Summary
Aufgrund der spektralen Überlappung der Anregungs- und Emissionswellenlängen von NADH- und Fura-2-Analogen ist die Signalinterferenz beider Chemikalien in lebenden Zellen bei der quantitativen Messung von [Ca2+ ]unvermeidbar. So wurde eine neuartige Online-Korrekturmethode der NADH-Signalinterferenz zur Messung [Ca2+] entwickelt.
Abstract
Zur quantitativ [Ca2+] werden häufig Fura-2-Analoga verwendet, die ratiometrische Fluorosonden sind. Allerdings ist die Verwendung von Farbstoffen in lebenden Zellen aufgrund von Autofluoreszenzstörungen, hauptsächlich durch Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH), an sich beschränkt. Genauer gesagt ist dies ein großes Hindernis bei der Messung der mitochondrialen [Ca2+] quantitativ mit Fura-2 Analoga, da die Mehrheit der NADH in den Mitochondrien ist. Wenn die Fluoreszenzfarbstoffkonzentration gleich ist, sollte eine bestimmte Anregungsintensität die gleiche Emissionsintensität erzeugen. Daher sollte das Emissionsintensitätsverhältnis von zwei verschiedenen Anregungswellenlängen konstant sein. Basierend auf diesem Prinzip wurde eine neuartige Online-Korrekturmethode der NADH-Signalinterferenz zur Messung [Ca2+] entwickelt, und die tatsächliche Signalintensität von NADH und Fura-2 kann erreicht werden. Darüber hinaus wurde eine neuartige Gleichung zur Berechnung [Ca2+] mit isosbestischer Anregung oder Anregung bei 400 nm entwickelt. Mit dieser Methode konnten Veränderungen in mitochondrialen [Ca2+] erfolgreich gemessen werden. Darüber hinaus konnten bei einem anderen Satz der Anregungs- und Emissionswellenlängen mehrere Parameter, einschließlich NADH, [Ca2+], und pH- oder mitochondriales Membranpotential(m) gleichzeitig gemessen werden. Mitochondrial [Ca2+] undm oder pH wurden mit Fura-2-FF und Tetramethylrhodinethylester (TMRE) oder Carboxy-Seminaphtorhodafluor-1 (carboxy-SNARF-1) gemessen.
Introduction
Die bedeutende Rolle der intrazellulären Ca2+ ist weithin bekannt1. Die Quantifizierung von [Ca2+] ist wesentlich, um die Prozesse der zellulären physiologischen Funktionen zu verstehen. Fura-2-Analoga sind sehr nützlich, da sie im UV-Bereich (<400 nm) angeregt werden und die ratiometrische Methode für die quantitative Messung angewendet werden kann. Daher können andere physiologische Parameter wie pH,H,H., Membranpotenzial usw. mit anderen Fluoreszenzfarbstoffen gemessen werden. Die mitochondriale Ca2+-Konzentration ([Ca2+]m) lag den Angaben zufolge bei 0,08 x 20 ,2,3,4,5. Unter fura-2 Analoga eignet sich fura-2-FF zur Messung dieses Bereichs von [Ca2+]. Allerdings enthalten die lebenden Zellen leider NADH/NADPH für ihre Stoffwechselprozesse, und NADH erzeugt Signalstörungen aufgrund der überlappenden Anregungs- und Emissionsspektren mit dem fura-2 Analog. Diese Interferenz schränkt die Verwendung von fura-2 Analogen stark ein. Insbesondere, wenn das Analoge angewendet wird, um mitochondrial [Ca2+] zu messen, ist diese Interferenz das größte Hindernis, da die höchste Menge an NADH in den Mitochondrien liegt. Erschwert wird dies noch durch NADH-Änderungen im Zusammenhang mit dem mitochondrialen Membranpotential(m) und die Veränderung vonm wirkt sich auf [Ca2+]m6,7,8 , 9. Darüber hinaus ist es für das Studium der Dynamik [Ca2+]m wichtig, den Status anderer mitochondrialer Parameter, wie NADH,mund pH, zu kennen.
Die Emissionen bei 450 nm und 500 nm mit Anregungen bei 353 nm, 361 nm und 400 nm enthalten die Signale von NADH und fura-2-FF, und die Gleichungen sind wie folgt. Hierin sind 353 nm bzw. 361 nm die isosbestischen Punkte von fura-2-FF für Emissionen bei 450 nm bzw. 500 nm.
F361.450 = F361.450,NADH + F361.450,Fura Gleichung 1
F353.500 = F353.500,NADH + F353.500,Fura Gleichung 2
F400.500 = F400.500,NADH + F400.500,Fura Gleichung 3
wobei Fx,y die gemessene Emissionsintensität bei y-nm durch x-nm Anregung, Fx,y,NADH die reine NADH-abhängige Emissionsintensität und Fx,y,Fura die reine fura-2-FF-abhängige Emissionsintensität darstellt. Bei gleicher Konzentration des Fluoreszenzfarbstoffs sollte eine bestimmte Anregungsintensität die gleiche Emissionsintensität erzeugen. Daher sollte das Emissionsintensitätsverhältnis von zwei verschiedenen Anregungswellenlängen konstant sein. Ca2+ und Fura-2 hatten keinen Einfluss auf die Fluoreszenzeigenschaften von NADH; Daher war das Verhältnis der Emission bei 450 nm und bei 500 nm NADH bei jeder Anregungswellenlänge konstant. Die gleiche Regel kann für fura-2-FF verwendet werden, basierend auf der Annahme, dass NADH oder [Ca2+] die Emissions- und Anregungsspektren von fura-2-FF nicht beeinflusst. Ca2+ verursachte jedoch eine spektrale Verschiebung der Fura-2-FF-Emission. Daher muss verwendet werden, um die Wirkung von Ca2+zu entfernen, isosbestische Anregung, die unabhängig von Ca2+ist. Jede Emissionswellenlänge (d.h. 450 nm und 500 nm) hat einen anderen isosbestischen Punkt, und aus unserem Versuchsaufbau wurden 353 nm bei 500 nm und 361 nm bei 450 nm gewählt. Daraus sind die folgenden Gleichungengültig 10.
Rf = F361.450,Fura/F353.500,Fura Gleichung 4
RN1 = F400.500,NADH/F361,450,NADH Gleichung 5
RN2 = F353.500,NADH/F361,450,NADH Gleichung 6
Bei diesen Konstanten sind die folgenden Gleichungen aus (Gleichung 1) (Gleichung 2) und (Gleichung 3) gültig.
F361.450 = F361.450,NADH + Rf n F353.500,Fura Gleichung 7
F353.450 = RN2 x F361.450,NADH + F353.500,Fura Gleichung 8
F400.500 = RN1 x F361.450,NADH + F400.500,Fura Gleichung 9
Aus diesen Gleichungen können, wenn Rf, RN1und RN2 bekannt sind, reine Signale von NADH und Fura-2 wie folgt erhalten werden.
F361.450,NADH = (F361.450 - Ff - F353.500)/(1 x Rf - RN2) Gleichung 10
F353.500,Fura = (RN2 x F361.450 - F353.500)/(Rf - RN2 - 1) Gleichung 11
F400.500,Fura = F400.500 - RN1 - F361.450,NADH Gleichung 12
RFura = F353.500,Fura/F400,500,Fura Gleichung 13
Die Ca2+-gebundene Form von fura-2-FF war bei der 400 nm Erregungswellenlänge praktisch nicht fluoreszierend. Basierend auf dieser Eigenschaft kann die folgende neue Kalibrierungsgleichung abgeleitet werden.
[Ca2+] = Kd (F 400.500,max/F353,500,max)
wobei Kd eine Dissoziationskonstante ist, Sind F400.500,max und F353.500,max sind die Maximalwerte der emittierten Signale bei 500 nm mit Anregungen bei 400 nm bzw. 353nm, und R min ist die minimale RFura in Ca2 +-freier Zustand. Da die isosbestischen Anregungen verwendet wurden, kann die Gleichung wie folgt weiter vereinfacht werden.
[Ca2+] = Kd (1 / Rmin) ( RFura - Rmin) Gleichung 15
Daher sind nur Kd- undR-min-Werte erforderlich, um [Ca2+] zu berechnen.
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Protocol
Alle Versuchsprotokolle wurden vom lokalen institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss genehmigt.
1. Lösungsvorbereitung
- Bereiten Sie einzelne frisch isolierte Herzmyozyten11vor.
HINWEIS: Jedes Labor verfügt möglicherweise über eine andere Zellspeicherlösung. Hier werden die Myozyten im Kulturmedium (DMEM) gespeichert. - Bereiten Sie 100 ml Ca2+-freie Lösung vor (Tabelle 1).
- Bereiten Sie 50 ml Kulturmedium in einem 50 ml Becher vor. Aliquot 5 ml und legen Sie es in ein Wasserbad bei 37 °C. Halten Sie die restliche Lösung bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie 50 ml der Saponin-Lösung vor, indem Sie 5 mg Saponin zu 50 ml Ca2+-freier Lösung hinzufügen.
HINWEIS: Saponin wird verwendet, um Herzmyozyten zu durchdringen, zytosolische Kompartimente zu entfernen und nur die mitochondriale Fluoreszenz zu visualisieren. - Bereiten Sie 16 l von 1 mM fura-2-FF-AM in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst vor.
HINWEIS: Machen Sie 1 mM Stofflösung von fura-2-FF-AM in DMSO gelöst und aliquot 16 l in einem 2 ml Rohr. Lagern Sie sie bei -20 °C bis zur Verwendung. - Bereiten Sie 50 ml NADH-freie Ca2+-freie Lösung (Tabelle 1) und 50 ml NADH-freie Ca2+-gesättigte Lösung vor (Tabelle 1), wenn isosbestische Punkte gemessen werden sollen. Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 7,0 ein.
HINWEIS: Die NADH-freie Ca2+-freie Lösung (Tabelle 1) enthält 10 M FCCP und 100 M ADP ohne mitochondriale Substrate zur Minimierung von NADH in Mitochondrien. - Bereiten Sie 50 ml Ca2+-freie Lösung, 50 ml Malatlösung, 50 ml Pyruvatlösung, 50 ml Malate-Pyruvat-Lösung und 50 ml Roton-Lösung für NADH-Korrekturfaktormessungen vor (Tabelle 1).
2. Fluoroprobe-Ladeverfahren in die Mitochondrien
- Bereiten Sie die Färbelösung vor, indem Sie 2 ml des Kulturmediums auf 16 l von 1 mM fura-2-FF-AM hinzufügen.
HINWEIS: Fluoreszierender Farbstoff ist unter dem Licht zerbrechlich. Bereiten Sie die Lösung kurz vor der Verwendung vor. Bewahren Sie die Lösung, die den Fluoreszenzfarbstoff enthält, an einem dunklen Ort auf. Die Endkonzentration von fura-2-FF-AM beträgt 8 m. Wenn carboxy-SNARF-1 verwendet wurde, bereiten Sie die Farbstoff-Ladelösung mit 2 'M Carboxy-SNARF-1-AM vor. - Nehmen Sie 2 ml der isolierten Zellen und legen Sie in einem 5 ml Reagenzglas in eine aufrechte Position.
- Warten Sie 15 min, bis Myozyten auf den Boden sinken und den Überstand entfernen.
HINWEIS: Der Überstand kann Zellablagerungen enthalten. Zentrifugieren Sie das Rohr nicht, um Zellschäden zu vermeiden. - Fügen Sie 2 ml der Farbstoff-Ladelösung hinzu.
- Inkubieren Sie die Farbstoff-Ladelösung mit Zellen für 60 min bei 4 °C.
- Dann das Reagenzglas in ein 37 °C Wasserbad für 30 min in aufrechter Position geben.
- Entfernen Sie den Überstand, und fügen Sie 4 ml des vorgewärmten Kulturmediums von 37 °C hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 60 min in einem 37 °C Wasserbad.
- Schließlich entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 4 ml Kulturmedium bei Raumtemperatur hinzu und halten Sie das Rohr bei Raumtemperatur.
3. Einführung des multiparametrischen Messsystems
ANMERKUNG: Abbildung 1 zeigt ein Diagramm des gesamten Systems.
- Verwenden Sie für eine Anregungslichtquelle einen schnellen Monochromator (Polychrom II), der das Licht innerhalb von 3 ms verändern kann.
- Verwenden Sie eine Öl-Tauchlinse (40x, NA 1.3) mit einem invertierten Mikroskop, um die Signalintensität zu erhöhen.
- Verwenden Sie einen Nahinfrarotfilter und eine aufgeladene Gerätekamera (CCD), um das Objektfeld ohne fluoreszierende Signalstörungen zu überwachen.
- Erfassen Sie das Objektfeldbild, um den Bereich abzubekommen.
- Passen Sie das Objektfeld im Bildschirm mit einer Feldmembran an, nur um die Zelle zum Reduzieren des Hintergrunds anzuzeigen.
- Verwenden Sie vier Photomultiplierröhren mit jedem Bandpassfilter (450, 500, 590 und 640 nm), um Emissionswellenlängen mit Photonenzählmethode zu erkennen. Verwenden Sie die entsprechenden dichroitischen Spiegel, um das Emissionslicht zu teilen und umzuleiten.
HINWEIS: Das Anregungslicht ist im Vergleich zum Emissionslicht sehr stark. Wählen Sie daher den Bandpassfilter mit den höchsten Blockiereigenschaften aus, um den Hintergrund zu reduzieren. Ein Photonenzählsystem besteht aus einer Kombination aus PMTs, Photonenzählereinheiten und einem Hochgeschwindigkeitszähler. Zur Steuerung des Systems und zum Testen der Daten wurde eine maßgeschneiderte Fahrsoftware verwendet. Es ist notwendig, einen Weg zu finden, diese Methode mit anderen Systemen anzuwenden.
4. NADH-Korrekturmethoden mit einem multiparametrischen Messsystem
- Identifizierung der isosbestischen Punkte von Fura-2-FF vor Ort.
HINWEIS: In vielen Berichten wurde festgestellt, dass fluoreszierende Eigenschaften in Zellen verändert werden. Führen Sie daher alle Verfahren aus, um die Parameter zu erhalten, um die Interferenz vor Ort zu korrigieren.- Montieren Sie die mit Farbstoffen beladene Zelle am Mikroskop und warten Sie 3 min, um die Zellen auf den Boden zu senken.
HINWEIS: Passen Sie die Zellenzahlen an, um eine Zelle pro Zielfeld mit 40-facher Objektivlinse zu sehen. - Durchschnaufen Sie die NADH-freie Ca2+-freie Lösung bei 37 °C.
- Messen Sie nach dem Targeting der Zelle den zellfreien Hintergrund und den Zellbereich, wie in Abschnitt 4.1 dargestellt. Berechnen Sie den Zellhintergrund aus dem Zellbereich.
HINWEIS: Beide Hintergrundsignale müssen in jedem Experiment korrigiert werden. - Durchschnaufen Sie die Saponin-Lösung für 60 s und kehren Sie zur NADH-freien Ca2+-freien Lösung zurück.
- Messen Sie Fura-2-FF-emittierte Signale bei 450 nm und 500 nm gleichzeitig durch den Anregungsscan von 350 nm bis 365 nm mit dem 0,1 nm-Schritt.
- Durchschnaufen Sie die NADH-freie Ca2+-gesättigte Lösung und wiederholen Sie Schritt 4.2.5.
- Subtrahieren Sie die Signale in der Ca2+-gesättigten Lösung von den Signalen in den Ca2+-freien Bedingungen.
- Wiederholen Sie die Verfahren von 4.2.2 bis 4.2.7 mit anderen einzelnen Herzmyozyten.
HINWEIS: Wenn die Signalintensität schwächer wird, wiederholen Sie dies von 4.2.1. Wiederholen Sie den Vorgang für mindestens 5 verschiedene Zellen. - Berechnen Sie aus allen erhaltenen Signalen die Standardabweichungen der Emission bei jeder Anregung und wählen Sie die Anregungswellenlänge aus, die den Minimalstandardabweichungswert (SD) als isosbestischen Punkt anzeigt.
ANMERKUNG: Die repräsentativen Zahlen sind in Abbildung 2dargestellt.
- Montieren Sie die mit Farbstoffen beladene Zelle am Mikroskop und warten Sie 3 min, um die Zellen auf den Boden zu senken.
- Die Hintergrundsignalerkennung und die Korrekturmethoden mit dem Zellbereich
HINWEIS: Es gibt zwei Arten von Hintergründen. Das eine kommt aus den Zellen und der andere aus der Reflexion auf dem Deckschein (dem zellfreien Hintergrund). Beide Hintergründe müssen in jedem Experiment korrigiert werden.- Montieren Sie die farbstofffreien Zellen im Bad am Mikroskop und warten Sie 3 min, um die Zellen auf den Boden zu senken. Perfuse NADH-freie Ca2+-freie Lösung für ca. 5 Min.
HINWEIS: Die gesamte Lösungsperfusionsrate beträgt 2-3 ml/min bei 37 °C.
HINWEIS: Passen Sie die Zellenzahlen an, um eine Zelle pro Zielfeld mit 40-facher Objektivlinse zu sehen. - Legen Sie das Objektfeld so fest, dass es die Zielzelle abdeckt.
- Nachdem Sie die Zelle aus dem Feld herausbewegt haben, messen Sie die Hintergrundsignale des zellfreien Fensters und legen Sie sie als Offsets fest.
HINWEIS: Das Signal bedeutet das Lichtsignal, das im Photonenzählsystem erkannt werden soll. - Setzen Sie die Zelle an die Ausgangsposition zurück und messen Sie die Zellhintergrundsignale und den Zellbereich.
HINWEIS: Obwohl das Anregungslicht mit dem Bandpassfilter gefiltert wird, enthält es immer noch eine recht große Menge des gefilterten Lichts. Dieses Licht wird beim Einschlagen der Zellen dispergiert und verursacht ein erhebliches Hintergrundsignal, da das Photonenzählsystem hochempfindlich ist. Sie muss korrigiert werden.
HINWEIS: Der Zellbereich kann mit einem erfassten Zellbild und einer verfügbaren Bildgebungssoftware berechnet werden. Die Einheit des Zellenbereichs kann eine beliebige Einheit einschließlich Pixelanzahl sein. Nur Eine Standardisierung ist notwendig. - Wiederholen Sie dies von 4.1.1 bis 4.1.4 für das 10-fache, um die Beziehung zwischen dem Zellbereich und den Zellhintergrundsignalen zu erhalten.
HINWEIS: Später können die Zellhintergrundsignale aus dem Zellbereich aus der Beziehung berechnet werden. Da die Anregungslampe altern wird, muss dieses Verfahren mindestens jeden Monat wiederholt werden.
- Montieren Sie die farbstofffreien Zellen im Bad am Mikroskop und warten Sie 3 min, um die Zellen auf den Boden zu senken. Perfuse NADH-freie Ca2+-freie Lösung für ca. 5 Min.
- Messung von R-Faktoren
- Berechnen Sie Rf mit der Gleichung 4 aus den in Abschnitt 4.2 erhaltenen Signalen.
- Montieren Sie die farbstofffreien Zellen am Mikroskop und durchdringen Sie die Ca2+-freie Lösung.
- Messen Sie die Signale wie F361, 450, NADH, F400, 500, NADH, F361, 450, NADHund F353, 500, NADH.
- Durchdringen Sie die Malatlösung und wiederholen Sie 4.3.3. und messen die Signale.
- Durchdiesam die Pyruvatlösung und wiederholen Sie 4.3.3. und messen die Signale.
- Durchdringen Sie die Malat-Pyruvat-Lösung und wiederholen Sie 4.3.3. und messen die Signale.
- Durchdiesam die Rotone-Lösung und wiederholen Sie 4.3.3. und messen die Signale.
ANMERKUNG: Das Beispiel des NADH-Signals, das auf 5 mM Pyruvat, 5 mM Malat plus 5 mM Pyruvat und 10 M Roton-Zugabe aufgezeichnet wurde, ist in Abbildung 3dargestellt. - Berechnen Sie jede Steigung von F361, 450, NADH vs. F400, 500, NADH und F361, 450, NADH vs. F353, 500, NADH. Wie in Abbildung 3dargestellt . Jede Steigung zeigt RN1 und RN2an.
5. Auswahl der Anregung und des Emissionslichts für TMRE oder carboxy-SNARF-1
- Wenn TMRE zur Messung des mitochondrialen Potentials zusätzlich verwendet wurde, verwenden Sie die 530 nm Anregungswellenlänge und die 590 nm Emissionswellenlänge.
- Wenn carboxy-SNARF-1 zur Messung des mitochondrialen Potentials zusätzlich verwendet wurde, verwenden Sie die Anregungswellenlänge von 540 nm und Emissionswellenlängen von 590 nm und 640 nm12.
6. Auswahl des K d-Wertes von fura-2-FF
- Die Änderung des pH-Wertes kann sich auf Kd-Werte für Ca2+ Bindung auf fura-2-FF10auswirken. Verwenden Sie den Kd-Wert von 5,28 bei pH 7,5 für die Mitochondrien.
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Representative Results
Mitochondriale Ca2+ Änderungen aufgrund von Korrektur10
Abbildung 4 zeigt die Änderungen in [Ca2+]m vor und nach der Korrektur. Die Ergebnisse zeigten deutlich die wesentlichen Veränderungen in [Ca2+]m. Die mitochondriale ruhende Calciumkonzentration ohne zytosolische Ca2+ ([Ca2+]c) betrug 1,03 x 0,13 m (Mittelwert s.E., n = 32), und die maximale [Ca2+]m bei 1-M [Ca2+]c betrug 29,6 x 1,61 m ( Mittelwert s.E., n = 33) (Abbildung 5).
Gleichzeitige Messung von NADH, [Ca2+], undm10
Ein positiv geladener TMRE kann membranpotentialabhängig verteilt werden. Das Membranpotential kann mit der Nernst-Gleichung mit der Konzentration in jedem Fach berechnet werden. Die mitochondriale TMRA wurde mit der Perfusion von 2-nM TMRE überwacht. Eswurde angenommen, dass die anfängliche m 150 mV beträgt, und die Änderung vonm wurde auf dieser Grundlage berechnet. Die Anwendung von Ca2+ verringerte NADH, war abernur unwesentlich betroffen (Abbildung 6).
Mitochondriale pH-Änderungen durch die Änderung in [Ca2+]m10
Der mitochondriale pH-Wert mit der zusätzlichen Belastung von carboxy-SNARF-1 wurde nach Ca2+-Änderungen überwacht (Abbildung 7). Der mitochondriale pH-Wert war durch den Anstieg von [Ca2+]mnicht betroffen. Der ruhende mitochondriale pH betrug 7,504 x 0,047 (Mittelwert s.E., n = 13). Aus diesen Ergebnissen war der gewählte Kd-Wert von fura-2-FF bei pH 7,5.
Abbildung 1: Ein Mikrofluorometriesystem zur multiparametrischen Messung
Das schematische Diagramm des Mikrofluorometriesystems wurde gezeigt. Die montierten Zellen wurden über eine CCD-Kamera visualisiert. Über ein Photonenzählsystem wurden vier verschiedene Emissionsleuchten mit vier PMTs nachgewiesen. Diese Zahl wurde mit Genehmigung des Korean Journal of Physiology & Pharmacology10reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Identifizierung von isosbestischen Punkten
(A) Der rote Pfeil zeigt auf den isosbestischen Punkt bei der 450 nm Emissionswellenlänge. Fura-2 FF im nicht gebundenen Zustand wird mit einer gepunkteten Linie und im Ca2+-gebundenen Zustand mit einer durchgezogenen Linie angezeigt. (B) Der rote Pfeil wird auf den isosbestischen Punkt bei der 500 nm Emissionswellenlänge gezeigt. (C) Die subtrahierten Daten des Signals bei 450 nm in Ca2+-freien Bedingungen von Ca2+-frei gesättigten Bedingungen werden angezeigt. (D) Die subtrahierten Daten des Signals bei 500 nm in Ca2+-freien Bedingungen von Ca2+-frei gesättigten Bedingungen werden angezeigt. (E) Standardabweichungsdaten aus Schaubild C werden angezeigt. (F) Standardabweichungsdaten aus Schaubild D werden angezeigt. Diese Zahl wurde mit Genehmigung des Korean Journal of Physiology & Pharmacology10reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Messung der R N-Faktoren.
(A) Veränderungen des NADH-Signals ohne Fluoreszenzfarbstoff durch Anwendung verschiedener mitochondrialer Substrate wurden bei 361 nm Anregung und 450 nm Emissionswellenlängen gemessen. (B) Die NADH-Interferenzen in den Fura-2-FF-Signalen F400.500 () und F353.500 (—) wurden gleichzeitig überwacht. (C) Die Beziehungen zwischen F361,450,NADH und F400,500,NADH (') und zwischen F361,450,NADH und F353,500,NADH (') werden dargestellt. Die erhaltenen Steigungen werden als RN1 bzw. RN2dargestellt. Diese Zahl wurde mit Genehmigung des Korean Journal of Physiology & Pharmacology10reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Ergebnisse der Interferenzkorrektur nADH und fura-2-FF
Die Änderung der Signale vor der Korrektur (in den linken Bereichen dargestellt) zu nach der Korrektur (in den rechten Bereichen dargestellt). (A) NADH-Signale bei der 450 nm Emissionswellenlänge. (B) Fura-2-FF-Signale bei einer Emissionswellenlänge von 500 nm. Die Abbildung zeigt F400.500 (), F353.500 (----) und das Verhältnis von fura-2-FF (—). (C) Die mitochondriale Calciumkonzentration. Die rote gepunktete Linie gibt die Null an. Diese Zahl wurde mit Genehmigung des Korean Journal of Physiology & Pharmacology10reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Ruhe [Ca2+]m ohne zytosolische Ca2+ und maximal erdimen Zustand [Ca2+]m bei 1 'M zytosololic Ca2+
Mitochondrien wurden mit der Perfusion von Malate-Pyruvat-Lösung energetisiert. Der stationäre Zustand [Ca2+]m in einem Ca2+-freien Zustand und in 1 m Ca2+ Bedingungen wurde angezeigt. Die Zugabe von 5 mM Na+ wiederhergestelltEn NADH und reduzierte [Ca2+]m auf die Basislinie. Diese Zahl wurde mit Genehmigung des Korean Journal of Physiology & Pharmacology10reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Gleichzeitige Messung von NADH, [Ca 2+]mund
Mitochondrien wurden mit der Perfusion von Malate-Pyruvat-Lösung energetisiert. Gezeigtwurden die Änderungen von NAHD, [Ca2+]m und m. Die Zugabe von 1 M Ca2+ verringerte NAHD und erhöhte sich [Ca2+]m, aberdie M wurde nicht signifikant verändert. Diese Zahl wurde mit Genehmigung des Korean Journal of Physiology & Pharmacology10reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Gleichzeitige Messung von NADH, [Ca2+]mund pH
Die wiederholte Anwendung von Ca2+ könnte die Abnahme von NADH und die Zunahme von [Ca2+]m induzieren, aber der mitochondriale pH-Wert wurde durch die Anwendung von Ca2+nicht beeinträchtigt. Die Zugabe von Na+ könnte die NADH und [Ca2+]m an die Basislinie zurückgeben. Diese Zahl wurde mit Genehmigung des Korean Journal of Physiology & Pharmacology10reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Name der Lösungen | Konzentration (mM) | |||||||||
| Kcl | HEPES | EGTA | CaCl2 | m | seiten | R | FCCP | Adp | Saponin | |
| Ca2+-frei | 150 | 10 | 1 | |||||||
| NADH-frei | 150 | 10 | 1 | 0.01 | 0.1 | |||||
| Ca2+-frei | ||||||||||
| NADH-frei | 135 | 10 | 1 | 0.01 | 0.1 | |||||
| Ca2+-Gesättigt | ||||||||||
| Saponin | 150 | 10 | 1 | 0,1mg/ml | ||||||
| Malate | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| Pyruvat | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| Malat-Pyruvat | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | |||||
| Rotenone | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | 0.01 | ||||
| Kulturmedium | Dulbecco es Modified Eagle es Medium (DMEM) | |||||||||
| Färbe-Laden | 1mM Fura-2-FF-AM Aktie (16 ml) im Kulturmedium (2 ml) hinzufügen | |||||||||
Tabelle 1: Lösungen
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Discussion
Die Interferenzkorrekturmethode wurde erfolgreich zur Messung der Signale von NADH- und Fura-2-Analogen entwickelt. Eine genaue Messung der Signale ist für die exakte Korrektur unerlässlich. Die inhärente Natur der Fluoreszenzvorrichtung erzeugt jedoch ein Hintergrundsignal, das nichts mit dem von NADH von fura-2 zu tun hat. Der bandpass-Filter höchster Qualität kann nur bis zu 10x 8 der unerwünschten Wellenlängen des Lichts passieren. Das fluoreszierende Signal einer einzelnen Zelle ist jedoch sehr klein, und die Reflexion des Anregungslichts nach dem Bandpassfilter ist immer noch stark genug, um die tatsächlichen Fluoreszenzsignale zu kontaminieren. Daher ist eine sorgfältige Korrektur des Hintergrundsignals erforderlich.
Fura-2 hat ein Belastungsproblem, um mitochondriale Ca2+zu messen. Erstens ist es nicht einfach, den Farbstoff speziell in die Mitochondrien zu laden, und eine unspezifische Belastung in eine andere Organelle könnte fehlerhaft sein. Die mitochondriale Ca2+-Konzentration ist im Allgemeinen höher als die des Zytosols, und die Verwendung von Fura-2-FF mit einem hohen Kd-Wert könnte die Kontamination zytosolischer Ca2+-Änderungen vermeiden. Die andere problematische Organelle ist das sarkoplasmische Retikulum (SR). Die Verteilungsvolumenunterschiede (SR 3,5% vs. Mitochondrien 34% bis 36% in ventrikulären Myozyten der Ratte)13,14 und die Entfernung von ATP in Experimenten könnten die Kontamination durch SR ausgleichen.
Unsere Kalibriergleichung (Gleichung 14 und 15) hat viele vorteilhafte Eigenschaften gegenüber Grynkiewicz' Gleichung15 wie folgt:
1) Es erfordert nur drei Parameter: Kd, F400,500, max/F353,500,maxund Rmin.
2) Es besteht eine Linearität des Verhältniswertes zur Ca2+-Konzentration bei konstantem pH-Wert.
3) Es gibt einen relativfehlerfreien Parameter in F400,500,max/F353,500,max im Vergleich zu Sf2/Sb215.
4) In Gleichung 15 sind nur Kd und Rmin erforderlich, wenn eine isosbestische Anregung verwendet wird.
5) Das Kalibrierungsverfahren, um den Parameter zu erhalten, ist mit Gleichung 15 viel einfacher.
Es gibt jedoch eine Einschränkung, da Ca2+-gesättigte fura-2-FF eine sehr geringe Emission erzeugt. Es verursacht einen Fehler. Die neue Gleichung kann auf [Ca2+] Konzentrationen angewendet werden, die bis zu 50x der Konzentrationen von Kdbetragen.
Abschließend wurde ein Protokoll entwickelt, um das bestehende Problem der NADH- und Fura-2-FF-Interferenzen erfolgreich zu lösen. Diese Methode kann die Ca2+-Dynamik genauer messen. Multiparametrisches Messsystem, insbesondere in den Mitochondrien, wird helfen, die mitochondriale Physiologie in quantitativer Weise zu verstehen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch das Basic Science Research Program durch die National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, die vom Bildungsministerium (2018R1A6A01011832) vom Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung (NRF-2016M3C1A6936606) gefördert wurde. und vom Ministerium für Handel, Industrie und Energie (10068076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipment, 640±11nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590±15nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500±20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipment, 450±30nm |
| Calcium chloride solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
| DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Sigma-aldrich | D5030 | Chemicals |
| EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid | Sigma-aldrich | E4378 | Chemicals |
| FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Chemicals |
| field diaphragm | Nikon | 86506 | Equipment |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | chemicals |
| Green tube | DWM | test tube | |
| HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| High-speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipment, 50:50 |
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Equipment, 750±100nm |
| Oil immersion lens | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipment |
| Photon counter unit | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
| Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936 | Chemicals |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-aldrich | P4494 | Chemicals |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
| Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemicals |
| TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Molecular probes | T669 | Chemicals |
References
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