Summary
Vanwege de spectrale overlapping van de excitatie-en emissie golflengten van NADH en Fura-2-analogen, is de signaalstoring van beide chemicaliën in levende cellen onvermijdelijk tijdens de kwantitatieve meting van [ca.2 +]. Zo werd een nieuwe online correctiemethode van NADH-signaalinterferentie op maat [CA2 +] ontwikkeld.
Abstract
Om [ca.2 +] kwantitatief te meten, worden Fura-2-analogen, die ratiometrische fluoroprobes zijn, vaak gebruikt. Het gebruik van de kleurstof is echter intrinsiek beperkt in levende cellen vanwege interferentie met autofluorescentie, voornamelijk van Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH). Specifieker, dit is een groot obstakel bij het meten van de mitochondriale [CA2 +] kwantitatief met behulp van Fura-2 analogen omdat de meerderheid van NADH in de mitochondriën. Als de fluorescerende kleurstof concentratie hetzelfde is, moet een bepaalde excitatie-intensiteit dezelfde emissie-intensiteit opleveren. Daarom moet de emissie-intensiteit verhouding van twee verschillende excitatie golflengten constant zijn. Op basis van dit principe is een nieuwe online correctiemethode van NADH-signaalinterferentie voor het meten van [CA2 +] ontwikkeld, en de werkelijke signaalintensiteit van NADH en Fura-2 kunnen worden verkregen. Verder werd een nieuwe vergelijking voor de berekening van [CA2 +] ontwikkeld met isosbestic excitatie of excitatie bij 400 nm. Met deze methode, veranderingen in de mitochondriale [CA2 +] kan met succes worden gemeten. Bovendien, met een andere set van de excitatie en emissie golflengten, meerdere parameters, met inbegrip van NADH, [CA2 +], en pH of Mitochondriale membraanpotentiaal (Ψm), gelijktijdig kunnen worden gemeten. Mitochondriale [CA2 +] en Ψm of pH werden gemeten met behulp van FURA-2-FF en tetramethylrhodamine ethyl ester (tmre) of Carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (Carboxy-snarf-1).
Introduction
De belangrijke rol van intracellulaire CA2 + is algemeen bekend1. De kwantificering van [CA2 +] is essentieel om de processen van de cellulaire fysiologische functies te begrijpen. Fura-2-analogen zijn zeer nuttig omdat ze enthousiast zijn in het UV-bereik (< 400 nm), en de ratiometrische methode kan worden toegepast voor de kwantitatieve meting. Daarom kunnen andere fysiologische parameters zoals pH, membraanpotentiaal, enz., worden gemeten met andere fluorescerende kleurstoffen. De mitochondriale CA2 + concentratie ([CA. 2 +]m) was naar verluidt 0,08 − 20μM 2,3,4,5. Bij Fura-2-analogen is Fura-2-FF geschikt voor het meten van dit bereik van [CA2 +]. Echter, de levende cellen bevatten helaas NADH/NADPH voor hun metabole processen, en NADH genereert signaalinterferentie vanwege de overlappende excitatie en emissiespectra met de Fura-2 analoog. Deze interferentie beperkt het gebruik van Fura-2-analogen sterk. Specifiek, als de analoge wordt toegepast om te meten mitochondriale [CA2 +], deze interferentie is het grootste obstakel, omdat de hoogste hoeveelheid NADH in de mitochondriën. Dit wordt verder bemoeilijkt door NADH veranderingen gerelateerd aan het Mitochondriale membraanpotentiaal (Ψm) en de verandering van Ψm beïnvloedt [CA2 +]m6,7,8 , 9. Bovendien is het voor het bestuderen van [CA2 +]m dynamiek essentieel om de status van andere mitochondriale parameters te kennen, zoals NADH, Ψmen Ph.
De emissies bij 450 nm en 500 nm met excitaties bij 353 nm, 361 nm en 400 nm bevatten de signalen van NADH en Fura-2-FF, en de vergelijkingen zijn als volgt. Hierin zijn 353 nm en 361 nm de isosbestic punten van Fura-2-FF voor emissies bij 450 nm en bij respectievelijk 500 nm.
F361.450 = f361450, NADH + f361450, Fura vergelijking 1
F353.500 = f353500, NADH + f353500, Fura vergelijking 2
F400.500 = f400500, NADH + f400500, Fura vergelijking 3
waar Fx, y de gemeten emissie-intensiteit is bij y-nm door x-nm excitatie, fx, y, is NADH de zuivere NADH-afhankelijke emissie-intensiteit, en Fx, y, Fura vertegenwoordigt de zuivere Fura-2-FF-afhankelijke emissie-intensiteit. Onder dezelfde concentratie van de fluorescerende kleurstof moet een bepaalde excitatie intensiteit dezelfde emissie-intensiteit opleveren. Daarom moet de emissie-intensiteit verhouding van twee verschillende excitatie golflengten constant zijn. CA2 + en Fura-2 hadden geen invloed op de eigenschappen van NADH fluorescentie; Daarom was de verhouding van de emissie bij 450 nm en bij 500 nm van NADH constant bij elke excitatie golflengte. Dezelfde regel kan worden gebruikt voor Fura-2-FF op basis van de veronderstelling dat NADH of [CA2 +] heeft geen invloed op de emissie en excitatie spectra van Fura-2-FF. CA2 + veroorzaakte echter een spectrale verschuiving van de Fura-2-FF-emissie. Daarom, om het effect van CA2 +te verwijderen, moet isosbestic excitatie, die onafhankelijk is van CA2 +, worden gebruikt. Elke emissie golflengte (d.w.z. 450 nm en 500 nm) heeft een verschillend isosbestic punt, en uit onze experimentele opstelling werden 353 Nm bij 500 nm en 361 Nm bij 450 nm gekozen. Hieruit zijn de volgende vergelijkingen geldig10.
Rf = f361450, Fura/F353500, Fura vergelijking 4
RN1 = f400500, NADH/F361450, NADH vergelijking 5
RN2 = f353500, NADH/F361450, NADH vergelijking 6
Met deze constanten zijn de volgende vergelijkingen van (vergelijking 1) (vergelijking 2) en (vergelijking 3) geldig.
F361.450 = f361450, NADH + Rf × f353500, Fura vergelijking 7
F353.450 = RN2 × f361450, NADH + f353500, Fura vergelijking 8
F400.500 = RN1 × f361450, NADH + F400500, Fura vergelijking 9
Uit deze vergelijkingen, indien Rf, rN1en rN2 bekend zijn, kunnen zuivere signalen van NADH en Fura-2 als volgt worden verkregen.
F361450, NADH = (f361.450 -rf × f353.500)/(1 − rf × rN2) vergelijking 10
F353500, Fura = (rN2 × F361.450 − f353.500)/(rF × rN2 − 1) vergelijking 11
F400500, Fura = f400.500 − RN1 × f361450, NADH vergelijking 12
RFura = F353500, Fura/F400500, Fura vergelijking 13
De CA2 +-gebonden vorm van Fura-2-FF was praktisch niet-fluorescerend bij de 400 nm excitatie golflengte. Op basis van deze eigenschap kan de volgende nieuwe kalibratie vergelijking worden afgeleid.
[CA2 +] = Kd ∙ (F400500, Max/f353500, Max) × (RFura − rmin) vergelijking 14
waarbij Kd een dissociatieconstante is, F400500, Max en f353500, Max zijn de maximale waarden van de uitgestoten signalen bij 500 nm met excitaties bij respectievelijk 400 nm en 353 nm, en rmin is de minimale rFura in CA2 +-gratis conditie. Aangezien de isosbestic-excitaties werden gebruikt, kan de vergelijking als volgt verder worden vereenvoudigd.
[CA2 +] = Kd ∙ (1/Rmin) ∙ (rFura − Rmin) vergelijking 15
Daarom zijn alleen Kd -en Rmin -waarden vereist om [CA2 +] te berekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door het lokale Comité voor dierenverzorging en-gebruik.
1. voorbereiding van de oplossing
- Bereid één vers geïsoleerde cardiale myocytes11.
Opmerking: elk laboratorium kan een andere oplossing voor celopslag hebben. Hier worden de myocyten opgeslagen in kweekmedium (DMEM). - Bereid 100 mL CA2 +-vrije oplossing (tabel 1).
- Bereid 50 mL kweekmedium in een bekerglas van 50 mL. Aliquot 5 mL en zet het in een waterbad van 37 °C. Houd de resterende oplossing bij kamertemperatuur.
- Bereid 50 mL van de saponine oplossing door 5 mg saponine toe te voegen aan 50 mL CA2 +-vrije oplossing.
Opmerking: saponine wordt gebruikt voor cardiale myocyten, om cytosolische compartimenten te verwijderen, en om de mitochondriale fluorescentie alleen te visualiseren. - Bereid 16 μL van 1 mM Fura-2-FF-AM opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO).
Opmerking: Maak 1 mM stockoplossing van Fura-2-FF-AM opgelost in DMSO en aliquot 16 μL in een 2 mL Tube. Bewaar ze bij-20 °C tot het gebruik. - Bereid 50 mL NADH-vrije CA2 +-vrije oplossing (tabel 1) en 50 ml NADH-vrije CA2 +verzadigde oplossing (tabel 1) wanneer isosbestic punten moeten worden gemeten. Stel de pH in op 7,0 met KOH.
Opmerking: NADH-gratis CA2 +-vrije oplossing (tabel 1) bevat 10 μM FCCP en 100 μM ADP zonder enige mitochondriale substraten om NADH in mitochondriën te minimaliseren. - Bereid 50 ml van CA2 +-vrije oplossing, 50 ml malaat oplossing, 50 ml pyruvaat oplossing, 50 ml malaat-pyruvaat oplossing, en 50 ml rotenon oplossing voor NADH correctiefactor metingen (tabel 1).
2. fluoroprobe laadprocedure in de mitochondriën
- Bereid de kleurstof laadoplossing door 2 mL van het kweekmedium toe te voegen aan 16 μL van 1 mM Fura-2-FF-AM.
Opmerking: fluorescerende kleurstof is kwetsbaar onder het licht. Bereid de oplossing vlak voor gebruik. Bewaar de oplossing met de fluorescerende kleurstof op een donkere plaats. De uiteindelijke concentratie van Fura-2-FF-AM is 8 μM. Als Carboxy-SNARF-1 werd gebruikt, bereidt u de kleurstof ladings oplossing voor met 2 μM Carboxy-SNARF-1-AM. - Neem 2 mL van de geïsoleerde cellen en plaats in een 5 mL reageerbuis in een rechtopstaande positie.
- Wacht 15 minuten tot de myocyten naar beneden zinken en verwijder het supernatant.
Opmerking: het supernatant kan celresten bevatten. Centrifugeer de buis niet om celbeschadiging te voorkomen. - Voeg 2 mL van de kleurstof laadoplossing toe.
- Inbroed de kleurstof laadoplossing met cellen voor 60 min bij 4 °C.
- Zet de reageerbuis dan 30 min rechtop in een waterbad van 37 °C.
- Verwijder het supernatant en voeg 4 mL voorverwarmde kweekmedium van 37 °C toe. Inincuberen de cellen voor 60 min in een 37 °C waterbad.
- Verwijder ten slotte het supernatant, Voeg 4 mL kweekmedium toe bij kamertemperatuur en houd de buis op kamertemperatuur.
3. introductie van het multiparametrische meetsysteem
Opmerking: afbeelding 1 toont een diagram van het hele systeem.
- Gebruik voor een excitatie lichtbron een snelle Monochromator (polychroom II) die het licht binnen 3 MS kan veranderen.
- Gebruik een olie Dompel lens (40x, NA 1,3) met een omgekeerde Microscoop om de signaalintensiteit te verhogen.
- Gebruik een Near-Infrared filter en een CCD-camera (Charge-gekoppelde apparaat) om het object veld te bewaken zonder fluorescerende signaalinterferentie.
- Leg de afbeelding van het object veld vast om het gebied te krijgen.
- Pas het object veld in het monitor scherm aan met een velddiafragma om de cel te tonen om de achtergrond te verkleinen.
- Gebruik vier fotomultiplicator-buizen met elk band-pass-filter (450, 500, 590 en 640 nm) om emissie golflengten te detecteren met de telmethode foton. Gebruik de juiste dichroïde spiegels om het emissie licht te splitsen en om te buigen.
Opmerking: het excitatie lampje is zeer sterk in vergelijking met het emissie licht. Kies dus de band-pass filter met de hoogste Blokkeer karakteristieken om de achtergrond te verkleinen. Een foton tellings systeem bestaat uit een combinatie van pmts, foton teller units en een High-Speed teller. Om het systeem te controleren en om de gegevens te proeven, werd een Custom-Made rijsoftware gebruikt. Het is noodzakelijk een manier te vinden om deze methode met andere systemen toe te passen.
4. NADH correctiemethoden met een multiparametrisch meetsysteem
- Identificatie van de isosbestic punten van Fura-2-FF in situ.
Opmerking: veel rapporten hebben verklaard dat fluorescentie kenmerken in cellen worden gewijzigd. Voer daarom alle procedures uit om de parameters te verkrijgen om de storing in situ te corrigeren.- Monteer de kleurstof geladen cel op de Microscoop en wacht 3 min om de cellen naar de bodem te zinken.
Opmerking: pas de celnummers aan om ongeveer één cel per objectief veld te zien met een 40x objectief objectief. - Parfuseer de NADH-vrije CA2 +-vrije oplossing bij 37 °c.
- Na het targeten van cel meet u de celvrije achtergrond en het celgebied zoals weergegeven in paragraaf 4,1. Bereken de celachtergrond uit het celgebied.
Opmerking: beide achtergrond signalen moeten in elk experiment worden gecorrigeerd. - Parfuseer de saponine oplossing voor 60 s en keer terug naar de NADH-vrije CA2 +-vrije oplossing.
- Meet Fura-2-FF-uitgezonden signalen bij 450 nm en 500 nm gelijktijdig door de excitatie scan van 350 nm naar 365 nm met de 0,1 nm-stap.
- Parfuseer de NADH-vrije CA2 +-verzadigde oplossing en herhaal stap 4.2.5.
- Aftrekken van de signalen in de CA2 +-verzadigde oplossing van de signalen in de CA2 +-vrije voorwaarden.
- Herhaal de procedures van 4.2.2 tot 4.2.7 met andere enkelvoudige cardiale myocyten.
Opmerking: als de signaalintensiteit zwakker wordt, herhaalt u vanaf 4.2.1. Herhaal de procedure voor ten minste 5 verschillende cellen. - Bereken vanaf alle verkregen signalen de standaarddeviaties van de emissie bij elke excitatie en kies de excitatie golflengte die de minimale standaarddeviatie (SD)-waarde als een isosbestic-punt weergeeft.
Opmerking: de representatieve cijfers worden weergegeven in Figuur 2.
- Monteer de kleurstof geladen cel op de Microscoop en wacht 3 min om de cellen naar de bodem te zinken.
- De achtergrond Signaaldetectie en de correctiemethoden met het celgebied
Opmerking: er zijn twee soorten achtergronden. Een komt uit de cellen en de andere komt van de reflectie op de cover slip (de cel-vrije achtergrond). Beide achtergronden moeten worden gecorrigeerd in elk experiment.- Monteer de kleurstof vrije cellen in het bad op de Microscoop en wacht 3 minuten om de cellen naar de bodem te zinken. Perfuse NADH-gratis CA2 +-gratis oplossing voor ongeveer 5 minuten.
Opmerking: alle perfusie snelheid van de oplossing is 2-3 mL/min bij 37 °C.
Opmerking: pas de celnummers aan om ongeveer één cel per objectief veld te zien met een 40x objectief objectief. - Stel het veldobject in om de beoogde cel te bedekken.
- Nadat u de cel uit het veld hebt verplaatst, meet u de achtergrond signalen van het cel-vrije venster en stelt u deze in als offsets.
Opmerking: het signaal betekent dat het lichtsignaal in het foon telsysteem wordt gedetecteerd. - Retourneer de cel naar de oorspronkelijke positie en meet de celachtergrond signalen en het celgebied.
Opmerking: Hoewel het excitatie lampje met het band pass filter wordt gefilterd, bevat het nog steeds een vrij grote hoeveelheid gefilterd licht. Dit licht wordt gedispergeerd bij het raken van de cellen en veroorzaakt een aanzienlijk achtergrond signaal, omdat het telsysteem van foton zeer gevoelig is. Het moet worden gecorrigeerd.
Opmerking: het celgebied kan worden berekend met een vastgelegde celafbeelding en een beschikbare beeldvormings software. De eenheid van het celgebied kan elke eenheid zijn, inclusief het aantal pixels. Alleen standaardisatie is noodzakelijk. - Herhaal van 4.1.1 tot 4.1.4 gedurende 10 keer om de relatie tussen het celgebied en de achtergrond signalen van de cel te verkrijgen.
Notes: later kunnen de celachtergrond signalen worden berekend op basis van het celgebied van de relatie. Aangezien de excitatie gloeilamp veroudert, moet deze procedure worden herhaald, tenminste, elke maand.
- Monteer de kleurstof vrije cellen in het bad op de Microscoop en wacht 3 minuten om de cellen naar de bodem te zinken. Perfuse NADH-gratis CA2 +-gratis oplossing voor ongeveer 5 minuten.
- Meting van R-factoren
- Bereken RF met de vergelijking 4 van de signalen verkregen in punt 4,2.
- Monteer de kleurstof vrije cellen op de Microscoop en parfumeer de CA2 +-vrije oplossing.
- Meet de signalen zoals F361, 450, nadh, f400, 500, NADH, f361, 450, NADH, en f353, 500, NADH.
- Parfumeer de malaat oplossing en herhaal 4.3.3. en meet de signalen.
- Parfumeer de pyruvaat oplossing en herhaal 4.3.3. en meet de signalen.
- Parfuseer de Malate-pyruvate oplossing en herhaal 4.3.3. en meet de signalen.
- Parfuseer de rotenon-oplossing en herhaal 4.3.3. en meet de signalen.
Opmerking: het voorbeeld van het NADH-signaal opgenomen op 5 mm pyruvate, 5 mm malaat plus 5 mm pyruvate en 10 μM rotenon-toevoeging wordt weergegeven in Figuur 3. - Bereken elke helling van F361, 450, nadh vs. f400, 500, NADH en f361, 450, NADH vs. f353, 500, NADH. Zoals weergegeven in Figuur 3. Elke helling geeft RN1 en rN2aan.
5. selectie van de excitatie en het emissie licht voor TMRE of Carboxy-SNARF-1
- Als ook TMRE voor het meten van het mitochondriale potentieel werd gebruikt, gebruik maken van de 530 nm excitatie golflengte en de 590 nm emissie golflengte.
- Als Carboxy-SNARF-1 voor het meten van het mitochondriale potentieel werd gebruikt in aanvulling, gebruik maken van de excitatie golflengte van 540 nm en emissie golflengten van 590 nm en 640 nm12.
6. selectie van de Kd -waarde van Fura-2-FF
- De verandering van pH kan invloed hebben op Kd -waarden voor CA2 + binding op FURA-2-FF10. Gebruik de Kd -waarde van 5,28 bij pH 7,5 voor de mitochondriën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mitochondriale CA2 + wijzigingen als gevolg van correctie10
Figuur 4 toont de wijzigingen in [CA2 +]m voor en na de correctie. De resultaten toonden duidelijk de substantiële veranderingen in [ca.2 +]m. De mitochondriale rust calciumconcentratie zonder cytosolische CA2 + ([ca.2 +]c) was 1,03 ± 0,13 μm (gemiddelde ± 1g , n = 32), en het maximum [CA2 +] m bij[ca.2 +]c was 29,6 ± 1,61 μM ( gemiddelde ± VSO, n = 33) (Figuur 5).
Gelijktijdige meting van NADH, [CA2 +] en Ψm10
Een positief opgeladen TMRE kan worden gedistribueerd in een membraanpotentiaal afhankelijke manier. Membraanpotentiaal kan worden berekend met behulp van de vergelijking van de Nernst met de concentratie in elk compartiment. De mitochondriale TMRA werd gemonitord met de perfusie van 2-nM TMRE. De initiële Ψm werd uitgegaan van − 150 mv, en de verandering van Ψm werd berekend op basis van die. De toepassing van CA2 + daalde NADH maar beïnvloede Ψm alleen verwaarloosbaar (Figuur 6).
Mitochondriale pH veranderingen door de verandering in [CA2 +] m10
De mitochondriale pH met het extra laden van Carboxy-SNARF-1 werd gemonitord na veranderingen in CA2 + (Figuur 7). De mitochondriale pH werd niet beïnvloed door de toename van [ca.2 +]m. De mitochondriale pH in rust was 7,504 ± 0,047 (gemiddeld ± VSO, n = 13). Uit deze resultaten was 5,28 μM de gekozen Kd -waarde van Fura-2-FF bij pH 7,5.
Figuur 1: een microfluorometrisch systeem voor multiparametrische meting
Het schematische schema van het microfluorometrie systeem werd getoond. De gemonteerde cellen werden gevisualiseerd via een CCD-camera. Vier verschillende emissie lichten werden gedetecteerd met vier PMTs via een foor telsysteem. Dit cijfer is gereproduceerd met toestemming van het Koreaanse Journal of Fysiologie & farmacologie10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: identificatie van isosbestic punten
A) de rode pijl wijst naar het isosbestic-punt bij de emissie golflengte van 450 nm. Fura-2 FF in de niet-afhankelijke staat wordt weergegeven met een gestippelde lijn en in de CA2 + afhankelijke staat met een ononderbroken lijn. B) de rode pijl wijst op het isosbestic-punt bij de emissie golflengte van 500 nm. C) de afgetrokken gegevens van het signaal bij 450 nm in CA2 +-vrije condities van CA2 +-vrije verzadigde condities worden weergegeven. D) de afgetrokken gegevens van het signaal bij 500 nm in CA2 +-vrije condities van CA2 +-vrije verzadigde condities worden weergegeven. (E) de standaarddeviatie gegevens van grafiek C worden weergegeven. F) de standaarddeviatie gegevens van grafiek D worden weergegeven. Dit cijfer is gereproduceerd met toestemming van het Koreaanse Journal of Fysiologie & farmacologie10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: meting van RN -factoren.
A) veranderingen in het NADH-signaal zonder fluorescerende kleurstof door toepassing van verschillende mitochondriale substraten werden gemeten bij 361 nm excitatie en 450 nm emissie golflengten. B) de interferentie van NADH in de Fura-2-FF-signalen, f400.500 (∙ ∙ ∙) en f353.500 (—), werden gelijktijdig gemonitord. C) de relaties tussen f361450, NADH en f400500, NADH (○) en tussen F361450, NADH en f353500, NADH (●) worden weergegeven. De verkregen hellingen worden respectievelijk RN1 en rN2weergegeven. Dit cijfer is gereproduceerd met toestemming van het Koreaanse Journal of Fysiologie & farmacologie10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: resultaten van NADH en Fura-2-FF interferentie correctie
De verandering van de signalen van vóór de correctie (getoond in de linker panelen) na de correctie (getoond in de rechter panelen). A) NADH-signalen bij de emissie golflengte van 450 nm. B) Fura-2-FF-signalen bij de emissie golflengte van 500 nm. De figuur toont F400, 500 (− −), F353.500 (----) en de verhouding van FURA-2-FF (—). C) de mitochondriale calciumconcentratie. De rode stippellijn geeft het nulpunt aan. Dit cijfer is gereproduceerd met toestemming van het Koreaanse Journal of Fysiologie & farmacologie10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: rust [CA. 2 +]m zonder cytosolischeca 2 + en maximale steady state [CA2 +]m bij 1 μM cytosolische CA2 +
Mitochondriën werden energiek met de perfusie van Malate-pyruvate oplossing. De steady state [CA2 +]m in een CA2 +-vrije condities en in 1 μM CA2 + voorwaarden werden getoond. De toevoeging van 5 mM na+ herstelde NADH en verminderde [ca.2 +]m naar de baseline. Dit cijfer is gereproduceerd met toestemming van het Koreaanse Journal of Fysiologie & farmacologie10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: gelijktijdige meting van NADH, [CA2 +]men Ψm
Mitochondriën werden energiek met de perfusie van Malate-pyruvate oplossing. De veranderingen van NAHD, [CA2 +]m en Ψm werden getoond. De toevoeging van 1 μM CA2 + daalde nahd en verhoogde [CA2 +]m maar Ψm werd niet significant veranderd. Dit cijfer is gereproduceerd met toestemming van het Koreaanse Journal of Fysiologie & farmacologie10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: gelijktijdige meting van NADH, [CA2 +]men pH
De herhaalde toepassing van CA2 + kan leiden tot de afname van NADH en de toename van [CA2 +]m , maar de mitochondriale pH werd niet beïnvloed door de toepassing van CA2 +. De toevoeging van na + kan de NADH en [CA2 +]m naar de baseline teruggeven. Dit cijfer is gereproduceerd met toestemming van het Koreaanse Journal of Fysiologie & farmacologie10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Naam van oplossingen | Concentratie (mM) | |||||||||
| Kcl | HEPES | EGTA | CaCl2 | M | P | R | FCCP | Adp | Saponine | |
| CA2 +-gratis | 150 | 10 | 1 | |||||||
| NADH-gratis | 150 | 10 | 1 | 0,01 | 0,1 | |||||
| CA2 +-gratis | ||||||||||
| NADH-gratis | 135 | 10 | 1 | 0,01 | 0,1 | |||||
| CA2 +-verzadigd | ||||||||||
| Saponine | 150 | 10 | 1 | 0,1 mg/ml | ||||||
| Malate | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| Pyruvaat | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| Malate-pyruvate | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | |||||
| Rotenon | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | 0,01 | ||||
| Cultuur medium | Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) | |||||||||
| Dye-loading | Voeg een 1mM Fura-2-FF-AM voorraad (16 mL) in het kweekmedium (2 mL) | |||||||||
Tabel 1: oplossingen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De storings correctiemethode werd met succes ontwikkeld voor het meten van de signalen van NADH en Fura-2 analogen. Exacte meting van de signalen is essentieel voor exacte correctie. De inherente aard van het fluorescerende apparaat produceert echter een achtergrond signaal dat geen verband houdt met dat van NADH van Fura-2. De hoogste kwaliteit band-pass filter kan alleen passeren tot 10− 8 van de ongewenste golflengten van het licht. Het fluorescerende signaal van een enkele cel is echter erg klein, en de reflectie van het excitatie lampje na de band-pass-filter is nog steeds sterk genoeg om de werkelijke fluorescerende signalen te besmetten. Daarom is een zorgvuldige correctie van het achtergrond signaal noodzakelijk.
Fura-2 heeft een laad probleem voor het meten van de mitochondriale CA2 +. Ten eerste is het niet gemakkelijk om de kleurstof specifiek in de mitochondriën te laden, en niet-specifieke lading in een andere organel kan onjuist zijn. Mitochondriale CA2 + concentratie is over het algemeen hoger dan die van de cytosol, en het gebruik van Fura-2-FF met een hoge Kd -waarde kan de besmetting van cytosolische CA2 + veranderingen te voorkomen. De andere problematische organel is het sarcoplasmische reticulum (SR). Echter, de verdeling volumeverschillen (SR 3,5% vs. mitochondriën 34% − 36% in rat ventriculaire myocyten)13,14 en de verwijdering van ATP in experimenten kan compenseren voor de besmetting van SR.
Onze ijkvergelijking (vergelijking 14 en 15) heeft veel gunstige eigenschappen ten opzichte van Grynkiewicz vergelijking15 als volgt:
1) het vereist slechts drie parameters: KD, F400500, Max/f353500, Max, en Rmin.
2) er is lineariteit van de verhouding waarde aan de Ca2 + concentratie met een constante pH.
3) er is een relatieve foutvrije parameter in F400500, Max/f353500, Max vergeleken met SF2/sB215.
4) in vergelijking 15 zijn alleen Kd en Rmin vereist als isosbestic excitatie wordt gebruikt.
5) de kalibratieprocedure voor het verkrijgen van de parameter is veel eenvoudiger met vergelijking 15.
Echter, er is een beperking omdat CA2 +-verzadigde Fura-2-FF genereert een zeer kleine emissie. Dit veroorzaakt een fout. De nieuwe vergelijking kan worden toegepast op concentraties van [CA2 +] tot 50x die van Kd.
Tot slot, een protocol werd ontwikkeld om het bestaande probleem van NADH en Fura-2-FF interferentie met succes op te lossen. Deze methode kan CA2 + Dynamics nauwkeuriger meten. Multiparametrisch meetsysteem, met name in de mitochondriën, zal helpen de mitochondriale fysiologie op een kwantitatieve manier te begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd deels ondersteund door het basisprogramma voor wetenschappelijk onderzoek via de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van onderwijs (2018R1A6A3A01011832), door het ministerie van Wetenschappen, ICT & toekomstige planning (NRF-2016M3C1A6936606) en door het ministerie van handel, industrie & energie (10068076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipment, 640±11nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590±15nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500±20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipment, 450±30nm |
| Calcium chloride solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
| DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Sigma-aldrich | D5030 | Chemicals |
| EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid | Sigma-aldrich | E4378 | Chemicals |
| FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Chemicals |
| field diaphragm | Nikon | 86506 | Equipment |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | chemicals |
| Green tube | DWM | test tube | |
| HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| High-speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipment, 50:50 |
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Equipment, 750±100nm |
| Oil immersion lens | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipment |
| Photon counter unit | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
| Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936 | Chemicals |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-aldrich | P4494 | Chemicals |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
| Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemicals |
| TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Molecular probes | T669 | Chemicals |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Miyata, H., et al. Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes. American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).
- Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).
- Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium. Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).
- Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).
- Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
- Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes. Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).
- Brandes, R., Bers, D. M. Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae. Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).
- Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).
- Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat. Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).
- Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
- Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism. Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).
- Page, E. Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology. American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).
- Page, E., McCallister, L. P., Power, B. Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
