Presynapse 형성 분석 전시 냅 스 주최자 구슬과 "뉴런 공" 문화를 사용 하 여
Summary
Presynapse 형성은 적절한 순서로 시 냅 스 단백질의 축적을 포함 하 여 동적 과정. 이 방법에서, presynapse 형성은 “뉴런 볼” 배양물의 축축한 시트에 presynapse 조직 단백질과 공액된 구슬에 의해 유발되므로 시냅스 단백질의 축적은 presynapse 형성 동안 분석되기 쉽습니다.
Abstract
신경 발달 도중, 시냅스 대형은 신경 회로를 설치하는 중요한 단계입니다. 시 냅 스를 형성 하기 위해, 시 냅 스 단백질 은 미성숙 시 냅 스에서 세포 체 및/또는 로컬 번역에서 전송 하 여 적절 한 순서로 공급 해야 합니다. 그러나, 그것은 완전히 이해 되지 않습니다 어떻게 시 냅 스 단백질 적절 한 순서로 시 냅 스에 축적. 여기서, 우리는 뉴런 볼 배양과 구슬의 조합을 이용하여 시냅스 전 형성을 분석하여 시냅스 전 형성을 유도하는 새로운 방법을 제시한다. 신경 세포 응집체인 뉴런 볼은 세포체와 모수석에서 멀리 떨어진 축축한 시트를 제공하므로 세포체의 압도적인 신호를 피함으로써 약한 형광 신호가 검출될 수 있습니다. 구슬은 presynapse 대형을 트리거하기 때문에, 우리는 류신이 풍부한 반복 막 간 신경 2 (LRRTM2), 흥분성 presynaptic 주최자와 결합된 구슬을 사용합니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 소포성 소포 단백질인 소포성 단백질인 소포성 단백질인 소포체 1(vGlut1)이 활성 영역 단백질인 Munc18-1보다 더 빨리 시냅스로 축적된다는 것을 입증했습니다. Munc18-1 세포 체를 제거 한 후에도 presynapse에 의존적으로 축적 된 번역. 이 발견은 세포체에서 수송되지 않는 축색에 있는 현지 번역에 의하여 Munc18-1 축적을 나타냅니다. 결론적으로,이 방법은 시 냅 스 및 시 냅 스 단백질의 소스에 시 냅 스 단백질의 축적을 분석 하는 데 적합 하다. 뉴런 볼 배양이 간단하고 특수 장치를 사용할 필요가 않기 때문에이 방법은 다른 실험 플랫폼에 적용 될 수 있습니다.
Introduction
시냅스 형성은 신경 회로 1,2,3의발달 중에 중요한 단계 중 하나입니다. 시냅스 전후로 구성된 전문 구획의 형성은 축삭과 모수석의 적절한 인식, 활성 영역 및 후발성 밀도의 형성, 그리고 적절한 정렬을 포함하는 복잡하고 다단계 과정입니다. 이온 채널 및 신경전달 물질 수용체 1,2. 각 과정에서, 시 냅 스 단백질의 많은 종류는 세포 체에서 시 냅 스 단백질을 수송 하 여 적절 한 타이밍에 이러한 전문 된 구획에 축적 및/또는 구획에 로컬 번역에 의해. 이러한 시 냅 스 단백질 기능 시 냅 스를 형성 하기 위해 조직 된 방식으로 배열 될 것으로 간주 됩니다. 시 냅 스 형성을 포함 하는 일부 시 냅스 단백질의 기능 장애 는 신경 질환 결과 4,5. 그러나, 그것은 불분명 한 방법 시 냅 스 단백질 적절 한 타이밍에 축적.
시 냅 스 단백질 조직 된 방식으로 축적 하는 방법을 조사 하기 위해, 연대순으로 시 냅 스 단백질의 축적을 검사 하는 데 필요한. 일부 보고서는 뉴런의 해리 된 문화에서 시냅스 형성을관찰하기 위해 라이브 이미징을 입증 6,7. 그러나, 그것은 단지 현미경 검사법에서 시 냅 스 형성을 시작 하는 신경 세포를 찾는 시간이 많이 걸립니다. 시 냅 스 단백질의 축적을 효율적으로 관찰 하기 위해, 시 냅 스 형성 연구원이 형성을 유도 하 고 싶은 시간에 시작 해야 합니다. 두 번째 과제는 세포체로부터의 수송 또는 시냅스의 국소 번역으로 인한 시냅스 단백질의 축적을 구별하는 것입니다. 그 목적을 위해, 번역 수준은 세포체에서 시냅스 단백질의 수송을 허용하지 않는 조건하에서 측정될 필요가 있습니다.
뉴런 볼 배양과 구슬의 조합을 이용하여 새로운 프리시냅스 형성 분석방법을 개발하여 프리시냅스 형성을 유도한다8. 뉴런 볼 배양은 세포체9,10을둘러싼 축색 시트의 형성으로 인해 축색 표현형을 검사하기 위해 개발된다. 우리는 흥분성 presynapssss를 유도하는 시냅스 조이커인 류신 풍부 한 반복 막 간 뉴런 2 (LRRTM2)와 결합 된 자기 구슬을 사용 (그림1A)11,12,13. LRRTM2 비드를 사용하여, 구슬이 적용되는 시점에서 presynapse 형성이 시작됩니다. 즉, presynapse 형성 은 동시에 뉴런 볼의 축축의 수천에서 시작, 따라서 그것은 시 냅 스 단백질의 축적의 정확한 시간 과정을 효율적으로 검사 할 수 있습니다. 또한, 뉴런 볼 배양은 세포체를 제거함으로써 소마로부터 시냅스 단백질을수송하는 것을 차단하기 쉽다(도1B)8. 우리는 이미 세포체가 없는 축세포가 생존할 수 있고 세포체 제거 후 적어도 4시간 동안 건강하다는 것을 확인했습니다. 따라서, 이 프로토콜은 시냅스 단백질이 유래되는 곳(세포체 또는 축색)과 시냅스 단백질이 조직화된 방식으로 어떻게 축적되는지 를 조사하는 데 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 뉴런 볼 배양을 사용하여 LRRTM2-비드로 자극된 시냅스 형성을 검사하는 새로운 방법을 개발했습니다. 현재, 대부분의 시냅스 형성 분석은 폴리-D-리신(PDL) 코팅된 비드 및 해리된 배양/미세유체챔버(20,21,22)를포함한다. 이 방법의 장점 중 하나는 LRRTM2 비드입니다. LRRTM2는 neurexin과 상호 작용하여 특히11,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 부분적으로 JSPS 과학 연구를위한 원조에 의해 지원된다 (KAKENHI) (C) (번호 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. 사사키). 노기 테루카즈 박사와 네야자키 마키코(요코하마시 립대학)에게 생물학적 LRRTM2 단백질을 친절하게 공급해 주신 것에 감사드립니다. 또한 기술 지원을 해주신 우에치 호나미와 이시이 리에 대해서도 감사드립니다.
Materials
| Antibody diluent | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| mouse anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) | Nunc | 176740 | |
| Complete EDTA-free | Roche | 11873580001 | |
| cooled CCD camera | Andor Technology | iXON3 | |
| Coverslip | Matsunami | C015001 | Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| Deoxyribonuclease 1 (DNase I) | Wako pure chemicals | 047-26771 | |
| Expi293 Expression System | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| Horse serum | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| image acquisition software | Nikon | NIS-element AR | |
| Image analysis software | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Inverted fluorecent microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Neurobasal media | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| N-propyl gallate | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus |
Sigma-Aldrich | P3558 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| Prepacked Disposable PD-10 Columns | GE healthcare | 17085101 | |
| rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Streptavidin-coated magnetic particles | Spherotech Inc | SVM-40-10 | diameter: 4-5 µm |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Trypsin | Nacalai Tesque | 18172-94 |
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