Den här artikeln innehåller en steg-för-steg-guide för att undersöka protein subcellulär lokalisering dynamik och övervaka morfologiska förändringar med högupplöst fluorescens mikroskopi i Bacillus subtilis och Staphylococcus aureus.
Undersökningar av faktorer som påverkar celldelning och cell form hos bakterier utförs vanligen tillsammans med högupplöst fluorescens-mikroskopi, eftersom observationer som gjorts på populationsnivå inte riktigt återspeglar vad som sker på en enda cellnivå. Live-cell Timelapse mikroskopi kan utredarna att övervaka förändringar i celldelning eller cellmorfologi som ger värdefulla insikter om subcellulär lokalisering av proteiner och timing av genuttryck, som det händer, till potentiellt stöd i att besvara viktiga biologiska frågor. Här, vi beskriver vårt protokoll för att övervaka fenotypiska förändringar i Bacillus subtilis och Staphylococcus aureus med hjälp av en högupplöst deconvolution Mikroskop. Syftet med denna rapport är att tillhandahålla ett enkelt och tydligt protokoll som kan antas av andra utredare som är intresserade av att bedriva fluorescensmikroskopi experiment för att studera olika biologiska processer i bakterier och andra organismer.
Området för bakteriell cellbiologi har förbättrats avsevärt genom de senaste framstegen inom mikroskopi tekniker1,2. Bland andra instrument, Mikroskop som kan utföra Timelapse fluorescens mikroskopi experiment förblir ett värdefullt verktyg. Utredare kan övervaka olika fysiologiska händelser i realtid med hjälp av fluorescerande proteiner som, grön fluorescerande protein (GFP)-baserade transkriptionella och translationella reporter fusioner, fluorescerande D-aminosyror (FDAA)3, eller använda andra fläckar för märkning av cellväggen, membran och DNA. Det är därför ingen överraskning att fluorescensmikroskopi fortfarande är populärt bland mikrobiella cellbiologer. Förutom att bara visa slutet fenotyper, ge information om hur de observerade fenotyperna uppstår med hjälp av Timelapse mikroskopi kan tillföra betydande värde till resultaten och potentiellt ge ledtrådar om vilka cellulära processer som riktas mot potentiella läkemedelskandidater4.
Protokollen för att genomföra högupplösta bilder med hjälp av ett helt motoriserat, inverterat, brett fält fluorescens-Mikroskop (se material tabellen) finns i denna artikel. Dessa protokoll kan anpassas för att passa behoven hos andra fluorescensmikroskop som kan utföra Timelapse-mikroskopi. Även om programvaran diskuteras här motsvarar den specifika tillverkaren medföljande programvara som anges i tabellen av material, programvara som vanligen tillhandahålls av andra Mikroskop tillverkare eller fritt tillgängliga imagej5, har likvärdiga verktyg för att analysera mikroskopi data. För villkor där Timelapse inte bidrar, kan tidsförlopp experiment utföras enligt beskrivningen i denna artikel. De protokoll som beskrivs här ger en detaljerad guide för att studera fenotypiska förändringar i två olika bakteriearter: B. subtilis och S. aureus. Se tabell 1 för stammar som används.
Mikroskopi har varit en stöttepelare i studier som rör mikrobiella organismer. Med tanke på deras micron skala Cellstorlek, encellig nivå studier har traditionellt förlitat sig på elektronmikroskopi (EM). Även om EM har blivit en ganska kraftfull teknik under de senaste åren har det sina egna inneboende begränsningar utöver begränsad användaråtkomst16. Förbättringar i fluorescensmikroskopi tekniker och utveckling av olika fluorescerande sonder, såsom FDAA3, …
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar våra labb medlemmar för deras kommentarer om den här artikeln. Detta arbete finansierades genom ett startbidrag från University of South Florida (PE).
Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade – Low EEO |
DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber – opaque. |
PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |