Summary
NADH 및 fura-2 유사체의 여기 및 방출 파장의 스펙트럼 중첩으로 인해[Ca2+]의 정량 적 측정 중에 라이브 셀의 두 화학 물질의 신호 간섭이 불가피합니다. 따라서, NADH 신호 간섭을 측정하는 새로운 온라인 보정 방법이개발되었다[Ca2+]
Abstract
[Ca2+]정량적으로 측정하기 위해 비메트릭 플루오로프로브인 fura-2 유사체가 자주 사용됩니다. 그러나, 염료 사용은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)로부터 주로 자가형광 간섭으로 인해 살아있는 세포에서 본질적으로 제한된다. 보다 구체적으로, 이것은 NADH의 대부분이 미토콘드리아에 있기 때문에 fura-2 유사체를 정량적으로 사용하여 미토콘드리아[Ca2+]를측정할 때 주요 장애물이다. 형광 염료 농도가 동일하면 특정 여기 강도가 동일한 방출 강도를 생성해야 합니다. 따라서, 두 개의 상이한 여기 파장의 방출 강도 비는 일정해야 한다. 이러한 원리에 기초하여, NADH 신호 간섭을 측정하는 새로운온라인 보정 방법이 개발되었으며, NADH 및 fura-2의 실제 신호 강도를 얻을 수 있다. 또한,[Ca2+]를계산하는 새로운 방정식은 400 nm에서 isosbestic 여기 또는 여기로 개발되었다. 이 방법을 사용하면 미토콘드리아 [Ca2+]의변화를 성공적으로 측정할 수 있습니다. 또한, 다른 일련의 여기 및 방출 파장의 경우, NADH,[Ca2+],및 pH 또는 미토콘드리아 막 전위(Θm)를포함하는 다중 파라미터를 동시에 측정할 수 있었다. 미토콘드리아[Ca2+] 및 Θm 또는 pH는 후라-2-FF 및 테트라메틸호다민 에틸 에스테르(TMRE) 또는 카르복시-세미나피-호르다플루오르-1(카르복시-SNARF-1)을 사용하여 측정하였다.
Introduction
세포 내 Ca2+의 중요한 역할은 널리 알려진1. [Ca2+]의정량화는 세포 생리 기능의 과정을 이해하는 데 필수적입니다. Fura-2 아날로그는 UV 범위(&400 nm)에서 흥분하기 때문에 매우 유용하며, 비율 측정 방법은 정량 측정에 적용될 수 있습니다. 따라서, pH, 막 전위 등과 같은 다른 생리학적 파라미터는 다른 형광 염료로 측정될 수 있다. 미토콘드리아Ca2+ 농도([Ca2+]m]범위는 0.08-20 μM2,3,4,5로알려졌다. fura-2 유사체 중에서 fura-2-FF는 [Ca2+]의 이 범위를 측정하는 데 적합합니다. 그러나, 살아있는 세포는 불행하게도 그들의 신진 대사 과정에 대한 NADH/NADPH를 포함하고, NADH는 fura-2 아날로그와 겹치는 여기 및 방출 스펙트럼 때문에 신호 간섭을 생성합니다. 이 간섭은 fura-2 유사체의 사용을 크게 제한합니다. 구체적으로, 유사체가 미토콘드리아[Ca2+]를측정하기 위해 적용되는 경우, NADH의 가장 높은 양이 미토콘드리아에 있기 때문에 이러한 간섭이 가장 큰 장애물이다. 이것은 NADH 변화가 미토콘드리아 막 전위(Θm)와관련이 있고 Θm의 변화가[Ca2+ ]m6,7,8에영향을 미치므로 더욱 복잡해져요. , 9. 또한,[Ca2+]m 역학을 공부하기 위해, NADH, Θm및 pH와 같은 다른 미토콘드리아 매개 변수의 상태를 아는 것이 필수적이다.
450 nm 및 500 nm에서의 방출은 353 nm, 361 nm 및 400 nm에서 NADH 및 fura-2-FF로부터의 신호를 포함하고, 수학식은 다음과 같다. 본 명세서에서, 353 nm 및 361 nm는 각각 450 nm 및 500 nm에서 배출을 위한 후라-2-FF의 이등산 지점이다.
F361,450 = F361,450, NADH + F361,450,후라 방정식 1
F353,500 = F353,500, NADH + F353,500,후라 방정식 2
F400,500 = F400,500, NADH + F400,500, 후라 방정식 3
여기서 Fx, y는 x-nm 여기, Fx, y, NADH는 순수한 NADH 의존 방출 강도를 나타내고, Fx, y, Fura는 순수한 후라-2-FF 의존 방출 강도를 나타냅니다. 형광 염료의 동일한 농도하에서, 특정 여기 강도는 동일한 방출 강도를 생성해야 한다. 따라서, 두 개의 상이한 여기 파장의 방출 강도 비는 일정해야 한다. Ca2+ 및 fura-2는 NADH 형광 특성에 영향을 미치지 않았다; 따라서 NADH의 450 nm 및 500 nm에서의 방출 비율은 임의의 여기 파장에서 일정하였다. 동일한 규칙은 NADH 또는[Ca2+]가후라-2-FF의 방출 및 여기 스펙트럼에 영향을 미치지 않는다는 가정에 기초하여 fura-2-FF에 사용될 수 있다. 그러나,Ca2+는 후라-2-FF 방출의 스펙트럼 변화를 일으켰다. 따라서Ca2 +의효과를 제거하려면Ca2 +와무관한 isosbestic 여기를 사용해야합니다. 각 방출 파장(즉, 450 nm 및 500 nm)은 상이한 isosbestic 포인트를 가지며, 우리의 실험 설정에서, 500 nm에서 353 nm 및 450 nm에서 361 nm이 선택되었다. 이 로부터 다음 방정식은 유효한10.
Rf = F361,450, 후라/ F353,500, 후라 방정식 4
RN1 = F400,500, NADH/F361,450, NADH 방정식 5
RN2 = F353,500, NADH/F361,450, NADH 방정식 6
이러한 상수의 경우 (수학식 1) 및 (수학식 3)의 다음 방정식이 유효합니다.
F361,450 = F361,450, NADH + Rf × F353,500, 후라 방정식 7
F353,450 = RN2 × F361,450, NADH + F353,500, 후라 방정식 8
F400,500 = RN1 × F361,450, NADH + F400,500, 후라 방정식 9
이러한 방정식으로부터, Rf,RN1및 RN2가 공지된 경우, NADH 및 fura-2의 순수한 신호는 다음과 같이 얻어질 수 있다.
F361,450,NADH = (F361,450 - RF × F353,500)/(1− RF ×R N2)방정식 10
F353,500,후라 = (RN2 × F361,450 - F353,500)/(RF × RN2 - 1) 방정식 11
F400,500,후라 = F400,500 - RN1 × F361,450, NADH 방정식 12
R후라 = F353,500, 후라/ F400,500, 후라 방정식 13
Ca2+-바운드 형태의 후라-2-FF는 400 nm 여기 파장에서 실질적으로 비형광이었다. 이 속성에 따라 다음과 같은 새 교정 방정식을 파생할 수 있습니다.
[Ca2+ +] = KD ∙ (F400,500, 최대/ F353,500, 최대)× (R후라 - R분)방정식 14
여기서Kd는 해리 상수, F400,500, 최대 및 F353,500, 최대는 각각 400 nm 및 353 nm에서 여기와 500 nm에서 방출 된 신호의 최대 값이며, Rmin은 Ca 2의 최소 RFura입니다. +- 무료 상태. 이소성 여기가 사용되었기 때문에, 방정식은 다음과 같이 더 단순화 될 수있다.
[Ca2+ +] = KD ∙ (1 / R분)∙ (R후라 - R분)방정식 15
따라서 [Ca2+]를 계산하려면 Kd 및 R최소 값만 필요합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 실험 프로토콜은 지역 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 솔루션 준비
- 단 하나 갓 고립된 심장 근세포11를준비하십시오.
참고: 각 실험실에는 다른 세포 저장 솔루션이 있을 수 있습니다. 여기서, 근세포는 배양 배지(DMEM)에 저장된다. - Ca2+-free 용액 100 mL을 준비하십시오(표 1).
- 50 mL 비커에 배양 배지 50 mL을 준비합니다. Aliquot 5 mL및 37°C에서 수조에 넣습니다. 남은 용액을 실온에서 유지하십시오.
- 50 mL의 사포닌을 50 mL의 Ca2+-free 용액에 추가하여 사포닌 용액 50 mL을 준비하십시오.
참고 : 사포닌은 심장 근세포를 투과시키고, 세포실 구획을 제거하고, 미토콘드리아 형광만을 시각화하는 데 사용됩니다. - 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해된 1mM의 후라-2-FF-AM 16 μL을 준비한다.
참고: DMSO에 용해된 후라-2-FF-AM의 1mMM 스톡 용액을 2mL 튜브에 16 μL로 만듭니다. 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오. - NADH 프리Ca2+-무첨가 용액 50 mL을 준비(표 1)및 NADH 프리Ca2+-포화 용액 50 mL(표 1)때 등변 점을 측정한다. KOH를 사용하여 pH를 7.0으로 조정합니다.
참고: NADH 프리Ca2+-free 용액(표 1)에는미토콘드리아에서 NADH를 최소화하기 위해 미토콘드리아 기질없이 10 μM FCCP 및 100 μM ADP가 포함되어 있습니다. - NADH 보정 인자 측정에 사용할 50 mL의Ca2+-free 솔루션, 50 mL의 말레이트 용액, 50 mL의 말레이트-피루바트 용액 및 50 mL의 로테네 용액을 준비합니다(표1).
2. 미토콘드리아에 플루오로프로브 로딩 절차
- 배양 배지의 2 mL을 1mM fura-2-FF-AM의 16 μL에 첨가하여 염료 로딩 용액을 준비한다.
참고: 형광 염료는 빛 아래에서 깨지기 쉽습니다. 사용 직전에 솔루션을 준비하십시오. 형광염료를 함유한 용액을 어두운 곳에 보관하십시오. 후라-2-FF-AM의 최종 농도는 8 μM이다. 카복시-SNARF-1을 사용한 경우, 2 μM 카르복시-SNARF-1-AM으로 염료 로딩 솔루션을 준비하십시오. - 단리된 세포의 2 mL을 가지고 5 mL 시험관에 똑바로 놓습니다.
- 근세포가 바닥으로 가라앉을 때까지 15분 기다렸다가 상판을 제거합니다.
참고: 상한제에는 세포 파편이 포함될 수 있습니다. 세포 손상을 피하기 위해 튜브를 원심 분리하지 마십시오. - 염료 로딩 솔루션의 2mL를 추가합니다.
- 4 °C에서 60 분 동안 세포로 염료 로딩 용액을 배양하십시오.
- 이어서, 시험관을 37°C 수조에 30분 동안 똑바로 놓는다.
- 상온액을 제거하고, 37°C의 미리 온난화된 배양 배지의 4 mL를 첨가한다. 37°C 수조에서 60분 동안 세포를 배양합니다.
- 마지막으로, 상류를 제거하고 실온에서 배양 배지 4 mL를 추가하고 튜브를 실온에서 유지하십시오.
3. 다분체 측정 시스템 도입
참고: 그림 1은 전체 시스템의 다이어그램을 보여줍니다.
- 여기 광원의 경우 3ms 이내의 빛을 변경할 수 있는 빠른 단색화기(폴리크롬 II)를 사용하십시오.
- 신호 강도를 높이기 위해 반전된 현미경으로 오일 침지 렌즈(40x, NA 1.3)를 사용하십시오.
- 근적외선 필터와 CCD(충전 결합 장치) 카메라를 사용하여 형광 신호 간섭 없이 물체 필드를 모니터링합니다.
- 개체 필드 이미지를 캡처하여 영역을 가져옵니다.
- 배경을 줄이기 위한 셀을 표시하기 위해 필드 다이어프램으로 모니터 화면의 개체 필드를 조정합니다.
- 각 밴드 패스 필터(450, 500, 590 및 640 nm)가 있는 4개의 광증배튜브를 사용하여 광자 계수 방법으로 방출 파장을 감지합니다. 적절한 이색 거울을 사용하여 방출 라이트를 분할하고 리디렉션합니다.
참고: 여기 표시등은 방출 광에 비해 매우 강합니다. 따라서 가장 높은 차단 특성을 가진 밴드 패스 필터를 선택하여 배경을 줄입니다. 광자 계수 시스템은 PMT, 광자 카운터 유닛 및 고속 카운터의 조합으로 구성됩니다. 시스템을 제어하고 데이터를 샘플링하기 위해 맞춤형 드라이빙 소프트웨어가 사용되었습니다. 이 메서드를 다른 시스템과 적용할 방법을 찾아야 합니다.
4. 다분측정 시스템을 통한 NADH 보정 방법
- 후라-2-FF의 이소성 지점의 식별.
참고: 많은 보고는 형광 특성이 세포에서 변경된다는 것을 명시했습니다. 따라서, 모든 절차를 수행하여 상체에서 간섭을 보정하기 위해 파라미터를 구한다.- 염료가 장착된 세포를 현미경으로 장착하고 세포를 바닥으로 가라앉힐 때까지 3분 동안 기다립니다.
참고: 40x 대물 렌즈로 하나의 대물필드당 하나의 셀을 볼 수 있도록 셀 수를 조정합니다. - 37°C에서 NADH 프리 Ca2+-무첨가 용액을 주입하십시오.
- 세포를 표적으로 한 후, 섹션 4.1에 도시된 바와 같이 무세포 배경 및 세포 영역을 측정한다. 셀 영역에서 셀 배경을 계산합니다.
참고: 각 실험에서 두 배경 신호를 모두 수정해야 합니다. - 사포닌 용액을 60s에 퍼우고 NADH가 없는 Ca2+-free 용액으로 되돌아갑니다.
- 0.1 nm 단계로 350 nm에서 365 nm까지의 여기 스캔에 의해 450 nm 및 500 nm에서 Fura-2-FF 방출 신호를 동시에 측정합니다.
- NADH 프리 Ca2+-포화 용액을 주입하고 4.2.5 단계를 반복하십시오.
- Ca2+-채도가 낮은 솔루션의 신호를 Ca2+-free 조건의 신호에서 뺍니다.
- 다른 단일 심장 근세포와 함께 4.2.2에서 4.2.7까지의 절차를 반복하십시오.
참고: 신호 강도가 약해지면 4.2.1에서 반복합니다. 적어도 5 개의 다른 세포에 대한 절차를 반복하십시오. - 획득한 모든 신호에서 각 여기에서 방출의 표준 편차를 계산하고 isosbestic 점으로 최소 표준 편차(SD) 값을 보여주는 여기 파장을 선택합니다.
참고: 대표적인 수치는 그림 2에나와 있습니다.
- 염료가 장착된 세포를 현미경으로 장착하고 세포를 바닥으로 가라앉힐 때까지 3분 동안 기다립니다.
- 셀 영역이 있는 배경 신호 감지 및 보정 방법
참고: 배경에는 두 가지 종류가 있습니다. 하나는 셀에서 오고 다른 하나는 커버 슬립 (셀없는 배경)에 반사에서 온다. 각 실험에서 두 배경을 수정해야 합니다.- 염료가없는 세포를 현미경으로 욕조에 장착하고 세포를 바닥으로 가라 앉힐 때까지 3 분 동안 기다립니다. NADH 프리 Ca2+-free 솔루션을 약 5분 동안 사용하십시오.
참고: 모든 용액 관류 속도는 37°C에서 2-3 mL/min입니다.
참고: 40x 대물 렌즈로 하나의 대물필드당 하나의 셀을 볼 수 있도록 셀 수를 조정합니다. - 대상 셀을 덮도록 개체 필드를 설정합니다.
- 셀을 필드 밖으로 이동한 후 셀없는 창의 배경 신호를 측정하고 오프셋으로 설정합니다.
참고: 신호는 광자 계수 시스템에서 감지되는 신호입니다. - 셀을 초기 위치로 되돌리고 셀 배경 신호와 셀 영역을 측정합니다.
참고: 여기 표시등이 밴드패스 필터로 필터링되더라도 여전히 많은 양의 필터링된 라이트가 포함되어 있습니다. 이 빛은 세포를 칠 때 분산되며 광자 계수 시스템이 매우 민감하기 때문에 상당한 배경 신호를 발생시킵니다. 수정해야 합니다.
참고: 셀 영역은 캡처된 셀 이미지와 사용 가능한 이미징 소프트웨어로 계산될 수 있습니다. 셀 영역의 단위는 픽셀 수를 포함한 임의의 단위일 수 있다. 저기 표준화가 필요합니다. - 4.1.1에서 4.1.4까지 10회 반복하여 세포 영역과 세포 배경 신호 사이의 관계를 얻었다.
참고: 나중에, 세포 배경 신호는 관계에서 셀 영역에서 계산될 수 있다. 여기 전구가 노화되기 때문에이 절차는 적어도 매달 반복되어야합니다.
- 염료가없는 세포를 현미경으로 욕조에 장착하고 세포를 바닥으로 가라 앉힐 때까지 3 분 동안 기다립니다. NADH 프리 Ca2+-free 솔루션을 약 5분 동안 사용하십시오.
- R 요인의 측정
- 섹션 4.2에서 얻은 신호에서 수학식 4로 Rf를 계산합니다.
- 염료가 없는 세포를 현미경에 장착하고 Ca2+-free 용액을 주입합니다.
- F361, 450, NADH,F400, 500, NADH,F361, 450, NADH및 F353, 500,NADH와 같은 신호를 측정합니다.
- malate 솔루션을 침투하고 4.3.3을 반복하십시오. 신호를 측정합니다.
- 피루바테 용액을 침전시키고 4.3.3을 반복합니다. 신호를 측정합니다.
- 말레이트-피루바테 용액을 주입하고 4.3.3을 반복합니다. 신호를 측정합니다.
- 로테네 용액을 주입하고 4.3.3을 반복합니다. 신호를 측정합니다.
참고: 5 mM 피루바테, 5 mM malate 플러스 5 mM 피루바테 및 10 μM 로테논 첨가에 기록된 NADH 신호의 예는 도 3에도시되어 있다. - F361, 450, NADH 대 F400, 500, NADH 및 F361, 450, NADH 대 F353, 500, NADH의각 경사를 계산합니다. 그림 3에도시된 바와 같이 . 각 경사는 RN1 및 RN2를나타냅니다.
5. TMRE 또는 카복시-SNARF-1의 여기 및 방출 표시등 선택
- 미토콘드리아 전위를 측정하기 위한 TMRE가 추가로 사용된 경우, 530 nm 여기 파장 및 590 nm 방출 파장을 사용한다.
- 미토콘드리아 전위를 측정하기 위한 카복시-SNARF-1이 추가로 사용된 경우, 540 nm의 여기 파장 및 590 nm 및 640 nm12의방출 파장을 사용한다.
6. 후라-2-FF의 Kd 값 선택
- pH의 변화는 fura-2-FF10에대한Ca2+ 바인딩에 대한 Kd 값에 영향을 줄 수 있습니다. 미토콘드리아의 경우 pH 7.5에서 5.28의 Kd 값을 사용합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
미토콘드리아 Ca2+ 수정으로 인한 변경10
그림 4는 보정 전후의[Ca2+]m의 변화를 보여줍니다. 결과는[Ca2+]m의상당한 변화를 명확하게 보여 주었다. 시토솔산 Ca2+([Ca 2+]c)가없는 미토콘드리아 휴식 칼슘 농도는 1.03±0.13 μM(평균 ±S.E., n=32)이었고, 1-μM에서[Ca2+]m의 최대는 29.6±1.61 μM(0.6 ±1.61 μM) 평균 ± S.E., n = 33)(그림 5).
NADH, [Ca2+ +], 및 Θm10의 동시 측정
양전하 TMRE는 막 전위 의존적 방식으로 분포될 수 있다. 멤브레인 전위는 각 구획의 농도와 함께 Nernst의 방정식을 사용하여 계산할 수 있습니다. 미토콘드리아 TMRA를 2-nM TMRE의 관류로 모니터링하였습니다. 초기θ m은 -150 mV로 가정되었고, Θm의 변화는 이를 기반으로 계산되었다. Ca2+ 적용은 NADH를 감소하지만, 단지 무시할 수(그림 6)에영향을 미쳤다.
[Ca2++]m10의 변화에 의해 미토콘드리아 pH 변화
카복시-SNARF-1의 추가 로딩을 가진 미토콘드리아 pH는Ca2+ 변경에 따라 모니터링되었다(그림7). 미토콘드리아 pH는[Ca2+]m의증가에 영향을 받지 않았다. 나머지 미토콘드리아 pH는 7.504±0.047이었다(평균 ±S.E., n=13). 이들 결과로부터, 5.28 μM은 pH 7.5에서 후라-2-FF의 선택된 Kd 값이었다.
그림 1: 다분측정 측정을 위한 미세 플루오롬피측정 시스템
미세불형계시스템의 개략적 도면이 도시되었다. 장착된 셀은 CCD 카메라를 통해 시각화되었습니다. 광자 계수 시스템을 통해 4개의 PMT로 4개의 다른 방출 표시등이 검출되었습니다. 이 수치는 한국생리학회지10의허가를 받아 재현되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 이소성 비결점 식별
(A)빨간색 화살표는 450 nm 방출 파장의 등산 지점을 가리킵니다. 비바운드 상태의 Fura-2 FF는 점선으로 표시되고Ca2+ 경계 상태에 실선이 있습니다. (B)적색 화살표는 500 nm 방출 파장에서 등산지점을 가리킨다. (C)Ca 2+ -free 포화 조건에서 Ca2+-free 조건에서450 nm에서 신호의 빼낸 데이터가 표시됩니다. (D)Ca2+-free 포화 조건에서 500 nm에서 신호의빼낸 데이터가 표시됩니다. (e)그래프 C의 표준 편차 데이터가 표시됩니다. (F)그래프 D의 표준 편차 데이터가 표시됩니다. 이 수치는 한국생리학회지10의허가를 받아 재현되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: RN 요인의 측정.
(a)다양한 미토콘드리아 기판을 적용하여 형광 염료가 없는 NADH 신호의 변화를 361 nm 여기 및 450 nm 방출 파장에서 측정하였다. (B)후라-2-FF 신호, F400,500(∙∙) 및 F353,500(--)의 NADH 간섭을 동시에 모니터링하였다. (C)F361,450, NADH 및 F400,500, NADH (○) 및 F361,450, NADH 및 F353,500,NADH(●) 사이의 관계가 도시된다. 얻어진 경사는 각각 RN1 및 RN2로표시됩니다. 이 수치는 한국생리학회지10의허가를 받아 재현되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: NADH 및 후라-2-FF 간섭 보정 결과
보정 전(왼쪽 패널에 표시됨)에서 보정 후(오른쪽 패널에 표시)로 의 신호 변경. (A)NADH는 450 nm 방출 파장에서 신호를 보렌다. (B)500 nm 방출 파장에서 Fura-2-FF 신호. 이 그림은 F400,500 (− -), F353,500 (----), 그리고 fura-2-FF (-)의 비율을 보여줍니다. (C)미토콘드리아 칼슘 농도. 빨간색 점선은 0을 나타냅니다. 이 수치는 한국생리학회지10의허가를 받아 재현되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 휴식 [Ca2+]m 없이 세포질 Ca2+ 최대 정상 상태 [Ca2+]m 에서 1 μM cytosolic Ca2+
미토콘드리아는 말레이트 피루바테 용액의 관류로 활력을 불어넣습니다. 정상 상태[Ca2+]m은 Ca2+-free 조건 및 1 μMCa2+ 조건에서 나타내었다. 5 mM Na+의 첨가는 NADH를 회수하고[Ca2+]m을 기준선으로 감소시켰다. 이 수치는 한국생리학회지10의허가를 받아 재현되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: NADH, [Ca2+] m및 Θm의 동시 측정
미토콘드리아는 말레이트 피루바테 용액의 관류로 활력을 불어넣습니다. NAHD, [Ca2+ ]m 및 Θm의 변화가 도시되었다. 1 μMCa2+ 첨가는 NAHD를 감소시키고 [Ca2+]m을 증가시켰지만, Θm은 크게 변하지 않았다. 이 수치는 한국생리학회지10의허가를 받아 재현되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: NADH, [Ca2+] m및 pH의 동시 측정
Ca2+의 반복적용은 NADH의 감소와[Ca2+]m의 증가를 유도할 수 있었지만 미토콘드리아 pH는Ca2+의적용에 의해 영향을 받지 않았다. Na+를 추가하면 NADH 및[Ca2+]m을 기준선으로 되돌릴 수 있습니다. 이 수치는 한국생리학회지10의허가를 받아 재현되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 솔루션 이름 | 농도 (mM) | |||||||||
| KCl | 헤페스 (주)는 | EGTA | CaCl2 | M | P | R | FCCP | Adp | 사포닌 | |
| Ca2+-무료 | 150 | 10 | 1 | |||||||
| NADH 프리 | 150 | 10 | 1 | 0.01 | 0.1 | |||||
| Ca2+-무료 | ||||||||||
| NADH 프리 | 135 | 10 | 1 | 0.01 | 0.1 | |||||
| Ca2+-포화 | ||||||||||
| 사포닌 | 150 | 10 | 1 | 0.1mg / ml | ||||||
| Malate | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| 피루바테 | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| 말레이트 피루바테 | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | |||||
| 로테네 주 | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | 0.01 | ||||
| 문화 매체 | 덜베코의 수정된 독수리의 매체 (DMEM) | |||||||||
| 염료 로딩 | 배양 매체(2mL)에 1mM 후라-2-FF-AM 스톡(16mL)을 추가 | |||||||||
표 1: 솔루션
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
간섭 보정 방법은 NADH 및 fura-2 유사체의 신호를 측정하기 위해 성공적으로 개발되었습니다. 정확한 교정을 위해서는 신호의 정확한 측정이 필수적입니다. 그러나, 형광 장치의 본질적인 특성은 후라-2의 NADH와 관련이 없는 배경 신호를 생성한다. 최고 품질의 밴드 패스 필터는 빛의 원치 않는 파장의 10-8까지 만 통과 할 수 있습니다. 그러나 단일 셀의 형광 신호는 매우 작고, 밴드 패스 필터 후 여기 빛의 반사는 실제 형광 신호를 오염시킬 만큼 충분히 강합니다. 따라서 배경 신호를 주의 깊게 수정해야 합니다.
Fura-2는 미토콘드리아 Ca2+측정에 로딩 문제가 있습니다. 첫째, 염료를 미토콘드리아에 구체적으로 적재하는 것은 쉽지 않으며, 다른 세포기관에 비특이적 로딩이 잘못될 수 있다. 미토콘드리아Ca2+ 농도는 일반적으로 시토졸보다 높고, 높은 Kd 값을 가진 fura-2-FF를 사용하면 세포질Ca2+ 변화의 오염을 피할 수 있었다. 다른 문제가 있는 세포기관은 석상 망상(SR)입니다. 그러나, 분포부피차이(SR 3.5% 대 미토콘드리아 34%-36%의 쥐심실 근세포)13,14 및 실험에서 ATP의 제거는 SR로부터의 오염을 보상할 수 있었다.
우리의 교정 방정식 (방정식 14 및 15)은 다음과 같이 Grynkiewicz의 방정식15에 비해 많은 유리한 특성을 가지고 있습니다 :
1) Kd, F400,500, 최대/ F353,500, 최대및 Rmin: 그것은 단지 세 가지 매개 변수가 필요합니다.
2) 일정한 pH에서 Ca2+ 농도에 대한 비율 값의 선형성이 있다.
3) F400,500, 최대/F353,500, Sf2/Sb2 15에비해 상대적인 오류없는 매개 변수가 있습니다.
4) 수학식 15에서는 isosbestic 여기를 사용하는 경우 Kd 및 R분만 필요합니다.
5) 파라미터를 얻기 위한 교정 절차는 수학식 15를 사용하면 훨씬 간단합니다.
그러나,Ca2+-포화 후라-2-FF가 매우 작은 방출을 생성하기 때문에 한계가 있다. 오류가 발생합니다. 새로운 방정식은 [Ca2+] 농도에 Kd의최대 50배까지 적용할 수 있습니다.
결론적으로, NADH 및 fura-2-FF 간섭의 기존 문제를 성공적으로 해결하기 위한 프로토콜이 개발되었다. 이 방법은Ca2+ 역학을 보다 정확하게 측정할 수 있습니다. 다파라메트릭 측정 시스템은 특히 미토콘드리아에서 미토콘드리아 생리학을 정량적으로 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 교육부(2018R1A6A3A0111832)가 지원하는 국립연구재단(NRF)을 통해 기초과학 연구 프로그램(NRF-2016M3C1A696606)의 지원을 받았습니다. 산업통상자원부(10068076)에 의해
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipment, 640±11nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590±15nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500±20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipment, 450±30nm |
| Calcium chloride solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
| DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Sigma-aldrich | D5030 | Chemicals |
| EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid | Sigma-aldrich | E4378 | Chemicals |
| FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Chemicals |
| field diaphragm | Nikon | 86506 | Equipment |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | chemicals |
| Green tube | DWM | test tube | |
| HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| High-speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipment, 50:50 |
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Equipment, 750±100nm |
| Oil immersion lens | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipment |
| Photon counter unit | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
| Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936 | Chemicals |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-aldrich | P4494 | Chemicals |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
| Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemicals |
| TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Molecular probes | T669 | Chemicals |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Miyata, H., et al. Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes. American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).
- Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).
- Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium. Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).
- Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).
- Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
- Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes. Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).
- Brandes, R., Bers, D. M. Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae. Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).
- Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).
- Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat. Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).
- Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
- Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism. Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).
- Page, E. Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology. American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).
- Page, E., McCallister, L. P., Power, B. Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
