A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Vanwege de spectrale overlapping van de excitatie-en emissie golflengten van NADH en Fura-2-analogen, is de signaalstoring van beide chemicaliën in levende cellen onvermijdelijk tijdens de kwantitatieve meting van [ca.^{2 +}]. Zo werd een nieuwe online correctiemethode van NADH-signaalinterferentie op maat [CA^{2 +}] ontwikkeld.

Abstract

Om [ca.^{2 +}] kwantitatief te meten, worden Fura-2-analogen, die ratiometrische fluoroprobes zijn, vaak gebruikt. Het gebruik van de kleurstof is echter intrinsiek beperkt in levende cellen vanwege interferentie met autofluorescentie, voornamelijk van Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH). Specifieker, dit is een groot obstakel bij het meten van de mitochondriale [CA^{2 +}] kwantitatief met behulp van Fura-2 analogen omdat de meerderheid van NADH in de mitochondriën. Als de fluorescerende kleurstof concentratie hetzelfde is, moet een bepaalde excitatie-intensiteit dezelfde emissie-intensiteit opleveren. Daarom moet de emissie-intensiteit verhouding van twee verschillende excitatie golflengten constant zijn. Op basis van dit principe is een nieuwe online correctiemethode van NADH-signaalinterferentie voor het meten van [CA^{2 +}] ontwikkeld, en de werkelijke signaalintensiteit van NADH en Fura-2 kunnen worden verkregen. Verder werd een nieuwe vergelijking voor de berekening van [CA^{2 +}] ontwikkeld met isosbestic excitatie of excitatie bij 400 nm. Met deze methode, veranderingen in de mitochondriale [CA^{2 +}] kan met succes worden gemeten. Bovendien, met een andere set van de excitatie en emissie golflengten, meerdere parameters, met inbegrip van NADH, [CA^{2 +}], en pH of Mitochondriale membraanpotentiaal (Ψ_m), gelijktijdig kunnen worden gemeten. Mitochondriale [CA^{2 +}] en Ψ_m of pH werden gemeten met behulp van FURA-2-FF en tetramethylrhodamine ethyl ester (tmre) of Carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (Carboxy-snarf-1).

Introduction

De belangrijke rol van intracellulaire CA^{2 +} is algemeen bekend¹. De kwantificering van [CA^{2 +}] is essentieel om de processen van de cellulaire fysiologische functies te begrijpen. Fura-2-analogen zijn zeer nuttig omdat ze enthousiast zijn in het UV-bereik (< 400 nm), en de ratiometrische methode kan worden toegepast voor de kwantitatieve meting. Daarom kunnen andere fysiologische parameters zoals pH, membraanpotentiaal, enz., worden gemeten met andere fluorescerende kleurstoffen. De mitochondriale CA^{2 +} concentratie ([CA^{. 2 +}]_m) was naar verluidt 0,08 − 20^{μM 2,3,4,5}. Bij Fura-2-analogen is Fura-2-FF geschikt voor het meten van dit bereik van [CA^{2 +}]. Echter, de levende cellen bevatten helaas NADH/NADPH voor hun metabole processen, en NADH genereert signaalinterferentie vanwege de overlappende excitatie en emissiespectra met de Fura-2 analoog. Deze interferentie beperkt het gebruik van Fura-2-analogen sterk. Specifiek, als de analoge wordt toegepast om te meten mitochondriale [CA^{2 +}], deze interferentie is het grootste obstakel, omdat de hoogste hoeveelheid NADH in de mitochondriën. Dit wordt verder bemoeilijkt door NADH veranderingen gerelateerd aan het Mitochondriale membraanpotentiaal (Ψ_m) en de verandering van Ψ_m beïnvloedt [CA^{2 +}]_m^{6,7,8 , 9}. Bovendien is het voor het bestuderen van [CA^{2 +}]_m dynamiek essentieel om de status van andere mitochondriale parameters te kennen, zoals NADH, Ψ_men Ph.

De emissies bij 450 nm en 500 nm met excitaties bij 353 nm, 361 nm en 400 nm bevatten de signalen van NADH en Fura-2-FF, en de vergelijkingen zijn als volgt. Hierin zijn 353 nm en 361 nm de isosbestic punten van Fura-2-FF voor emissies bij 450 nm en bij respectievelijk 500 nm.

F_361.450 = f_{361450, NADH} + f_{361450, Fura} vergelijking 1
F_353.500 = f_{353500, NADH} + f_{353500, Fura} vergelijking 2
F_400.500 = f_{400500, NADH} + f_{400500, Fura} vergelijking 3

waar F_{x, y} de gemeten emissie-intensiteit is bij y-nm door x-nm excitatie, f_{x, y, is NADH} de zuivere NADH-afhankelijke emissie-intensiteit, en F_{x, y, Fura} vertegenwoordigt de zuivere Fura-2-FF-afhankelijke emissie-intensiteit. Onder dezelfde concentratie van de fluorescerende kleurstof moet een bepaalde excitatie intensiteit dezelfde emissie-intensiteit opleveren. Daarom moet de emissie-intensiteit verhouding van twee verschillende excitatie golflengten constant zijn. CA^{2 +} en Fura-2 hadden geen invloed op de eigenschappen van NADH fluorescentie; Daarom was de verhouding van de emissie bij 450 nm en bij 500 nm van NADH constant bij elke excitatie golflengte. Dezelfde regel kan worden gebruikt voor Fura-2-FF op basis van de veronderstelling dat NADH of [CA^{2 +}] heeft geen invloed op de emissie en excitatie spectra van Fura-2-FF. CA^{2 +} veroorzaakte echter een spectrale verschuiving van de Fura-2-FF-emissie. Daarom, om het effect van CA^{2 +}te verwijderen, moet isosbestic excitatie, die onafhankelijk is van CA^{2 +}, worden gebruikt. Elke emissie golflengte (d.w.z. 450 nm en 500 nm) heeft een verschillend isosbestic punt, en uit onze experimentele opstelling werden 353 Nm bij 500 nm en 361 Nm bij 450 nm gekozen. Hieruit zijn de volgende vergelijkingen geldig¹⁰.

R_f = f_{361450, Fura}/F_{353500, Fura} vergelijking 4
R_N1 = f_{400500, NADH}/F_{361450, NADH} vergelijking 5
R_N2 = f_{353500, NADH}/F_{361450, NADH} vergelijking 6

Met deze constanten zijn de volgende vergelijkingen van (vergelijking 1) (vergelijking 2) en (vergelijking 3) geldig.

F_361.450 = f_{361450, NADH} + R_f × f_{353500, Fura} vergelijking 7
F_353.450 = R_N2 × f_{361450, NADH} + f_{353500, Fura} vergelijking 8
F_400.500 = R_N1 × f_{361450, NADH} + F_{400500, Fura} vergelijking 9

Uit deze vergelijkingen, indien R_f, r_N1en r_N2 bekend zijn, kunnen zuivere signalen van NADH en Fura-2 als volgt worden verkregen.

F_{361450, NADH} = (f_361.450 -r_f × f_353.500)/(1 − r_f × r_N2) vergelijking 10
F_{353500, Fura} = (r_N2 × F_361.450 − f_353.500)/(r_F × r_N2 − 1) vergelijking 11
F_{400500, Fura} = f_400.500 − R_N1 × f_{361450, NADH} vergelijking 12
R_Fura = F_{353500, Fura}/F_{400500, Fura} vergelijking 13

De CA^{2 +}-gebonden vorm van Fura-2-FF was praktisch niet-fluorescerend bij de 400 nm excitatie golflengte. Op basis van deze eigenschap kan de volgende nieuwe kalibratie vergelijking worden afgeleid.

[CA^{2 +}] = K_d ∙ (F_{400500, Max}/f_{353500, Max}) × (R_Fura − r_min) vergelijking 14

waarbij K_d een dissociatieconstante is, F_{400500, Max} en f_{353500, Max} zijn de maximale waarden van de uitgestoten signalen bij 500 nm met excitaties bij respectievelijk 400 nm en 353 nm, en r_min is de minimale r_Fura in CA^{2 +}-gratis conditie. Aangezien de isosbestic-excitaties werden gebruikt, kan de vergelijking als volgt verder worden vereenvoudigd.

[CA^{2 +}] = K_d ∙ (1/R_min) ∙ (r_Fura − R_min) vergelijking 15

Daarom zijn alleen K_d -en R_min -waarden vereist om [CA^{2 +}] te berekenen.

Protocol

Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door het lokale Comité voor dierenverzorging en-gebruik. 1. voorbereiding van de oplossing Bereid één vers geïsoleerde cardiale myocytes11.Opmerking: elk laboratorium kan een andere oplossing voor celopslag hebben. Hier worden de myocyten opgeslagen in kweekmedium (DMEM). Bereid 100 mL CA2 +-vrije oplossing (tabel 1). Bereid 50 mL kweekmedium in een bekerg…

Representative Results

Mitochondriale CA2 + wijzigingen als gevolg van correctie10Figuur 4 toont de wijzigingen in [CA2 +]m voor en na de correctie. De resultaten toonden duidelijk de substantiële veranderingen in [ca.2 +]m. De mitochondriale rust calciumconcentratie zonder cytosolische CA2 + ([ca.2 +]c) was 1,03 ± 0,13 μm (gemiddelde ± 1g , n = 32), en het maximum [CA2 +] m bij[ca….

Discussion

De storings correctiemethode werd met succes ontwikkeld voor het meten van de signalen van NADH en Fura-2 analogen. Exacte meting van de signalen is essentieel voor exacte correctie. De inherente aard van het fluorescerende apparaat produceert echter een achtergrond signaal dat geen verband houdt met dat van NADH van Fura-2. De hoogste kwaliteit band-pass filter kan alleen passeren tot 10^{− 8} van de ongewenste golflengten van het licht. Het fluorescerende signaal van een enkele cel is echter erg klein, en de …

Materials

2 mL eppendorf tube	Axygen	MCT-200-C	2 mL Tube
AD/DA converter	Instrutech	ITC-18	Equipment
ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma-aldrich	A5285	Chemicals
Band pass filter	Ealing Electro-Optics, Inc	35-3920	Equipment, 640±11nm
Band pass filter	Omega Optical	690-9823	Equipment, 590±15nm
Band pass filter	Omega Optical	500DF20-9916	Equipment, 500±20nm
Band pass filter	Chroma Technology Corp.	60685	Equipment, 450±30nm
Calcium chloride solution	Sigma-aldrich	21114	Chemicals
carboxy-SNARF-1(AM)	Invitrogen	C1272	Chemicals
Charge-coupled device (CCD) camera	Philips	FTM1800NH/HGI	Equipment
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	86009	Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	567DCXRU	Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	480dclp	Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm
Dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	20728	Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma-aldrich	154938	Chemicals
DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Sigma-aldrich	D5030	Chemicals
EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid	Sigma-aldrich	E4378	Chemicals
FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone	Sigma-aldrich	21857	Chemicals
field diaphragm	Nikon	86506	Equipment
Fura-2-FF(AM)	TEFLABS	137	chemicals
Green tube	DWM		test tube
HEPES,  4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)	Sigma-aldrich	H3375	Chemicals
High-speed counter	National Instruments	NI-6022	Equipment
Hot mirror	Chroma Technology Corp.	21002	Equipment, 50:50
Inverted microscope	Nikon	TE-300	Equipment
Malate	Sigma-aldrich	27606	Chemicals
Near infrared filter	Chroma Technology Corp.	D750/100X	Equipment, 750±100nm
Oil immersion lens	Nikon	MRF01400	40x, NA 1.3; Equipment
Photon counter unit	Hamamatsu	C3866	Equipment
Photon multiplier tube	Hamamatsu	R2949	Equipment
Polychrome II	Till Photonics	SA3/MG04	Equipment
Potassium chloride	Merck	1.04936	Chemicals
Potassium hydroxide solution	Sigma-aldrich	P4494	Chemicals
Pyruvate	Sigma-aldrich	107360	Chemicals
Rotenone	Sigma-aldrich	R8875	Chemicals
Saponin	Sigma-aldrich	S4521	Chemicals
TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester	Molecular probes	T669	Chemicals