filteret med de høyeste blokkerings egenskapene for å redusere bakgrunnen. Et foton telle system består av en kombinasjon av eksportert pmts, Foton teller enheter og en høyhastighets teller. For å kontrollere systemet og for å prøve dataene, ble det brukt en skreddersydd kjøre programvare. Finne en måte å bruke denne metoden med andre systemer er nødvendig.
4. NADH korreksjon metoder med et multiparametric målesystem
- Identifisering av isosbestic punkter på fura-2-FF in situ.
Merk: mange rapporter har uttalt at fluorescerende egenskaper er endret i cellene. Utfør derfor alle prosedyrer for å innhente parametrene for å korrigere forstyrrelsen in situ.- Monter den farge fylte cellen på mikroskopet, og vent i 3 min for å senke cellene til bunnen.
Merk: Juster celle tall for å se rundt en celle per ett objektiv felt med 40x objektiv linse. - Perfuse NADH-Free ca2 +-gratis løsning på 37 ° c.
- Etter målretting celle, måle celle-fri bakgrunn og celleområdet som vist i § 4,1. Beregn cellebakgrunnen fra celleområdet.
Merk: begge bakgrunns signalene må rettes opp i hvert eksperiment. - Perfuse den saponin løsningen for 60 s og gå tilbake til NADH-Free ca2 +-gratis løsning.
- Mål fura-2-FF-slippes signaler på 450 nm og 500 NM samtidig av eksitasjon skanne fra 350 Nm til 365 NM med 0,1 NM trinn.
- Perfuse den NADH-Free ca2 +-mettet løsning og gjenta trinn 4.2.5.
- Trekk signalene i ca2 +-mettet oppløsning fra signalene i ca2 +-frie forhold.
- Gjenta prosedyrene fra 4.2.2 til 4.2.7 med andre enkelt CARDIAC myocytter.
Merk: Hvis signal intensiteten blir svakere, gjentar du fra 4.2.1. Gjenta prosedyren for, minst, 5 forskjellige celler. - Fra alle innhentet signaler, beregne standardavvik av utslippet ved hver eksitasjon og velge eksitasjon bølgelengde som viser minimum standardavvik (SD) verdi som et isosbestic punkt.
Merk: representative tallene er vist i figur 2.
- Monter den farge fylte cellen på mikroskopet, og vent i 3 min for å senke cellene til bunnen.
- Den bakgrunns signal deteksjon og korreksjon metoder med celleområdet
Merk: det finnes to typer bakgrunner. En kommer fra cellene og den andre kommer fra refleksjon på coveret slip (cellen-fri bakgrunn). Begge bakgrunner må rettes opp i hvert eksperiment.- Monter Dye-frie celler i badekaret på mikroskopet og vent i 3 min å synke cellene til bunnen. Perfuse NADH-gratis ca2 +-gratis løsning for rundt 5 minutter.
Merk: alle infusjonshastighet er 2-3 mL/min ved 37 ° c.
Merk: Juster celle tall for å se rundt en celle per ett objektiv felt med 40x objektiv linse. - Angi at objektfeltet skal dekke den målrettede cellen.
- Etter at du har flyttet cellen ut av feltet, måler du bakgrunns signalene i det celle frie vinduet og angir dem som forskyvninger.
Merk: signalet betyr at lyssignalet oppdages i Foton telle system. - Returner cellen til utgangsposisjonen og mål celle bakgrunns signalene og celleområdet.
Merk: selv om det eksitasjon lyset filtreres med det bånd pass filteret, inneholder det fortsatt ganske store mengder av det filtrerte lyset. Dette lyset er spredt når du treffer cellene og forårsaker en betydelig bakgrunn signal fordi Foton telling systemet er svært følsom. Det må rettes opp.
Merk: celleområdet kan beregnes med et innspilt celle bilde og en tilgjengelig bildebehandlingsprogramvare. Enheten i celleområdet kan være en hvilken som helst enhet, inkludert piksel antall. Bare standardisering er nødvendig. - Gjenta fra 4.1.1 til 4.1.4 for 10 ganger for å få forholdet mellom celleområdet og celle bakgrunns signalene.
Merk: senere kan celle bakgrunns signalene beregnes fra celleområdet fra relasjonen. Siden den eksitasjon lyspæren blir aldrende, må denne prosedyren gjentas, i hvert fall, hver måned.
- Monter Dye-frie celler i badekaret på mikroskopet og vent i 3 min å synke cellene til bunnen. Perfuse NADH-gratis ca2 +-gratis løsning for rundt 5 minutter.
- Måling av R-faktorer
- Beregn RF med ligningen 4 fra signalene innhentet i avsnitt 4,2.
- Monter farge frie celler på mikroskopet og perfuse ca2 +-gratis løsning.
- Mål signalene som F361, 450, NADH, f400, 500, NADH, f361, 450, NADH, og F353, 500, NADH.
- Perfuse den Malate løsningen og gjenta 4.3.3. og måle signalene.
- Perfuse den pyruvat løsningen og gjenta 4.3.3. og måle signalene.
- Perfuse den Malate-pyruvat løsning og gjenta 4.3.3. og måle signalene.
- Perfuse den rotenon løsningen og gjenta 4.3.3. og måle signalene.
Merk: eksempelet på NADH-signalet innspilt på 5 mM pyruvat, 5 mM Malate pluss 5 mM pyruvat, og 10 μM rotenon tillegg er vist i Figur 3. - Beregn hver skråning på F361, 450, NADH vs. F400, 500, NADH og F361, 450, NADH vs. F353, 500, NADH. Som vist i Figur 3. Hver skråning indikerer RN1 og RN2.
5. valg av eksitasjon og utslipps lys for TMRE eller carboxy-SNARF-1
- Hvis TMRE for måling av mitokondrie potensialet ble brukt i tillegg bruke 530 NM eksitasjon bølgelengde og 590 NM utslipps bølgelengde.
- Hvis carboxy-SNARF-1 for måling av mitokondrie potensialet ble brukt i tillegg, bruk den eksitasjon bølgelengden til 540 NM og utslipps bølgelengder på 590 NM og 640 NM12.
6. valg av Kd -verdien av fura-2-FF
- Endringen av pH kan påvirke Kd verdier for ca2 + binding på FURA-2-FF10. Bruk Kd -verdien på 5,28 ved pH 7,5 for mitokondrier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mitokondrie ca2 + endringer på grunn av korreksjon10
Figur 4 viser endringene i [ca2 +]m før og etter rettelsen. Resultatene viste tydelig de vesentlige endringene i [ca2 +]m. Mitokondrie hvile kalsium konsentrasjon uten cytosolic ca2 + ([ca2 +]c) var 1,03 ± 0,13 μM (gjennomsnitt ± S.E., n = 32), og den maksimale [ca2 +]m ved 1-μM [ca2 +]c var 29,6 ± 1,61 μM ( gjennomsnittlig ± S.E., n = 33) (figur 5).
Samtidig måling av NADH, [ca2 +] og Ψm10
En positivt ladet TMRE kan distribueres i en membran potensiell avhengig måte. Membran potensialet kan beregnes ved hjelp av Nernst ligning med konsentrasjonen i hvert rom. Mitokondrie TMRA ble overvåket med en mengde 2-nM TMRE. Den første Ψm ble antatt å være − 150 mv, og endringen av Ψm ble beregnet basert på det. Anvendelsen av ca2 + redusert NADH men påvirket Ψm bare negligibly (figur 6).
Mitokondrie pH endringer av endringen i [ca2 +] m10
Mitokondrie pH med ytterligere lasting av carboxy-SNARF-1 ble overvåket etter ca2 + endringer (figur 7). Mitokondrie pH ble ikke påvirket av økningen i [ca2 +]m. Den hviler mitokondrie pH var 7,504 ± 0,047 (gjennomsnittlig ± S.E., n = 13). Fra disse resultatene var 5,28 μM den valgte Kd -verdien av fura-2-FF ved pH 7,5.
Figur 1: et microfluorometry system for multiparametric måling
Det skjematisk diagram av microfluorometry systemet ble vist. De monterte cellene ble visualisere via et CCD-kamera. Fire forskjellige utslipps lys ble oppdaget med fire eksportert pmts via et foton telle system. Dette tallet har blitt gjengitt med tillatelse fra The Korean Journal of fysiologi & farmakologi10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: identifisering av isosbestic poeng
(A) den røde pilen peker til isosbestic punktet på 450 nm utslipps bølgelengde. Fura-2 FF i den ikke-bundne tilstanden vises med en stiplet linje og i ca2 + bundet tilstand med en heltrukket linje. (B) den røde pilen peker på isosbestic punktet på 500 NM utslipps bølgelengde. (C) de trukket data av signalet ved 450 nm i ca2 +-frie forhold fra ca2 +-frie mettede forhold vises. (D) de trukket data av signalet ved 500 NM i ca2 +-frie forhold fra ca2 +-frie mettede forhold vises. (E) standard Avviks data fra graf C vises. (F) standard Avviks data fra graf D vises. Dette tallet har blitt gjengitt med tillatelse fra The Korean Journal of fysiologi & farmakologi10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: måling av RN -faktorer.
(A) endringer i NADH signalet uten fluorescerende fargestoff ved å anvende ulike mitokondrie underlag ble målt ved 361 NM eksitasjon og 450 nm utslipps bølgelengder. (B) NADH interferens i fura-2-FF-signalene, f-400 500 (∙ ∙ ∙) og f353 500 (—), ble overvåket samtidig. (C) forholdet mellom f-361450, NADH og f-400500, NADH (○) og mellom F-361450, NADH og f-353500, NADH (●) vises. Den oppnådde bakkene er representert som RN1 og RN2, henholdsvis. Dette tallet har blitt gjengitt med tillatelse fra The Korean Journal of fysiologi & farmakologi10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: resultater fra NADH og fura-2-FF korreksjon av interferens
Endringen av signalene fra før korreksjon (vist i venstre paneler) til etter korreksjon (vist i høyre panel). (A) NADH signaler på 450 nm utslipps bølgelengde. (B) fura-2-FF signaler på 500 NM utslipps bølgelengde. Figuren viser F400 (− −), F353 500 (----) og forholdet mellom FURA-2-FF (—). (C) mitokondrie kalsium konsentrasjon. Den røde stiplede linjen viser null. Dette tallet har blitt gjengitt med tillatelse fra The Korean Journal of fysiologi & farmakologi10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: hvile [ca2 +]m uten cytosolic ca2 + og maksimal steady state [ca2 +]m ved 1 μM cytosolic ca2 +
Mitokondrier ble strømførende for en pyruvat løsning. Steady state [ca2 +]m i en ca2 +-frie betingelser og i 1 μM ca2 + betingelser ble vist. Tillegg av 5 mM na+ gjenopprettet NADH og redusert [ca2 +]m til Baseline. Dette tallet har blitt gjengitt med tillatelse fra The Korean Journal of fysiologi & farmakologi10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: simultan måling av NADH, [ca2 +]mog Ψm
Mitokondrier ble strømførende for en pyruvat løsning. Endringene i NAHD, [ca2 +]m og Ψm ble vist. Tillegg av 1 μM ca2 + redusert NAHD og økt [ca2 +]m men Ψm ble ikke endret betraktelig. Dette tallet har blitt gjengitt med tillatelse fra The Korean Journal of fysiologi & farmakologi10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: simultan måling av NADH, [ca2 +]mog pH
Den gjentatte anvendelsen av ca2 + kan indusere reduksjon av NADH og økningen av [ca2 +]m men mitokondrie pH ble ikke påvirket av anvendelsen av ca2 +. Tillegg av na + kan returnere NADH og [ca2 +]m til Baseline. Dette tallet har blitt gjengitt med tillatelse fra The Korean Journal of fysiologi & farmakologi10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Navn på løsninger | Konsentrasjon (mM) | |||||||||
| KCl | HEPES | EGTA | CaCl2 | M | P | R | FCCP | Adp | Saponin | |
| Ca2 +-gratis | 150 | 10 | 1 | |||||||
| NADH-ledig | 150 | 10 | 1 | 0,01 | 0,1 | |||||
| Ca2 +-gratis | ||||||||||
| NADH-ledig | 135 | 10 | 1 | 0,01 | 0,1 | |||||
| Ca2 +-mettet | ||||||||||
| Saponin | 150 | 10 | 1 | 0,1 mg/ml | ||||||
| Malate | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| Pyruvat | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| Malate-pyruvat | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | |||||
| Rotenon | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | 0,01 | ||||
| Kultur medium | Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s medium (DMEM) | |||||||||
| Fargestoff lasting | Tilsett en mm fura-2-FF-AM Stock (16 mL) i kultur mediet (2 mL) | |||||||||
Tabell 1: løsninger
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden for korrigering av interferens ble vellykket utviklet for å måle signalene fra NADH-og fura-2-analogs. Eksakt måling av signalene er avgjørende for nøyaktig korreksjon. Imidlertid produserer den iboende natur fluorescerende enheten en bakgrunn signal som ikke er relatert til at av NADH av fura-2. Den høyeste kvalitet band-pass filter kan bare passere opp til 10− 8 av de uønskede bølgelengder av lyset. Imidlertid er det fluorescerende signalet fra en enkelt celle svært liten, og refleksjon av eksitasjon lyset etter at band-pass-filteret fortsatt er sterkt nok til å forurense de faktiske fluorescerende signalene. Derfor er forsiktig korrigering av bakgrunnen signalet nødvendig.
Fura-2 har en lessing problem å måle mitokondrie ca2 +. Først er det ikke lett å laste fargestoff spesielt inn i mitokondrier, og ikke-spesifikk lasting inn i en annen organelle kan være feilaktige. Mitokondrie ca2 + konsentrasjon er generelt høyere enn for stoffer, og bruk av fura-2-FF med høy Kd -verdi kan unngå forurensning av cytosolic ca2 + endringer. Den andre problematiske organelle er sarcoplasmic retikulum (SR). Fordelingen volumforskjellene (SR 3,5% vs. mitokondrier 34% − 36% i rotte ventrikkel myocytter)13,14 og fjerning av ATP i eksperimenter kan imidlertid kompensere for forurensning fra SR.
Våre kalibrerings ligning (formel 14 og 15) har mange fordelaktige egenskaper over Grynkiewicz ligningen15 som følger:
1) det krever bare tre parametere: KD, F400500, Max/f353500, Maxog Rmin.
2) det er linearitet av forholdet verdi til Ca2 + konsentrasjon ved en konstant pH.
3) det er en relativ feilfri parameter i F400500, maks/f353500, maks sammenlignet med SF2/sB215.
4) i formel 15, bare Kd og Rmin er nødvendig hvis isosbestic eksitasjon brukes.
5) kalibreringen prosedyren for å få parameteren er mye enklere med formel 15.
Det er imidlertid en begrensning fordi ca2 +-mettet fura-2-FF genererer en svært liten emisjon. Den forårsaker en feil. Den nye ligningen kan anvendes på [ca2 +] konsentrasjoner opp til 50x som av Kd.
Avslutningsvis ble en protokoll utviklet for å kunne løse det eksisterende problemet med NADH og fura-2-FF forstyrrelser. Denne metoden kan måle ca2 + Dynamics mer nøyaktig. Multiparametric målesystem, spesielt i mitokondrier, vil bidra til å forstå mitokondrie fysiologi i en kvantitativ måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av Basic Science Research program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av utdanningsdepartementet (2018R1A6A3A01011832), av vitenskapsdepartementet, IKT & Future Planning (NRF-2016M3C1A6936606) og av departementet for handel, industri & energi (10068076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipment, 640±11nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590±15nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500±20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipment, 450±30nm |
| Calcium chloride solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
| DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Sigma-aldrich | D5030 | Chemicals |
| EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid | Sigma-aldrich | E4378 | Chemicals |
| FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Chemicals |
| field diaphragm | Nikon | 86506 | Equipment |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | chemicals |
| Green tube | DWM | test tube | |
| HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| High-speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipment, 50:50 |
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Equipment, 750±100nm |
| Oil immersion lens | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipment |
| Photon counter unit | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
| Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936 | Chemicals |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-aldrich | P4494 | Chemicals |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
| Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemicals |
| TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Molecular probes | T669 | Chemicals |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Miyata, H., et al. Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes. American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).
- Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).
- Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium. Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).
- Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).
- Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
- Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes. Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).
- Brandes, R., Bers, D. M. Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae. Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).
- Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).
- Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat. Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).
- Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
- Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism. Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).
- Page, E. Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology. American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).
- Page, E., McCallister, L. P., Power, B. Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
