Summary

Флуоресценция live-Cell для изучения локализации субклеточного белка и изменения клеточной морфологии в бактериях

Published: November 23, 2019
doi:

Summary

Данная статья представляет пошаговое руководство по изучению динамики субклеточной локализации белка и мониторингу морфологических изменений с помощью флуоресценционной микроскопии высокого разрешения в Bacillus subtilis и staphylococcus aureus.

Abstract

Исследования факторов, влияющих на деление клеток и форму клеток в бактериях, обычно выполняются в сочетании с флуоресценцией высокого разрешения, поскольку наблюдения, сделанные на уровне популяции, могут не отражать то, что происходит на уровне одной клетки. Видеоклеточная микроскопия таймлапса позволяет следователям отслеживать изменения в делении клеток или морфологии клеток, которые дают ценную информацию относительно субклеточной локализации белков и времени экспрессии генов, как это происходит, потенциально помогает в ответе на важные биологические вопросы. Здесь мы описываем наш протокол для мониторинга фенотипических изменений в Bacillus subtilis и staphylococcus aureus с помощью микроскопа деконволюции высокого разрешения. Цель юного доклада состоит в том, чтобы обеспечить простой и четкий протокол, который может быть принят другими следователями, заинтересованными в проведении экспериментов флуоресценции микроскопии для изучения различных биологических процессов в бактериях, а также других организмов.

Introduction

Поле бактериальной биологии клеток была значительно расширена в последнее время достижения в микроскопии методы1,2. Среди других инструментов, микроскопы, которые способны проводить timelapse флуоресценции микроскопических экспериментов остаются ценным инструментом. Исследователи могут контролировать различные физиологические события в режиме реального времени с помощью флуоресцентных белков, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP) на основе транскрипционного и трансляционного репортера слияний, флуоресцентные D-аминокислоты (FDAA)3, или использовать другие пятна для обозначения клеточной стенки, мембраны и ДНК. Поэтому неудивительно, что флуоресцентная микроскопия остается популярной среди микробных клеток биологов. В дополнение к просто показывать конечные фенотипы, предоставляя информацию о том, как наблюдаемые фенотипы возникают с помощью timelapse микроскопии может добавить значительную ценность для выводов и потенциально предлагают подсказки относительно того, что клеточные процессы в настоящее время мишенью потенциальных кандидатов наркотиков4.

Протоколы для проведения изображений высокого разрешения с использованием полностью моторизованного, перевернутого широкоугольного флуоресценционного микроскопа (см. таблицу материалов)предусмотрены в этой статье. Эти протоколы могут быть адаптированы в соответствии с потребностями других флуоресцентных микроскопов, которые способны проводить таймлапс микроскопию. Хотя программное обеспечение обсуждается здесь соответствует конкретным производителем поставляется программное обеспечение, как указано в таблице материалов, программное обеспечение обычно поставляется другими производителями микроскопа или свободно доступны ImageJ5, имеют эквивалентные инструменты для анализа данных микроскопии. В условиях, когда промежуток времени не является благоприятным, эксперименты по временному курсу могут быть проведены, как описано в настоящей статье. Описанные здесь протоколы содержат подробное руководство по изучению фенотипических изменений в двух различных бактериальных видах: B. subtilis и S. aureus. См Таблица 1 для используемых штаммов.

Protocol

1. Общие условия роста Прививать 2 мл соответствующей среды роста дополнен антибиотиками (при необходимости) с одной колонией штамма (ы), чтобы быть изображены. Инкубировать эти культуры семян на ночь при 22 градусах Цельсия в дрожащего инкубаторе.ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные условия ро…

Representative Results

Фенотипы GPSBРанее мы показали, что Sa-GpsB является важным белком, как истощение GPSB с помощью антисмысловой РНК приводит к лизам клетки9. Здесь мы описываем, как появление различных фенотипов деления клеток и изменения в локализации белка могут быть захвачены с помо?…

Discussion

Микроскопия остается основой в исследованиях, относящихся к микробным организмам. Учитывая их размер клеток микрон, одноклеточные исследования традиционно опирались на электронную микроскопию (ЭМ). Хотя EM стал довольно мощным методом в последние годы, он имеет свои собственные внутре…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим наших сотрудников лаборатории за их комментарии к этой статье. Эта работа была профинансирована за счет стартового гранта от Университета южной Флориды (PE).

Materials

Agarose Fisher BioReagents BP160-100 Molecular Biology Grade – Low EEO
DAPI Invitrogen D3571 Microscopy
FM4-64 Invitrogen T3166 Microscopy
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-14-C Microscopy
IPTG Fisher BioReagents BP1755-10 Dioxane-free
Microscope GE DeltaVision Elite Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber – opaque.
PC190723 MilliporeSigma 3445805MG FtsZ inhibitor
SoftWorx GE Manufacturer-supplied imaging software

References

  1. Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
  2. Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).
  3. Hsu, Y. P., et al. Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls. Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).
  4. Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).
  5. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  6. Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria. Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).
  7. McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
  8. Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. A workingperson’s guide to deconvolution in light microscopy. Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).
  9. Eswara, P. J., et al. An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics. Elife. 7, (2018).
  10. Haeusser, D. P., Margolin, W. Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).
  11. Du, S., Lutkenhaus, J. At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring. Trends in microbiology. , (2019).
  12. Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).
  13. Brzozowski, R. S., et al. Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).
  14. Elsen, N. L., et al. Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity. Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).
  15. Haydon, D. J., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
  16. Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy. Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).
  17. Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).
  18. Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations. Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).
  19. Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).
  20. Yao, Z., Carballido-Lopez, R. Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules. Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).
  21. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  22. Fredborg, M., et al. Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria. BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).
  23. Ursell, T., et al. precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library. BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).

Play Video

Cite This Article
Brzozowski, R. S., White, M. L., Eswara, P. J. Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria. J. Vis. Exp. (153), e59905, doi:10.3791/59905 (2019).

View Video