Summary

Microscopia de Fluorescência de células vivas para investigar a localização de proteínas subcelulares e alterações da morfologia celular nas bactérias

Published: November 23, 2019
doi:

Summary

Este artigo fornece um guia passo a passo para investigar a dinâmica de localização subcelular de proteínas e monitorar mudanças morfológicas usando microscopia de fluorescência de alta resolução em Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.

Abstract

Investigações de fatores que influenciam a divisão celular e a forma celular em bactérias são comumente realizadas em conjunto com a microscopia de fluorescência de alta resolução, já que observações feitas em nível populacional podem não refletir verdadeiramente o que ocorre em um único nível celular. A microscopia de lapso de tempo de células vivas permite que os investigadores monitorem as mudanças na divisão celular ou na morfologia celular que fornecem insights valiosos sobre a localização subcelular de proteínas e o momento da expressão gênica, como acontece, para potencialmente ajudar a responder a importantes questões biológicas. Aqui, descrevemos nosso protocolo para monitorar mudanças phenotípicas em Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus usando um microscópio de deconvolução de alta resolução. O objetivo deste relatório é fornecer um protocolo simples e claro que possa ser adotado por outros investigadores interessados em realizar experimentos de microscopia de fluorescência para estudar diferentes processos biológicos em bactérias, bem como outros organismos.

Introduction

O campo da biologia celular bacteriana tem sido significativamente reforçada pelos avanços recentes em técnicas de microscopia1,2. Entre outros instrumentos, microscópios capazes de realizar experimentos de microscopia fluorescência de lapso de tempo continuam a ser uma ferramenta valiosa. Os investigadores podem monitorar vários eventos fisiológicos em tempo real usando proteínas fluorescentes, como, fusãos transcricionais e de repórter translacional baseadas em GFP (GFP), d-aminoácidos fluorescentes (FDAA)3,ou usar outras manchas para rotular a parede celular, membrana e DNA. Portanto, não é nenhuma surpresa que a microscopia de fluorescência permaneça popular entre os biólogos de células microbianas. Além de simplesmente mostrar os fenótipos finais, fornecer informações sobre como os fenótipos observados surgem usando microscopia timelapse poderia agregar valor significativo aos resultados e, potencialmente, oferecer pistas sobre o que os processos celulares estão sendo alvo de potenciais candidatos a medicamentos4.

Os protocolos para realizar imagens de alta resolução usando um microscópio de fluorescência totalmente motorizado, invertido e de amplo campo (ver a Tabela de Materiais)são fornecidos neste artigo. Esses protocolos poderiam ser adaptados para atender às necessidades de outros microscópios de fluorescência que são capazes de realizar microscopia timelapse. Embora o software discutido aqui corresponda ao software específico fornecido pelo fabricante, conforme indicado na Tabela de Materiais, software comumente fornecido por outros fabricantes de microscópio ou o ImageJ5livremente disponível, têm ferramentas equivalentes para analisar dados de microscopia. Para condições em que o timelapse não é propício, experimentos de curso de tempo podem ser conduzidos conforme descrito neste artigo. Os protocolos descritos aqui fornecem um guia detalhado para estudar as mudanças phenotípicas em duas espécies bacterianas diferentes: B. subtilis e S. aureus. Veja a Tabela 1 para cepas usadas.

Protocol

1. Condições gerais de crescimento Inocular 2 mL de médio de crescimento adequado complementado com antibióticos (quando necessário) com uma única colônia da cepa (s) para ser imagem. Incubar essas culturas de sementes durante a noite a 22 °C em uma incubadora tremendo.NOTA: As condições específicas de crescimento bacteriano utilizadas neste artigo são fornecidas na seção de resultados representativos. Diluir culturas durante a noite 1:20 em novos meios de comunicação em um frasco …

Representative Results

Fenótipos gpsbAnteriormente, mostramos que o Sa-GpsB é uma proteína essencial, pois o esgotamento do GpsB usando um RNA antisenso resulta em lysiscelular 9. Aqui descrevemos como o surgimento de vários fenótipos de divisão celular e mudanças na localização de proteínas poderiam ser capturados usando o protocolo de microscopia timelapse descrito neste artigo. Para este fim, S. aureus cepas RB143 [SH1000 abrigando pEPSA5 (vetor vazio)] e GGS8 [SH1000 abrigando…

Discussion

A microscopia permaneceu um pilar nos estudos relativos a organismos microbianos. Dado o tamanho das células em escala de mícron, estudos de nível unicelular têm tradicionalmente invocado microscopia eletrônica (EM). Embora em tornou-se uma técnica bastante poderosa nos últimos anos, ele tem suas próprias limitações intrínsecas, além de acesso limitado ao usuário16. Melhorias nas técnicas de microscopia de fluorescência e desenvolvimento de diferentes sondas fluorescentes, como a FD…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos aos nossos membros do laboratório por seus comentários sobre este artigo. Este trabalho foi financiado por uma concessão start-up da Universidade do Sul da Flórida (PE).

Materials

Agarose Fisher BioReagents BP160-100 Molecular Biology Grade – Low EEO
DAPI Invitrogen D3571 Microscopy
FM4-64 Invitrogen T3166 Microscopy
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-14-C Microscopy
IPTG Fisher BioReagents BP1755-10 Dioxane-free
Microscope GE DeltaVision Elite Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber – opaque.
PC190723 MilliporeSigma 3445805MG FtsZ inhibitor
SoftWorx GE Manufacturer-supplied imaging software

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Cite This Article
Brzozowski, R. S., White, M. L., Eswara, P. J. Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria. J. Vis. Exp. (153), e59905, doi:10.3791/59905 (2019).

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