Summary
På grund af den spektral overlapning af excitation og emission bølgelængder af NADH og Fura-2 analogerne, signal interferens fra begge kemikalier i levende celler er uundgåelig under kvantitativ måling af [ca2 +]. Således, en ny online korrektion metode NADH signal interferens til at måle [ca2 +] blev udviklet.
Abstract
For at måle [ca2 +] kvantitativt, anvendes Fura-2-analoger, som er ratiometriske fluoropklæder, hyppigt. Men, farvestof skik er uløseligt begrænset i levende celler på grund af autofluorescens interferens, hovedsagelig fra nicotinamid adenin dinucleotid (NADH). Mere specifikt, dette er en stor hindring, når du måler mitokondrie [ca2 +] kvantitativt ved hjælp af Fura-2 analoger, fordi størstedelen af NADH er i mitokondrierne. Hvis den fluorescerende farvestof koncentration er den samme, skal en bestemt excitation intensitet producere den samme emissionsintensitet. Derfor skal emissions intensitets forholdet for to forskellige excitation bølgelængder være konstant. Baseret på dette princip, en ny online korrektion metode NADH signal interferens til at måle [ca2 +] blev udviklet, og den reelle signalintensitet af NADH og Fura-2 kan opnås. Desuden blev der udviklet en ny ligning til beregning af [ca2 +] med isosbestisk excitation eller excitation ved 400 nm. Med denne metode, ændringer i mitokondrie [ca2 +] kunne måles med succes. Med et andet sæt af excitation og emission bølgelængder, flere parametre, herunder NADH, [ca2 +], og pH eller mitokondriel membran potentiale (Me m), kunne samtidig måles. Mitokondrie [ca2 +]og eller ph blev målt ved hjælp af FURA-2-FF og tetramethylrhodamin ETHYL ester (tmre) eller carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (CARBOXY-SNARF-1).
Introduction
Den væsentlige rolle intracellulære ca2 + er almindeligt kendt1. Kvantificeringen af [ca2 +] er afgørende for at forstå processerne i de cellulære fysiologiske funktioner. Fura-2 analoger er ganske nyttigt, fordi de er begejstrede i UV-området (< 400 nm), og den ratiometriske metode kan anvendes til kvantitativ måling. Derfor kan andre fysiologiske parametre såsom pH, membran potentiale, etc., måles med andre fluorescerende farvestoffer. Mitokondrie ca2 + koncentrationen (ca2 +]m) rækkevidde var angiveligt 0,08 − 20 μM2,3,4,5. Blandt Fura-2-analoger er Fura-2-FF egnet til måling af dette interval på [ca2 +]. Men de levende celler desværre indeholder NADH/NADPH for deres metaboliske processer, og NADH genererer signal interferens på grund af den overlappende excitation og emission Spectra med Fura-2 analog. Denne interferens begrænser i høj grad brugen af Fura-2 analover. Specifikt, hvis analog anvendes til at måle mitokondrie [ca2 +], denne interferens er den største hindring, fordi den højeste mængde af NADH er i mitokondrier. Dette kompliceres yderligere af, at NADH-ændringer hænger sammen med potentialet for mitokondriel membran (en),og ændringen af denændrede betydning påvirker [ca2 +]m6,7,8 , 9. Endvidere, for at studere [ca2 +]m dynamik, er det vigtigt at kende status for andre MITOKONDRIE parametre, såsom NADH, omm, og ph.
Emissionerne ved 450 Nm og 500 nm med excitationer ved 353 nm, 361 nm og 400 nm indeholder signalerne fra NADH og Fura-2-FF, og ligningerne er som følger. Heri er 353 nm og 361 nm de isosbestiske punkter i Fura-2-FF for emissioner ved henholdsvis 450 Nm og 500 nm.
F361.450 = f361450, NADH + f361450, Fura ligning 1
F353.500 = f353500, NADH + f353500, Fura ligning 2
F400.500 = f400500, NADH + f400500, Fura ligning 3
hvor Fx, y er den målte emissionsintensitet ved y-nm ved x-nm excitation, fx, y, NADH repræsenterer den rene NADH-afhængige emissionsintensitet, og fx, y, Fura repræsenterer den rene Fura-2-FF-afhængige emissionsintensitet. Under samme koncentration af det fluorescerende farvestof skal en bestemt excitation intensitet producere den samme emissionsintensitet. Derfor skal emissions intensitets forholdet for to forskellige excitation bølgelængder være konstant. Ca2 + og Fura-2 påvirkede ikke NADH-fluorescens egenskaber. Derfor var forholdet mellem emissionen ved 450 Nm og ved 500 nm af NADH konstant ved enhver excitation bølgelængde. Den samme regel kan anvendes til Fura-2-FF baseret på den antagelse, at NADH eller [ca2 +] ikke påvirker emission og excitation Spectra af Fura-2-FF. Men ca2 + forårsagede en spektral forskydning af Fura-2-FF emission. Derfor, for at fjerne effekten af ca2 +, isosbestic excitation, som er uafhængig af ca2 +, skal anvendes. Hver emissions bølgelængde (dvs. 450 Nm og 500 nm) har et andet isosbestisk punkt, og fra vores eksperimentelle opsætning blev 353 nm ved 500 nm og 361 nm ved 450 Nm valgt. Fra disse er følgende ligninger gyldige10.
Rf = f361450, Fura/f353500, Fura ligning 4
RN1 = f400500, NADH/F361450, NADH ligning 5
RN2 = f353500, NADH/F361450, NADH ligning 6
Med disse konstanter er følgende ligninger fra (ligning 1) (ligning 2) og (ligning 3) gyldige.
F361.450 = f361450, NADH + Rf × f353500, Fura ligning 7
F353.450 = RN2 × f361450, NADH + f353500, Fura ligning 8
F400.500 = RN1 × f361450, NADH + f400500, Fura ligning 9
Fra disse ligninger, hvis Rf, rN1og rN2 er kendt, kan der opnås rene signaler af NADH og Fura-2 som følger.
F361450, NADH = (f361.450 -rf × f353.500)/(1 − rf × rN2) ligning 10
F353500, Fura = (rN2 × F361.450 − f353.500)/(rF × rN2 − 1) ligning 11
F400500, Fura = f400.500 − RN1 × f361450, NADH ligning 12
RFura = f353500, Fura/f400500, Fura ligning 13
Ca2 +-bundet form af Fura-2-FF var praktisk taget ikke-fluorescerende ved 400 nm excitation bølgelængde. Baseret på denne egenskab kan følgende nye kalibrerings ligning udledes.
[Ca2 +] = Kd ∙ (F400500, Max/f353500, maks) × (rFura − rmin) ligning 14
hvor Kd er en dissociationskonstant, f400500, maks og f353500, Max er maksimumværdierne for de udsendte signaler ved 500 nm med excitationer ved henholdsvis 400 nm og 353 nm, og rmin er minimum rFura i ca2 +-fri tilstand. Da de isosbestiske excitationer blev anvendt, kan ligningen forenkles yderligere som følger.
[Ca2 +] = Kd ∙ (1/rmin.) ∙ (rFura − rmin) ligning 15
Derfor kræves kun Kd -og R-min -værdier for at beregne [ca2 +].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprotokoller blev godkendt af den lokale institutions Komité for dyrepasning og-anvendelse.
1. klargøring af opløsningen
- Forbered enkelt frisk isoleret hjertemyocytter11.
Bemærk: hvert laboratorium kan have en anden celle opbevaringsløsning. Her lagres myocytterne i kulturmediet (DMEM). - Forbered 100 mL ca2 +-fri opløsning (tabel 1).
- Forbered 50 mL dyrkningsmedium i et 50 mL bægerglas. Aliquot 5 mL og sættes i et vandbad ved 37 °C. Opbevar den resterende opløsning ved stuetemperatur.
- Forbered 50 mL af saponin-opløsningen ved at tilsætte 5 mg saponin til 50 mL ca2 +-fri opløsning.
Bemærk: saponin bruges til at permeabilize hjertemyocytter, til at fjerne cytosolisk rum, og til at visualisere mitokondrie fluorescens kun. - Forbered 16 μL af 1 mM Fura-2-FF-AM opløst i dimethylsulfoxid (DMSO).
Bemærk: lav 1 mm stamopløsning af Fura-2-FF-am opløst i DMSO og alikvot 16 μl i et 2 ml rør. Opbevar dem ved-20 °C indtil brug. - Forbered 50 mL NADH-fri ca2 +-fri opløsning (tabel 1) og 50 ml NADH-fri ca2 +-mættet opløsning (tabel 1), når der skal måles isosbestiske punkter. Justér pH til 7,0 med KOH.
Bemærk: NADH-fri ca2 +-fri opløsning (tabel 1) indeholder 10 μM Fccp og 100 μM ADP uden mitokondrielle substrater for at minimere NADH i mitokondrier. - 50 ml ca2 +-fri opløsning, 50 ml malat opløsning, 50 ml pyruvatopløsning, 50 ml malat-pyruvat opløsning og 50 ml rotenon opløsning anvendes til måling af NADH-korrektionsfaktor (tabel 1).
2. fluoroprobe indlæsningsprocedure i mitokondrierne
- Den farve ladende opløsning fremstilles ved tilsætning af 2 mL af dyrkningsmediet til 16 μL 1 mM Fura-2-FF-AM.
Bemærk: fluorescerende farvestof er skrøbeligt under lyset. Forbered opløsningen lige før brug. Opbevar opløsningen, der indeholder det fluorescerende farvestof, på et mørkt sted. Den endelige koncentration af Fura-2-FF-AM er 8 μM. Hvis carboxy-SNARF-1 blev brugt, skal du tilberede farve belastnings opløsningen med 2 μM carboxy-SNARF-1-AM. - Tag 2 mL af de isolerede celler og Placer dem i et 5 mL prøveglas i opretstående stilling.
- Vent 15 min for myocytter at synke til bunden og fjerne supernatanten.
Bemærk: supernatanten kan indeholde cellerester. Centrifugeglasset må ikke centrifugeres for at undgå celle beskadigelse. - Tilsæt 2 mL af den farve ladende opløsning.
- Infusionsvæsken inkubates med celler i 60 min ved 4 °C.
- Sæt derefter prøverøret i et 37 °C vandbad i 30 minutter i opretstående stilling.
- Supernatanten fjernes, og 4 mL af det forvarmede dyrkningsmedium tilsættes 37 °C. Cellerne inkubates i 60 min i et 37 °C vandbad.
- Fjern endelig supernatanten, tilsæt 4 mL dyrkningsmedium ved stuetemperatur og hold røret ved stuetemperatur.
3. indførelse af multiparametrisk målesystem
Bemærk: figur 1 viser et diagram over hele systemet.
- For en excitation lyskilde, brug en hurtig monochromator (polykrom II), der kan ændre lyset inden for 3 MS.
- Brug en olie dyknings linse (40x, NA 1,3) med et inverteret mikroskop for at øge signal intensiteten.
- Brug et nær-infrarødt filter og et CCD-kamera (Charge-koblet enhed) til at overvåge objektfeltet uden fluorescerende signal interferens.
- Fang objekt feltets billede for at få området.
- Juster objektfeltet i Monitor skærm med en felt membran bare for at vise cellen til at reducere baggrunden.
- Brug fire Photomultiplier-rør med hvert bånd-pass-filter (450, 500, 590 og 640 nm) til at detektere emissions bølgelængder med foton Optællingsmetode. Brug de relevante koldtlysreflektorlamper-spejle til at opdele og til at omdirigere emissions lampen.
Bemærk: excitation lys er meget stærk i forhold til emissionen lys. Vælg således band-Pass filteret med de højeste blokerende egenskaber for at reducere baggrunden. Et foton-optællings system består af en kombination af PMTs-, photon-tæller enheder og en højhastigheds tæller. Til at styresystemet og til at indsamle data, en skræddersyet køre software blev brugt. Det er nødvendigt at finde en måde at anvende denne metode på sammen med andre systemer.
4. NADH korrektionsmetoder med et multiparametrisk målesystem
- Identifikation af de isosbestiske punkter i Fura-2-FF in situ.
Bemærk: mange rapporter har udtalt, at fluorescerende egenskaber ændres i cellerne. Udfør derfor alle procedurer for at få parametrene til at korrigere interferensen på stedet.- Monter den farve belastede celle på mikroskopet og vent i 3 minutter for at synke cellerne til bunden.
NOTER: Juster cellenumre for at se omkring en celle pr. et objektiv felt med 40x objektiv linse. - Perfuse den NADH-fri ca2 +-fri løsning ved 37 °c.
- Efter målretningen celle, målecelle-fri baggrund og celleområdet som vist i afsnit 4,1. Beregn cellebaggrunden fra celleområdet.
Bemærk: begge baggrunds signaler skal korrigeres i hvert eksperiment. - Perfuse saponin-opløsningen til 60 s og vend tilbage til den NADH-fri ca2 +-fri løsning.
- Mål Fura-2-FF-udsendte signaler ved 450 Nm og 500 nm samtidig ved excitation scanning fra 350 nm til 365 nm med 0,1 nm trin.
- Perfuse den NADH-fri ca2 +-mættet opløsning og Gentag trin 4.2.5.
- Træk signalerne i ca2 +-mættet opløsning fra signalerne i ca2 +-frie forhold.
- Gentag procedurerne fra 4.2.2 til 4.2.7 med andre enkelt kardiale myocytter.
Bemærk: Hvis signal intensiteten bliver svagere, skal du gentage fra 4.2.1. Gentag proceduren for mindst 5 forskellige celler. - Fra alle opnåede signaler, beregne standardafvigelser af emissionen ved hver excitation og vælge den excitation bølgelængde viser den mindstestandard afvigelse (SD) værdi som et isosbestisk punkt.
Bemærk: de repræsentative tal er vist i figur 2.
- Monter den farve belastede celle på mikroskopet og vent i 3 minutter for at synke cellerne til bunden.
- Registrering af baggrunds signalet og korrektions metoderne med celleområdet
Bemærk: der er to slags baggrunde. Den ene kommer fra cellerne, og den anden kommer fra refleksionen på Cover sedlen (den celle frie baggrund). Begge baggrunde skal korrigeres i hvert eksperiment.- Monter de farve frie celler i badet på mikroskopet og vent i 3 minutter for at synke cellerne til bunden. Perfuse NADH-gratis ca2 +-fri løsning til omkring 5 minutter.
Bemærk: alle perfusions-infusionshastigheden er 2-3 mL/min ved 37 °C.
NOTER: Juster cellenumre for at se omkring en celle pr. et objektiv felt med 40x objektiv linse. - Indstil objektfeltet til at dække den målrettede celle.
- Når du har flyttet cellen ud af feltet, bør du måle baggrunds signalerne i det celle frie vindue og angive dem som forskydninger.
Bemærk: signalet betyder det lyssignal, der skal detekteres i foton-optællings systemet. - Vend cellen tilbage til den oprindelige position, og mål celle baggrunds signalerne og celleområdet.
Bemærk: Selvom excitation-lampen filtreres med båndpas-filteret, indeholder den stadig ganske stor mængde af det filtrerede lys. Dette lys er spredt, når du rammer cellerne og forårsager et betydeligt baggrunds signal, fordi foton optællings systemet er meget følsomt. Det skal korrigeres.
Bemærk: celleområdet kan beregnes med et hentet celle billede og en tilgængelig billedbehandlingssoftware. Enheden i celleområdet kan være enhver enhed, herunder pixel tælling. Bare standardisering er nødvendig. - Gentag fra 4.1.1 til 4.1.4 for 10 gange for at opnå forholdet mellem celleområdet og cellens baggrunds signaler.
NOTER: senere kan celle baggrunds signalerne beregnes fra celleområdet fra relationen. Da excitation pære bliver aldrende, denne procedure skal gentages, i hvert fald, hver måned.
- Monter de farve frie celler i badet på mikroskopet og vent i 3 minutter for at synke cellerne til bunden. Perfuse NADH-gratis ca2 +-fri løsning til omkring 5 minutter.
- Måling af R-faktorer
- Beregn RF med ligningen 4 fra de signaler, som er opnået i punkt 4,2.
- Monter de farve frie celler på mikroskopet, og perfuse ca2 +-fri opløsning.
- Mål signalerne såsom F361, 450, nadh, f400, 500, NADH, f361, 450, NADH, og f353, 500, NADH.
- Perfuse malat opløsningen og Gentag 4.3.3. og måle signalerne.
- Perfuse pyruvatopløsningen og Gentag 4.3.3. og måle signalerne.
- Perfuse malat-pyruvatopløsningen og Gentag 4.3.3. og måle signalerne.
- Perfuse rotenon opløsningen og Gentag 4.3.3. og måle signalerne.
Bemærk: eksemplet med NADH-signalet, der er optaget på 5 mm pyruvat, 5 mM Malate plus 5 mM pyruvat og 10 μM rotenon addition, er vist i figur 3. - Beregn hver skråning af F361, 450, nadh vs. f400, 500, NADH og f361, 450, NADH vs. f353, 500, NADH. Som vist i figur 3. Hver hældning angiver RN1 og rN2.
5. udvælgelse af excitation og emissions lyset for TMRE eller carboxy-SNARF-1
- Hvis TMRE til måling af mitokondrie potentialet blev anvendt i tillæg, brug 530 nm excitation bølgelængde og 590 nm emission bølgelængde.
- Hvis carboxy-SNARF-1 til måling af mitokondrie potentialet blev anvendt i tillæg, bruge excitation bølgelængde på 540 nm og emission bølgelængder af 590 nm og 640 nm12.
6. valg af Kd -værdi af Fura-2-FF
- Ændringen af pH kan påvirke Kd -værdier for ca2 + binding på FURA-2-FF10. Brug Kd -værdien på 5,28 ved pH 7,5 for mitochondrierne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mitochondrial ca2 + ændringer på grund af korrektion10
Figur 4 viser ændringerne i [ca2 +]m før og efter korrektionen. Resultaterne viste tydeligt de væsentlige ændringer i [ca2 +]m. Den mitokondrielle hvile calciumkoncentration uden cytosolisk ca2 + ([ca2 +]c) var 1,03 ± 0,13 μM (gennemsnit ± S.E., n = 32), og den maksimale [ca2 +]m ved 1-μM [ca2 +]c var 29,6 ± 1,61 μM ( gennemsnit ± S.E., n = 33) (figur 5).
Samtidig måling af NADH, [ca2 +] og s.10
En positivt ladet TMRE kan fordeles på en membran potentiel-afhængig måde. Membranpotentialet kan beregnes ved hjælp af Nernsts ligning med koncentrationen i hvert rum. Mitokondrie tmra blev overvåget med perfusion af 2-nm tmre. Den oprindelige gennemgang blev antaget til at være − 150 mV, og ændringen af den blev beregnet på grundlag af dette. Anvendelsen af ca2 + faldt NADH, menpåvirkede kun ubetydeligt (figur 6).
Mitokondrie pH ændres ved ændringen i [ca2 +] m10
Mitokondrie pH med ekstra belastning af carboxy-SNARF-1 blev overvåget efter ca2 + ændringer (figur 7). Mitokondrie pH blev ikke påvirket af stigningen i [ca2 +]m. Den hvilende mitokondrie pH var 7,504 ± 0,047 (gennemsnit ± S.E., n = 13). Ud fra disse resultater var 5,28 μM den valgte Kd -værdi af Fura-2-FF ved pH 7,5.
Figur 1: et mikrofluorometrisk system til multiparametrisk måling
Det skematiske diagram over mikrofluorometri-systemet blev vist. De monterede celler blev visualiseret via et CCD-kamera. Fire forskellige emissions lamper blev detekteret med fire PMTs via et foton tællesystem. Dette tal er blevet gengivet med tilladelse fra den koreanske Journal of Physiology & farmakologi10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: identifikation af isosbestiske punkter
(A) den røde pil peger på det isosbestiske punkt ved 450 Nm-bølgelængden. Fura-2 FF i den ikke-bundne tilstand vises med en punkteret linje og i ca2 + bundet tilstand med en solid linje. B) den røde pil peger på det isosbestiske punkt ved 500 nm-bølgelængden. C) de subtrahere data for signalet ved 450 Nm i ca2 +-fri forhold fra ca2 +-frie mættede tilstande vises. D) de subtrahere data for signalet ved 500 nm i ca2 +-fri forhold fra ca2 +-frie mættede tilstande vises. (E) der vises standard afvigelses data fra graf C. F) der vises standard afvigelses data fra graf D. Dette tal er blevet gengivet med tilladelse fra den koreanske Journal of Physiology & farmakologi10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: måling af RN -faktorer.
(A) ændringer i NADH signal uden fluorescerende farvestof ved at anvende forskellige mitokondrie substrater blev målt ved 361 nm excitation og 450 Nm emission bølgelængder. B) NADH-interferensen i Fura-2-FF-signalerne, f400.500 (∙ ∙ ∙) og f353.500 (—), blev samtidig overvåget. C) forholdet mellem f361450, NADH og f400500, NADH (○) og mellem F361450, NADH og f353500, NADH (●) er vist. De opnåede skråninger er henholdsvis RN1 og rN2. Dette tal er blevet gengivet med tilladelse fra den koreanske Journal of Physiology & farmakologi10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: resultater af NADH-og Fura-2-FF-interferens korrektion
Ændringen af signalerne fra før korrektionen (vist i venstre paneler) til efter korrektionen (vist i de højre paneler). A) NADH-signaler ved 450 Nm-bølgelængden. B) Fura-2-FF-signaler ved 500 nm-bølgelængden. Figuren viser F400, 500 (− −), F353.500 (----), og forholdet mellem FURA-2-FF (—). C) koncentrationen af mitokondriel calcium. Den røde stiplede linje angiver nulpunktet. Dette tal er blevet gengivet med tilladelse fra den koreanske Journal of Physiology & farmakologi10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: hvilende [ca 2 +]m uden cytosoliskca 2 + og maksimal Steady State [ca2 +]m ved 1 μM cytosolisk ca2 +
Mitokondrier blev energiseret med perfusion af Malate-pyruvat opløsning. Steady State [ca2 +]m i en ca2 +-fri betingelser og i 1 μM ca2 + betingelser blev vist. Tilføjelsen af 5 mM na+ genvundet NADH og reduceret [ca2 +]m til baseline. Dette tal er blevet gengivet med tilladelse fra den koreanske Journal of Physiology & farmakologi10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: simultan måling af NADH, [ca2 +]mog
Mitokondrier blev energiseret med perfusion af Malate-pyruvat opløsning. Der blev vist ændringer af NAHD, [ca2 +]m og s.m . Tilføjelsen af 1 μM ca2 + faldt nahd og steg [ca2 +]m , men er ikke ændret signifikant. Dette tal er blevet gengivet med tilladelse fra den koreanske Journal of Physiology & farmakologi10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: simultan måling af NADH, [ca2 +]mog ph
Den gentagne anvendelse af ca2 + kunne inducere faldet i NADH og stigningen på [ca2 +]m , men mitokondrie pH blev ikke påvirket af anvendelsen af ca2 +. Tilføjelsen af na + kunne returnere NADH og [ca2 +]m til baseline. Dette tal er blevet gengivet med tilladelse fra den koreanske Journal of Physiology & farmakologi10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn på løsninger | Koncentration (mM) | |||||||||
| KCl | HEPES | EGTA | CaCl2 | M | P | R | FCCP | Adp | Saponin | |
| Ca2 +-gratis | 150 | 10 | 1 | |||||||
| NADH-gratis | 150 | 10 | 1 | 0,01 | 0,1 | |||||
| Ca2 +-gratis | ||||||||||
| NADH-gratis | 135 | 10 | 1 | 0,01 | 0,1 | |||||
| Ca2 +-mættede | ||||||||||
| Saponin | 150 | 10 | 1 | 0,1 mg/ml | ||||||
| Malate | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| Pyruvat | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| Malate-pyruvate | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | |||||
| Rotenon | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | 0,01 | ||||
| Kultur medium | Dulbecco's modificerede ørne medium (DMEM) | |||||||||
| Dye-loading | Tilsæt en 1mM Fura-2-FF-AM-bestand (16 mL) i dyrkningsmediet (2 mL) | |||||||||
Tabel 1: løsninger
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den interferens korrektion metode blev udviklet med succes til måling af signaler af NADH og Fura-2 analoger. Nøjagtig måling af signalerne er afgørende for nøjagtig korrektion. Men den iboende karakter af den fluorescerende anordning producerer et baggrunds signal uden forbindelse med NADH af Fura-2. Den højeste kvalitet band-pass filter kan kun passere op til 10− 8 af de uønskede bølgelængder af lyset. Men det fluorescerende signal fra en enkelt celle er meget lille, og refleksionen af excitation Light efter band-pass filter er stadig stærk nok til at forurere de faktiske fluorescerende signaler. Derfor er omhyggelig korrektion af baggrunds signalet nødvendigt.
Fura-2 har et belastningsproblem til måling af mitokondrie ca2 +. For det første er det ikke let at indlæse farvestoffet specifikt i mitokondrierne, og uspecifik belastning i en anden organelle kunne være fejlagtig. Mitokondrie ca2 + koncentrationen er generelt højere end cytosol, og brugen af Fura-2-FF med en høj Kd -værdi kunne undgå kontaminering af cytosolisk ca2 + ændringer. Den anden problematiske organelle er sarcoplasmic reticulum (SR). Men, fordelingen volumen forskelle (SR 3,5% vs. mitokondrier 34% − 36% i rotte ventrikulære myocytter)13,14 og fjernelse af ATP i eksperimenter kunne kompensere for kontaminering fra SR.
Vores kalibrerings ligning (ligning 14 og 15) har mange fordelagtige egenskaber over Grynkiewicz ' ligning15 som følger:
1) det kræver kun tre parametre: Kd, F400500, Max/f353500, Max, og Rmin.
2) der er linearitet af forholdet værdi til Ca2 + koncentrationen ved en konstant pH.
3) der er en relativ fejlfri parameter i F400500, Max/f353500, maks sammenlignet med SF2/sB215.
4) i ligning 15 kræves kun Kd og Rmin , hvis der anvendes isosbestisk excitation.
5) kalibreringsproceduren for at opnå parameteren er meget enklere med ligning 15.
Men der er en begrænsning, fordi ca2 +-mættet Fura-2-FF genererer en meget lille emission. Det forårsager en fejl. Den nye ligning kan anvendes på [ca2 +] koncentrationer op til 50X af Kd.
Afslutningsvis blev der udviklet en protokol til en vellykket løsning af det eksisterende problem med NADH og Fura-2-FF interferens. Denne metode kan måle ca2 + dynamik mere præcist. Multiparametrisk målesystem, især i mitokondrierne, vil hjælpe med at forstå mitokondrie fysiologi på en kvantitativ måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af grundlæggende videnskabelige forsknings program gennem National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for uddannelse (2018R1A6A3A01011832), af Ministeriet for videnskab, IKT & fremtidig planlægning (NRF-2016M3C1A6936606) og af Ministeriet for handel, industri & energi (10068076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipment, 640±11nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590±15nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500±20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipment, 450±30nm |
| Calcium chloride solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
| DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Sigma-aldrich | D5030 | Chemicals |
| EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid | Sigma-aldrich | E4378 | Chemicals |
| FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Chemicals |
| field diaphragm | Nikon | 86506 | Equipment |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | chemicals |
| Green tube | DWM | test tube | |
| HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| High-speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipment, 50:50 |
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Equipment, 750±100nm |
| Oil immersion lens | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipment |
| Photon counter unit | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
| Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936 | Chemicals |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-aldrich | P4494 | Chemicals |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
| Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemicals |
| TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Molecular probes | T669 | Chemicals |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Miyata, H., et al. Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes. American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).
- Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).
- Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium. Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).
- Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).
- Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
- Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes. Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).
- Brandes, R., Bers, D. M. Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae. Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).
- Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).
- Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat. Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).
- Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
- Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism. Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).
- Page, E. Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology. American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).
- Page, E., McCallister, L. P., Power, B. Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
