Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

NMR القائمة على تحليل النشاط لتحديد تثبيط مركب, قيم IC50, نشاط Artifactual, ونشاط الخلية الكاملة من النوكليوسيد الريبوهيدرولاسيس

Published: June 30, 2019 doi: 10.3791/59928
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

Summary

وقد وضعت اختبارات النشاط القائمة على NMR لتحديد وتوصيف مثبطات اثنين من الإنزيمات الريبوهيدرولاز النوكليوسيد. يتم توفير بروتوكولات للاختبارات المركبة الأولية في 500 ميكروم و 250 ميكرومتر، واختبارات استجابة الجرعة لتحديد قيم IC50، وفحوصات المنظفات المضادة للشاشة، واختبارات الشاشة المضادة لتخفيف القفزة، والفحوصات في الخلايا القولونية بأكملها.

Abstract

وكثيراً ما يستخدم التحليل الطيفي لـ NMR لتحديد وتوصيف مثبطات الإنزيم في اكتشاف الأدوية، ولا سيما في سياق فحص الشظايا. وتختبر الاختبارات القائمة على النشاط القائم على معدل وفيات الوفيات الضعيفة بشكل مثالي للعمل في التركيزات الأعلى لمركبات الاختبار اللازمة للكشف عن هذه المثبطات الأضعف. يمكن للنطاق الديناميكي وتشتت التحول الكيميائي في تجربة NMR بسهولة حل الرنين من الركيزة والمنتج ومركبات الاختبار. وهذا يتناقض مع الاختبارات الطيفية، التي غالباً ما تنشأ فيها مشاكل تداخل القراءة من المركبات ذات الخصائص المتداخلة لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لأنها تفتقر إلى الإنزيمات مراسل، واختبارات NMR الإنزيم واحد ليست عرضة للإيجابيات كاذبة مقرونة بالقياس. هذه السمة يجعلها مفيدة كاختبارات متعامدة، تكمل الاختبارات التقليدية عالية الإنتاجية الفحص واختبارات الفرز على مقاعد البدلاء. يتم توفير بروتوكولات مفصلة للاختبارات المركبة الأولية في 500 ميكروم و 250 ميكرومتر، واختبارات استجابة الجرعة لتحديد قيم IC50، وفحوصات المنظفات المضادة للشاشة، وفحوصات الشاشة المضادة لتخفيف القفزة، والفحوصات في الخلايا القولونية بأكملها. يتم عرض الأساليب باستخدام اثنين من الإنزيمات الريبوهيدرولاز النوكليوسيد. يظهر استخدام 1H NMR للإنزيم الخاص بالبيورين، في حين يظهر 19F NMR للإنزيم الخاص بالبيريميدين. تنطبق البروتوكولات بشكل عام على أي إنزيم حيث يمكن ملاحظة الركيزة والرنين المنتج وتمييزه بالتحليل الطيفي NMR. لتكون الأكثر فائدة في سياق اكتشاف المخدرات، يجب أن يكون التركيز النهائي للركيزة لا يزيد عن 2-3x قيمة Km. يعتمد اختيار تجربة NMR على تفاعل الانزيم وركائز المتاحة، فضلا عن الأجهزة NMR المتاحة.

Introduction

التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) راسخ لتوصيف ورصد تفاعلات الإنزيم1،2. وتستخدم الاختلافات في التحولات الكيميائية وأنماط اقتران للتمييز بين الركيزة والرنين المنتج، وتستخدم كثافة الرنين النسبي لتحديد مقدار نسبة رد الفعل. ويلاحظ استهلاك الركيزة وابتكار المنتج مباشرة في طيف الـ NMR. وهذا يتناقض مع القياس الطيفي أو التحليل الطيفي للفلور، حيث يشار إلى مسار زمن التفاعل بتغيير في الامتصاص يعزى إلى بعض الأنواع الكيميائية التي يتم استهلاكها أو إنشاؤها. تماما كما هو الحال مع الطرق الأخرى، يمكن استخدام NMR لدراسة ردود فعل الإنزيم كدالة لدرجة الحرارة، ودرجة الألف، أو غيرها من شروط الحل، ويمكن تحديد آثار مثبطات.

في الآونة الأخيرة، تم إثبات فحوصات نشاط الإنزيم القائم على NMR لفحص الشظايا3و4. الاختبارات المستندة إلى NMR هي مناسبة بشكل مثالي للعمل في تركيزات أعلى من مركبات الاختبار (غالباما ما يصل إلى 1 mM) اللازمة للكشف عن هذه المثبطات أضعف. يمكن للنطاق الديناميكي وتشتت التحول الكيميائي في تجربة NMR بسهولة حل الرنين من الركيزة والمنتج ومركبات الاختبار. ويقارن ذلك بشكل إيجابي باختبارات الطيف الطيفي حيث تنشأ مشاكل تداخل القراءة من المركبات ذات التشكيلات الجانبية المتداخلة للامتصاص فوق البنفسجي. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لأنها تفتقر إلى الإنزيمات مراسل، واختبارات NMR الإنزيم واحد ليست عرضة للإيجابيات كاذبة مقرونة بالقياس. هذه الميزة يجعلها مفيدة كما الاختبارات متعامدة، واستكمال التقليدية عالية الإنتاجية فحص الاختبارات والفرز على مقاعد البدلاء5.

في مختبر البحوث لدينا، وتستخدم اختبارات النشاط القائم على NMR لتحديد وتقييم مثبطات تريتشوناز المهبلية النوكليوسيد الريبيوهيدرولاز. الطفيلي المهبلي T. يسبب المرض غير الفيروسي ة المنقولة جنسيا ً6. زيادة المقاومة للعلاجات القائمة7 هو الدافع للحاجة إلى علاجات جديدة، آلية القائم، مع الإنزيمات الأساسية مسار الإنقاذ النوكليوسيد تمثل الأهداف الرئيسية8. وقد تم تطوير اختبارات النشاط المستندة إلى NMR لكل من الإنزيمات الخاصة بالبيريميدين والبيورين، والريدين نوكليوسيد ريبوهيدرولاز (UNH)9، والأدينوسين / غوانوزين مفضلا النوكليوسيد ريبوهيدرولاز (AGNH)10. وترد ردود الفعل التي حفزت من قبل هذه الإنزيمات اثنين في الشكل 1. وتستخدم الاختبارات NMR لفحص مكتبات أجزاء لنقاط البداية الكيميائية، وتحديد قيم IC50، والازهاتمن مثبطات ربط التجميع أو التكافؤ 11 . ويجري أيضا ترجمة نفس الاختبارات لتقييم نشاط الإنزيم في الخلايا كلها12.

يتم توفير بروتوكولات مفصلة للاختبارات المركبة الأولية في 500 ميكروم و 250 ميكرومتر، واختبارات استجابة الجرعة لتحديد قيم IC50، وفحوصات المنظفات المضادة للشاشة، وفحوصات الشاشة المضادة لتخفيف القفزة، والفحوصات في الخلايا القولونية بأكملها. تنطبق البروتوكولات بشكل عام على أي إنزيم يمكن أن يلاحظ فيه الركيزة والرنين المنتج ويميزه التحليل الطيفي NMR. وقد وضعت ثلاثة افتراضات للبساطة. أولاً، لم يتم تحديد الركيزة. وبالنسبة لفحوصات الأنشطة القائمة على معدل الوفيات الثلاثة لكي تكون مفيدة، ينبغي ألا يزيد التركيز النهائي للركيزة عن 2-3 x قيمة Km 4. في الأمثلة المعروضة، التركيزات النهائية من الأدينوسين و 5-فلورورين هو 100 ميكرومتر (ك = 54 ميكرومتر) و 50 ميكرومتر (ك = 15 ميكروم)، على التوالي. في البروتوكولات، وتحقيق هذه التركيزات يتوافق مع 12 μL من 5 m الأدينوسين أو 12 ميكرولتر من 2.5 mM 5-fluorouridine.

ثانياً، تم اختيار كمية الإنزيم المنصوص عليها في البروتوكولات، 5 μL، لتتوافق مع المبلغ المطلوب لينتج عن تحويل الركيزة إلى منتج بنسبة 75% تقريبًا في 30 دقيقة. هذه الكمية تمثل عادة تخفيفكبير من مخزون الإنزيم النقي، ويجب تحديد التخفيف مقدما لكل إنزيم. يتم تخزين حلول الإنزيم المنقي AGNH وUNH عند -80 درجة مئوية في الأليقوات التي توفر ما يكفي من الإنزيم لعدة آلاف من ردود الفعل. وبالتالي، فإن عامل التخفيف من الناحية المثالية يحتاج فقط إلى تحديد أو التحقق من صحته كل بضعة أشهر. ثالثاً، لم يتم تحديد تجربة NMR 1D المحددة. في النتائج التمثيلية، يظهر معدل1 H NMR لAGNH10 ويظهر 19F NMR لUNH9، مع تجربة NMR المذكورة في المراجع المقابلة. يعتمد اختيار تجربة NMR على تفاعل الانزيم وركائز المتاحة، فضلا عن الأجهزة NMR المتاحة. وأخيراً، تجدر الإشارة إلى أن النهج التجريبي الموصوف لا يلتزم بالمتطلبات الصارمة للمعدل الكمّي (QNMR)13,14. في البروتوكول، يتم تحديد رد فعل النسبة المئوية باستخدام التغيرات النسبية في كثافة نفس الرنين في كل طيف، بدلا من تحديد التركيزات المطلقة. هذا النهج يلغي الحاجة إلى الحصول على البيانات وتعديلات المعالجة، فضلا عن المعايير الداخلية أو الخارجية، التي هي مطلوبة لqNMR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. اختبار اختبار أولي اختبار اختبار اختبار في 500 μM و 250 μM

  1. إعداد الركيزة ومركب الاختبار لردود الفعل.
    1. إعداد حلول المخزون من الركيزة (الأدينوسين أو 5-فلوروورديدين) في الماء و50 m مركب اختبار في ثنائي ميثيل سولفسيد deuterated (DMSO). راجع قسم المقدمة لتركيزات محلول الركيزة لاستخدامها.
    2. إضافة 12 ميكرولتر من الركيزة (الأدينوسين أو 5-فلوروريدين) إلى كل من أربعة 1.5 أنابيب ميكروفوغ مل، 1-4.
    3. إضافة 6 μL من DMSO deuterated إلى أنابيب 1 (0 دقيقة التحكم) و 4 (30 دقيقة التحكم). إضافة 6 μL من مركب الاختبار إلى أنبوب 2. إضافة 3 μL من مركب الاختبار و 3 μL من DMSO deuterated إلى أنبوب 3.
  2. إعداد ما يكفي من حل المخزون رد فعل.
    ملاحظة: حل المخزون هو لخمسة ردود الفعل التي تحتوي كل 517 ميكرولتر من العازلة، 60 ميكرولتر من أكسيد الديوتريوم، و 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم (AGNH أو UNH). راجع قسم المقدمة لتركيز محلول الانزيم لاستخدامها.
    1. إضافة 2.59 مل من العازلة رد فعل (50 mM فوسفات البوتاسيوم، 0.3 M KCl، ودرجة الحموضة 6.5) إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة 300 μL من أكسيد ديوتيريوم إلى الأنبوب المخروطي. أضف 25 ميكرولتر من محلول الانزيم (AGNH أو UNH) إلى المخروطية.
    2. قلب بلطف أنبوب مخروطي مرتين لخلط.
  3. في وقت واحد بدء وإرواء رد فعل التحكم دقيقة 0. نقل 582 μL من محلول المخزون رد الفعل إلى أنبوب ميكروفوغ نظيفة. إضافة 10 μL من 1.5 M HCl إلى هذا الأنبوب microfuge. نقل مجتمعة 592 ميكروفأنبوب 1 ميكروفوغ. يستنشق ويوزع العينة مرتين بطريقة بطيئة ولكنها متعمدة.
  4. بدء وتشغيل ردود الفعل الثلاثة المتبقية بطريقة متداخلة. في الوقت 0 دقيقة، نقل 582 μL من محلول المخزون رد الفعل إلى أنبوب ميكروفوغ 2. يستنشق ويوزع العينة مرتين بطريقة بطيئة ولكنها متعمدة. كرر على فترات 30 s لأنابيب ميكروفوغ 3 و 4. انتظر 30 دقيقة
  5. تهدئة ردود الفعل. في الوقت 30 دقيقة، إضافة 10 ميكرولتر من 1.5 M HCl إلى ميكروفوغ 2. كرر على فترات 30 s لأنابيب ميكروفوغ 3 و 4. نقل 600 ميكرولتر من الحل من كل ميكروفوغ إلى أنابيب NMR.
  6. الحصول على طيف معدل وفيات العشرة من خلال كل عينة. معالجة البيانات لضمان الطور الطوري الصحيح وخطوط الأساس الثابتة.
  7. حساب النسبة المئوية لتحويل الركيزة لأطياف التحكم.
    1. تراكب الأطياف لمدة 0 دقيقة و 30 دقيقة الضوابط. قياس إشارة الركيزة في التحكم دقيقة 0 لمطابقة التحكم 30 دقيقة. لاحظ هذه النسبة المئوية.
    2. حساب النسبة المئوية للتحويل كـ (100 - النسبة المئوية المحددة في الخطوة 1.7.1).
  8. حساب النسبة المئوية لتحويل الركيزة لتفاعلات تحتوي على مركب الاختبار.
    1. الأطياف التراكبية للتحكم لمدة 0 دقيقة وتفاعل أول يحتوي على مركب اختبار 500 ميكرومتر. قم بتحجيم إشارة الركيزة في عنصر التحكم بـ 0 دقيقة لمطابقة الطيف مع مركب الاختبار. لاحظ هذه النسبة المئوية. حساب التحويل بنسبة مئوية كـ (100 - تحديد النسبة المئوية).
    2. كرر التفاعل الثاني الذي يحتوي على مركب اختبار 250 ميكرومتر.
  9. حساب رد الفعل في المئة وتثبيط في المئة لكل تركيز مركب اختبار.
    1. حساب رد الفعل في المئة كما (1.8.1/1.7.2) × 100.
    2. حساب التثبيط في المئة كما (100 - النسبة المئوية المحددة في الخطوة 1.9.1).

2. تحديد القيمIC 50

  1. إعداد الركيزة ومركب الاختبار لردود الفعل.
    1. إعداد حلول المخزون من الركيزة (الأدينوسين أو 5-فلورورين) في الماء و10 m مجمع اختبار في DMSS deuterated. راجع قسم المقدمة لتركيزات محلول الركيزة لاستخدامها.
  2. إعداد التمييع التسلسلي من 10 mM اختبار مركب (في DMSO deuterated).
    1. أضف 36 ميكرولتر DMSO deuterated إلى خمسة 1.5 أنابيب ميكروفوغ 1.5 مل، 1-5.
    2. إضافة 12 μL 10 mm اختبار مجمع إلى أنبوب 1 والاستفادة برفق لخلط. مجمع الاختبار هو الآن 2.5 m.
    3. نقل 12 ميكرولتر من أنبوب 1 إلى أنبوب 2 والاستفادة طفيفة لخلط. مجمع الاختبار هو الآن 0.63 m. نقل 12 μL من أنبوب 2 إلى أنبوب 3 والاستفادة طفيفة لخلط. مركب الاختبار هو الآن 0.16 m. نقل 12 μL من أنبوب 3 إلى أنبوب 4 والاستفادة طفيفة لخلط. مركب الاختبار الآن 0.04 m. نقل 12 μL من أنبوب 4 إلى أنبوب 5 والاستفادة طفيفة لخلط. مركب الاختبار الآن 0.01 m.
  3. إعداد 14 1.5 مل ميكروفوغ أنابيب لردود الفعل.
    1. إضافة 12 ميكرولتر من الركيزة (الأدينوسين أو 5-فلوروريدين) إلى كل من 14 1.5 أنابيب ميكروفوغ مل، 1-14.
    2. إضافة 12 μL من DMSO deuterated إلى أنابيب 1 (0 دقيقة التحكم) و 14 (30 دقيقة التحكم).
    3. إضافة 12 μL من 10 mm اختبار المجمع إلى أنبوب 2 و 3. إضافة 12 μL من 2.5 mm اختبار المجمع إلى أنابيب 4 و 5. إضافة 12 μL من 0.63 m m اختبار المجمع إلى أنابيب 6 و 7. إضافة 12 μL من 0.16 m m اختبار المجمع إلى أنابيب 8 و 9. إضافة 12 μL من 0.04 mm اختبار المجمع إلى أنابيب 10 و 11. إضافة 12 μL من 0.01 mM اختبار المجمع إلى أنبوب 12 و 13.
  4. إعداد حل مخزون رد فعل كاف لتشغيل 15 ردود الفعل التي تحتوي على 511 ميكرولتر من العازلة، 60 ميكرولتر من أكسيد الديوتريوم، و 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم (AGNH أو UNH) لكل منهما. راجع قسم المقدمة لتركيز محلول الانزيم لاستخدامها.
    1. إضافة 7.67 مل من العازلة رد فعل (50 mM فوسفات البوتاسيوم، 0.3 M KCl، ودرجة الحموضة = 6.5) إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة 900 ميكرولتر من أكسيد الديوتريوم إلى الأنبوب المخروطي. أضف 75 ميكرولتر من محلول الانزيم (AGNH أو UNH) إلى المخروطية.
    2. عكس بلطف أنبوب مخروطي 2X لخلط.
  5. اتبع الخطوات المبينة في الخطوات 1.3-1.9 إلى (باستخدام 576 ميكرولتر من محلول مخزون التفاعل) لتحديد نسبة التفاعل لكل تركيز مركب اختباري.
  6. احسب قيمة IC50 باستخدام GraphPad Prism.
    1. إنشاء جدول بيانات يربط بين سجل التركيزات المركبة لاختبار التفاعل (200 ميكرومتر، 50 ميكرومتر، 12.5 ميكرومتر، 3.13 ميكرومتر، 0.78 ميكرومتر، 0.20 ميكرومتر) مع تفاعل النسبة المئوية (قيمتان لكل منهما).
    2. استخدم منحنى غير خطي مناسب لتحديد قيمة IC50 والخطأ القياسي.

3. المنظفات فحوصات الشاشة المضادة في 100 ميكرومتر و 50 ميكرومتر

  1. إعداد الركيزة ومركب الاختبار لردود الفعل.
    1. إعداد حلول المخزون من الركيزة (الأدينوسين أو 5-فلورورين) في الماء و10 m مجمع اختبار في DMSS deuterated. راجع قسم المقدمة لتركيزات محلول الركيزة لاستخدامها.
    2. إضافة 12 ميكرولتر من الركيزة (الأدينوسين أو 5-فلوروريدين) إلى كل من ثمانية 1.5 أنابيب ميكروفوغ مل، 1-8.
    3. إضافة 6 μL من DMSO deuterated إلى أنابيب 1 و 5 (0 دقيقة الضوابط) و 4 و 8 (30 دقيقة الضوابط). إضافة 6 μL من مركب الاختبار إلى أنابيب 2 و 6. إضافة 3 μL من مركب الاختبار و 3 μL من DMSO deuterated إلى أنابيب 3 و 7.
  2. إعداد ما يكفي من محلول المخزون رد فعل دون المنظفات لتشغيل خمسة ردود الفعل التي تحتوي على 517 μL من العازلة، 60 ميكرولتر من أكسيد ديوتريوم، و 5 ميكرولتر من محلول الإنزيم (AGNH أو UNH) لكل منهما. راجع قسم المقدمة لتركيز محلول الانزيم لاستخدامها.
    1. إضافة 2.59 مل من العازلة رد فعل (50 mM فوسفات البوتاسيوم، 0.3 M KCl، ودرجة الحموضة = 6.5) إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة 300 μL من أكسيد ديوتيريوم إلى الأنبوب المخروطي. أضف 25 ميكرولتر من محلول الانزيم (AGNH أو UNH) إلى المخروطية.
    2. عكس بلطف أنبوب مخروطي 2X لخلط.
  3. إعداد ما يكفي من حل المخزون رد فعل مع 0.01٪ v / V تريتون X-100 المنظفات لتشغيل خمسة ردود الفعل التي تحتوي على 517 ميكرولتر من العازلة، 60 لتر من أكسيد ديوتريوم، و 5 μL من محلول الإنزيم (AGNH أو UNH) لكل منهما.
    1. إضافة 2 μL من المنظفات تريتون X-100 إلى 20 مل من العازلة رد فعل (50 mM فوسفات البوتاسيوم، 0.3 M KCl، ودرجة الحموضة = 6.5). يجب استخدام حلول المنظفات في غضون يوم واحد.
    2. إضافة 2.59 مل من العازلة رد فعل تحتوي على 0.01٪ تريتون X-100 المنظفات إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة 300 μL من أكسيد ديوتيريوم إلى الأنبوب المخروطي. أضف 25 ميكرولتر من محلول الانزيم (AGNH أو UNH) إلى المخروطية.
    3. عكس بلطف أنبوب مخروطي 2X لخلط.
  4. بالنسبة للأنابيب 1-4، باستخدام محلول مخزون التفاعل بدون المنظفات، اتبع الخطوات المبينة في الخطوات 1.3-1.9 لتحديد التثبيط في المئة لكل تركيز مركب اختبار.
  5. بالنسبة للأنابيب 5-8، باستخدام حل مخزون التفاعل مع 0.01% v/v Triton X-100 detergent، اتبع الخطوات المبينة في الخطوات 1.3-1.9 لتحديد التثبيط في المئة لكل تركيز مركب اختبار.

4. القفز المخفف فحوصات الشاشة المضادة

  1. إعداد الركيزة ومركبات الاختبار لردود الفعل
    1. إعداد حلول المخزون من الركيزة (الأدينوسين أو 5-فلورورين) في الماء و10 m مجمع اختبار في DMSS deuterated. راجع قسم المقدمة لتركيزات محلول الركيزة لاستخدامها.
    2. إضافة 53.8 μL من العازلة رد فعل (50 mM فوسفات البوتاسيوم، 0.3 M KCl، ودرجة الحموضة = 6.5) إلى اثنين 1.5 مل ميكروفوغ أنابيب (لكل منهما)، 1 و 2. إضافة 5 μL من الإنزيم (AGNH أو UNH) إلى أنبوب 1 و 2.
    3. إضافة 511 μL من العازلة رد فعل إلى اثنين 1.5 مل ميكروفوغ أنابيب، 3 و 4 (لكل منهما). إضافة 60 μL من أكسيد الديوتريوم إلى أنابيب 3 و 4. إضافة 5 μL من الإنزيم (AGNH أو UNH) إلى أنابيب 3 و 4.
    4. إضافة 1.2 μL من DMSO deuterated إلى أنبوب 1 (30 دقيقة التحكم). إضافة 1.2 μL من مركب الاختبار إلى أنبوب 2. إضافة 12 μL من DMSO deuterated إلى أنبوب 3 (30 دقيقة التحكم). إضافة 12 μL من مركب الاختبار إلى أنبوب 4. احتضان لمدة 30 دقيقة.
  2. إعداد اثنين 1.5 مل ميكروفوغ أنابيب مع حل التخفيف.
    1. إضافة 468 μL من العازلة رد فعل إلى كل من أنبوبين ميكروفوغ 1.5 مل، 5 و 6. إضافة 60 μL من أكسيد الديوتريوم إلى كل أنبوب (5 و 6).
  3. إعداد أربعة 1.5 مل ميكروفوغ أنابيب لردود الفعل.
    1. إضافة 12 ميكرولتر من الركيزة (الأدينوسين أو 5-فلوروريدين) إلى كل من أربعة 1.5 مل ميكروفوغ أنابيب, 7-10.
  4. أداء تخفيف اتطم وبدء ردود الفعل.
    1. نقل 528 μL من الحل من أنبوب 5 إلى أنبوب 1. يستنشق ويوزع العينة مرتين بطريقة بطيئة ولكنها متعمدة. نقل 528 μL من الحل من أنبوب 6 إلى أنبوب 2. يستنشق ويوزع العينة مرتين بطريقة بطيئة ولكنها متعمدة.
    2. في الوقت 0 دقيقة، نقل 588 μL من الحل من أنبوب 1 إلى أنبوب 7. يستنشق ويوزع العينة 2x بطريقة بطيئة ولكن متعمدة. على فترات 30 s، نقل 588 μL من الحل من أنبوب 2 إلى أنبوب 8، أنبوب 3 إلى أنبوب 9، وأنبوب 4 إلى أنبوب 10. يستنشق ويوزع العينة مرتين بطريقة بطيئة ولكنها متعمدة. انتظر 30 دقيقة
  5. بالنسبة للأنابيب 7-10، اتبع الخطوات المبينة في الخطوات 1.5-1.9 لتحديد التثبيط في المائة لكل تركيز مركب اختبار.

5. الاختبارات المركبة في E. القولونية الخلايا كلها

  1. إعداد 10 مل الثقافة بين عشية وضحاها من القولونية E. في اليوم السابق التجارب.
  2. إعداد E. الخلايا القولونية لتجارب NMR.
    1. جهاز طرد مركزي للخلايا في 1 مل aliquots لمدة 10 دقيقة في 15،000 x ز.
    2. تجاهل supernatant وإعادة تعليق كل aliquot من الخلايا في 1 مل من العازلة رد فعل (50 mM فوسفات البوتاسيوم، 0.3 M KCl، ودرجة الحموضة = 6.5) عن طريق الدوامة.
  3. اتبع القسمين 1 أو 2 للمقارنة المطلوبة مع التغييرات التالية:
    1. استبدل 280 ميكرولتر من المخزن المؤقت في محلول مخزون التفاعل مع 280 ميكرولتر من الخلايا التي تم إعادة تعليقها.
    2. بديل 5 ميكرولتر من الإنزيم (AGNH أو UNH) في حل رد الفعل مع 5 ميكرولتر من العازلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 2 نتائج اختبار مركبين ضد الأنيه باستخدام معدل1 H NMR بعد القسم 1. وتفاعل الانزيم هو الأكثر سهولة وكمي ً ً باختفاء الأدينوسين وحيد والرنين المزدوج في 8.48 جزء في المليون و 6.09 جزء في المليون، على التوالي، وظهور الرنين الأدينين singlet في 8.33 جزء في المليون كما لوحظ في التحكم 30 دقيقة الطيف. في وجود 500 ميكرومتر مركب 1، لا يتم تشكيل أي منتج كما يتضح من عدم وجود الرنين القبلين في 8.33 جزء في المليون. في وجود 250 μM مركب 1، تم تحويل حوالي 10٪ من الركيزة إلى المنتج. وعلى النقيض من ذلك، لا تركيز المركب 2 يمنع الإنزيم كما يتضح من الركيزة والرنين المنتج تشبه تلك الموجودة في الطيف التحكم 30 دقيقة. تحدد هذه البيانات المركب 1 كمثبط AGNH جيد. لاحظ أن الرنين الناشئ عن المركب 1 (7.70-8.00 و 8.50-8.60 جزء في المليون) ومركب 2 (7.40-7.80 جزء في المليون) لوحظ أيضا. وتستخدم نفس الركيزة والرنين المنتج لرصد ردود الفعل المبينة في الشكل 4، الشكل 6، الشكل 8، والشكل 10. ويبين الشكل 3 نتائج اختبار مركبين ضد الأمم المتحدة باستخدام 19وحدة من المركبات المنتشرين في إطار الوفيات الإنخفاث بعد القسم 1. لوحظ رد فعل الانزيم بسهولة وكمي من خلال اختفاء الرنين 5-فلورواريدين في -165.8 جزء في المليون وظهور 5-fluorouracil الرنين في -169.2 جزء في المليون كما لوحظ في الطيف التحكم 30 دقيقة. لهذا الإنزيم، مركب 2 يمنع تماما رد الفعل في كل من تركيزات في حين أن مركب 1 ليس له أي تأثير. تحدد هذه البيانات المركب 2 كمثبط جيد لـ UNH. وتستخدم نفس الركيزة والرنين المنتج لرصد ردود الفعل المبينة في الشكل 5، الشكل 7، الشكل 9، والشكل 11.

ويبين الشكل 4 بيانات معدل الجرعة والاستجابة للمعدل الإنقازلي ومنحنى IC50 الناتج عن ذلك الذي تم الحصول عليه لمجمع له نشاط في إطار نشاط AGNH باستخدام معدل1 H NMR بعد القسم 2. يتم عرض بيانات NMR لواحدة فقط من التجارب المكررة. لاحظ أن الرنين الناتج عن المركب المختبر (6.90-7.40 جزء في المليون) لا يتعارض مع الركيزة أو رنين المنتج. وكان منحنى IC50 مناسباً باستخدام بيانات من كلتا التجارب وأدى إلى قيمة 12.3 ± 5.0 μM. وتتفق هذه النتيجة مع بيانات معدل وفيات الأمهات في أن الفقدان الكبير لإشارة الركيزة لا يلاحظ حتى ينخفض التركيز المركب إلى 12.5 ميكرومتر. ويبين الشكل 5 بيانات معدل الجرعة والاستجابة للمعدل الإنفير الحراري وما ينتج عن ذلك من منحنى IC50 الذي تم الحصول عليه لمجمع له نشاط في مركز الأمم المتحدة للحماية باستخدام 19من معدل وفيات النابذات F بعد القسم 2. يتم عرض بيانات NMR لواحدة فقط من التجارب المكررة. وكان منحنى IC50 مناسباً باستخدام بيانات من كلتا التجارب وأدى إلى قيمة 16.7 ± 10.4 ميكرومتر. وتتفق هذه القيمة مع بيانات معدل وفيات الأمهات في عدم ملاحظة فقدان إشارة الركيزة بشكل كبير حتى ينخفض التركيز المركب إلى 12.5 ميكرومتر.

ويبين الشكل 6 نتائج اختبار مركب بتركيزين مقابل AGNH في غياب ووجود 0.01٪ من المنظفات Triton X-100 باستخدام 1H NMR بعد القسم 3. ويلاحظ فقط الاختلافات الحد الأدنى في كثافة الركيزة وإشارات المنتج باستخدام الشرطين، مما يدل على أن تثبيط الإنزيم لوحظ ليس قطعة أثرية من تجميع مركب. لاحظ أن الرنين الناشئ عن المركب المختبر (7.10-7.70 جزء في المليون) وتريتون X-100 (6.90 و 7.40 جزء في المليون) لا تتداخل مع الركيزة أو الرنين المنتج. ويبين الشكل 7 نتائج اختبار مركب بتركيزين ضد الأمم المتحدة في غياب ووجود 0.01٪ من المنظفات Triton X-100 باستخدام 19F NMR بعد القسم 3. ويلاحظ فقط الاختلافات الحد الأدنى في كثافة الركيزة وإشارات المنتج باستخدام الشرطين، مما يدل على أن تثبيط الإنزيم لوحظ ليس قطعة أثرية من تجميع مركب.

ويبين الشكل 8 نتائج اختبار مركب في اختبار تخفيف القفزة ضد AGNH باستخدام 1H NMR بعد القسم 4. ويشير انخفاض كثافة إشارة الركيزة في رد فعل 20 μM مقارنة برد فعل 200 μM إلى أن التثبيط قابل للعكس. المركب الذي تم اختباره له قيمة IC50 من 21.0 μM، ويلاحظ الرنين في 6.90-8.30 جزء في المليون. في هذا المثال، تُتداخل الرنين من المركب مع رنين إشارة منتج الأدينين، ويسهل رصد تقدم رد الفعل باستخدام الرنين الأدينوسين عند 6.09 جزء في المليون. ويبين الشكل 9 نتائج اختبار مركب في اختبار تخفيف القفزة ضد الأمم المتحدة باستخدام 19F معدل وفيات النابة بعد القسم 4. تشير زيادة كثافة إشارة المنتج عند -169.2 جزء في المليون في رد فعل 20 ميكرومتر مقارنة برد فعل 200 ميكرومتر إلى أن التثبيط قابل للعكس. المركب الذي تم اختباره له قيمة IC50 16.7 μM.

ويبين الشكل 10 فائدة طريقة إجراء الاختبارات في الخلايا بأكملها باستخدام 1H NMR بعد القسم 5. إشارات الركيزة الأدينوسين ذهبت تماما تقريبا بعد 30 دقيقة في وجود خلايا كاملة، مما يدل على التحلل المائي للركيزة. وعلى النقيض من ذلك، تبقى الركيزة دون تغيير بعد 30 دقيقة في وجود سوبرناتان توسيط نمو الخلايا، مما يشير إلى أن رد فعل التحلل المائي يعتمد على الخلايا. لاحظ وجود العديد من إشارات الخلفية في الأطياف الفائقة، بما في ذلك إشارات ثلاثية مكثفة من NH4+ الأيونات في 6.90-7.15 جزء في المليون التي هي أيضا موجودة إلى درجة أصغر في أطياف الخلية بأكملها. ويبين الشكل 11 فائدة طريقة إجراء الاختبارات في الخلايا بأكملها باستخدام 19F NMR بعد القسم 5. واختفت تماما إشارة الركيزة 5-فلورورين بعد 60 دقيقة في وجود خلايا كاملة، مما يدل على التحلل المائي للركيزة. وعلى النقيض من ذلك، تبقى الركيزة دون تغيير بعد 60 دقيقة في وجود سوبرناتان توسيط نمو الخلايا، مما يشير إلى أن رد فعل التحلل المائي يعتمد على الخلايا.

Figure 1
الشكل 1: ردود الفعل التي حفزها الاتحاد من أجل المرأة (أعلى) وAGNH (أسفل). لاحظ أن UNH سوف تحفز التحلل المائي لكل من الأوريدين و 5-فلوروردين (كما هو موضح). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الاختبارات الأولية التمثيلية للمجمعات عند 500 μ م و 250 μ M ضد AGNH باستخدام 1H NMR. مناطق من 1H الأطياف رد فعل NMR لمجمعين، كل في 500 ميكرومتر و 250 ميكرومتر، جنبا إلى جنب مع 0 دقيقة و 30 دقيقة أطياف التحكم. يحتوي طيف التحكم بـ 0 دقيقة على رنين الركيزة الأدينوسينية عند 6.09 و8.38 و8.48 جزء في المليون. يحتوي طيف التحكم 30 دقيقة على الرنين المنتج الأنيني الجديد في 8.33 جزء في المليون. تحتوي أطياف الاختبار على رنين إضافي ينشأ عن المركب الذي تم اختباره. 1 وقد تمت الإشارة إلى التحولات الكيميائية H إلى حمض ثلاثي ميثيل سيلبروبيوني خارجي عند 0.0 جزء في المليون. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الاختبارات الأولية التمثيلية للمجمعات عند 500 μ م و 250 μ M ضد UNH باستخدام 19F NMR. مناطق من 19F NMR الأطياف رد فعل لمجمعين, كل في 500 ميكرومتر و 250 ميكرومتر, جنبا إلى جنب مع 0 دقيقة و 30 دقيقة أطياف التحكم. يحتوي طيف التحكم بـ 0 دقيقة على نسبة 5-فلورووريدين في -165.8 جزء في المليون. يحتوي طيف التحكم الذي يبلغ 30 دقيقة على الرنين الجديد لمنتج 5-فلوروراسيل بسرعة -169.2 جزء في المليون. 19 وأشير إلى التحولات الكيميائية في المادة 50 من ثلاثي الفلور والميثانول في -76.7 جزء في المليون. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: بيانات معدل الجرعة الممثّلة والاستجابة الممثّلة لمعدل الاستجابة للجرعات وما ينتج عن ذلك من منحنى IC50 تم الحصول عليه لمركب مع نشاط AGNH باستخدام 1H NMR. مناطق من 1H H NMR الأطياف رد فعل لتركيزات متغيرة من مركب (200-0.20 ميكرومتر) جنبا إلى جنب مع 0 دقيقة و 30 دقيقة أطياف التحكم. الرنين من 6.90-7.40 جزء في المليون تنشأ من المجمع اختبارها. تم احتواء منحنى IC50 باستخدام بيانات من مجموعات بيانات NMR تعمل في مكررة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: بيانات معدل الجرعة الممثّلة للجرعات والمنحنيات الناتجة عن الاستجابة للجرعات50 التي تم الحصول عليها لمجمع مع نشاط UNH باستخدام 19F NMR. مناطق من 19F NMR الأطياف رد فعل لتركيزات متغيرة من مركب (200-0.20 ميكرومتر) جنبا إلى جنب مع 0 دقيقة و 30 دقيقة أطياف التحكم. تم احتواء منحنى IC50 باستخدام بيانات من مجموعات بيانات NMR تعمل في مكررة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: فحوصات شاشة مضادة للمنظفات التمثيلية لمجمع له نشاط AGNH باستخدام معدل1 H. مناطق من 1H الأطياف رد فعل NMR لمجمع في 100 ميكرومتر و 50 ميكرومتر، جنبا إلى جنب مع 0 دقيقة و 30 دقيقة أطياف التحكم، في وجود وغياب 0.01٪ تريتون X-100. وتنشأ الرنينات عند 7.10-7.70 جزء في المليون و6.90 و7.40 جزء في المليون من المركب المختبر وTriton X-100، على التوالي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: فحوصات شاشة مضادة للمنظفات التمثيلية لمجمع له نشاط UNH باستخدام 19معدل وفيات الحشرات. مناطق من 19F NMR الأطياف رد فعل لمجمع في 100 ميكرومتر و 50 ميكرومتر، جنبا إلى جنب مع 0 دقيقة و 30 دقيقة أطياف التحكم، في وجود وغياب 0.01٪ تريتون X-100. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: فحوصات شاشة مضادة تمثيلية لتخفيف القفزة لمجمع له نشاط AGNH باستخدام معدل وفيات العشرة H1. مناطق من 1H الأطياف رد فعل NMR لمجمع في 200 ميكرومتر و 20 ميكرومتر، جنبا إلى جنب مع 30 دقيقة أطياف التحكم. تم احتضان الإنزيم لمدة 30 دقيقة عند 200 ميكرومتر قبل بداية ردود الفعل، مع تخفيف رد فعل 20 ميكرومتر مباشرة قبل بدء رد الفعل. الرنين في 6.90-8.30 جزء في المليون تنشأ من المجمع اختبارها. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: فحوصات شاشة مضادة تمثيلية لتخفيف القفزة لمجمع له نشاط UNH باستخدام 19معدل وفيات النابية. مناطق من 19F NMR الأطياف رد فعل لمجمع في 200 ميكرومتر و 20 ميكرومتر، جنبا إلى جنب مع 30 دقيقة أطياف التحكم. تم احتضان الإنزيم لمدة 30 دقيقة عند 200 ميكرومتر قبل بداية ردود الفعل، مع تخفيف رد فعل 20 ميكرومتر مباشرة قبل بدء رد الفعل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: الفحوصات التمثيلية في الخلايا بأكملها باستخدام معدل وفيات الخلايا 1H. مناطق من 1H H NMR الأطياف رد فعل للعينات التي تحتوي إما 280 μL من خلايا القولونية E. إعادة تعليق في العازلة (0, 15, و 30 دقيقة) أو خلية نمو وسائل الإعلام supernatant (30 دقيقة). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 11
الشكل 11: الفحوصات التمثيلية في الخلايا بأكملها باستخدام 19F NMR. مناطق من 19F NMR الأطياف رد فعل للعينات التي تحتوي إما 280 μL من خلايا القولونية E. إعادة تعليق في العازلة (0، 15، 30، و 60 دقيقة) أو خلية نمو وسائل الإعلام supernatant (60 دقيقة). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتوكولات الموصوفة تنطبق عموما على العديد من الإنزيمات، شريطة أن تكون للركائز و/أو المنتجات إشارات قابلة للحل في طيف NMR. ومع ذلك، من الأهمية بمكان أن يكون تركيز الركيزة قريباً من قيمة Km وعالية بما يكفي للكشف في تجربة NMR ضمن إطار زمني معقول. تركيز الركيزة لا يزيد عن 2-3x قيمةM Kهو الأمثل للكشف عن مثبطات تنافسية، غير تنافسية، وغير تنافسية4. كما هو مبين هنا لUNH، الركيزة، Km القيم منخفضة مثل 15 μM مناسبة. ويمكن أن يؤدي استخدام الركيزة مع إشارات CH3 أو CF3، إلى جانب جمع بيانات NMR على المسبارات المبردة، إلى خفض هذه العتبة إلى15درجة أخرى . الإنزيمات التي تحتوي على قيم Km الركيزة أقل من 1 ميكرومتر، ومع ذلك، من المرجح أن يكون من الصعب دراسة باستخدام هذا الأسلوب بسبب حساسية منخفضة المتأصلة في تجربة NMR. وفي هذه الحالات، تكون المنظار الطيفي أو التحليل الطيفي للفلور أكثر ملاءمة.

وهناك قيد آخر على تطبيق هذه الأساليب هو عامل تبريد مناسب. جميع البروتوكولات الموصوفة هنا هي اختبارات ثابتة الوقت، مع رد فعل اطفئ بعد 30 دقيقة من إضافة حمض الهيدروكلوريك. بالنسبة لكل من AGNH وUNH، فقد تم تحديد سابقًا أن حمض الهيدروكلوريك توقف على الفور عن رد الفعل، وأبقى هُذا قد توقف لفترات من الأسابيع9،10. وهذا أمر مهم لأن العشرات من ردود الفعل غالباً ما يتم تشغيلها في وقت واحد ومن ثم في قائمة الانتظار لجمع بيانات NMR على مدى فترة عدة ساعات. ومن المهم أيضاً إثبات أن التحلل غير الإنزيمي للركيزة أو إشارات المنتجات لا يحدث بعد التبريد بل قبل جمع بيانات NMR. بالإضافة إلى حمض الهيدروكلوريك، طرق أخرى شائعة لإرواء التفاعلات هي عن طريق إضافة مثبط نانومولار معروف16 أو، في حالة ردود الفعل التي تنطوي على الأدينوسين ثلاثي الفوسفات، إضافة عامل الإيثيلين ديامينرباعي أسيتيك حمض17.

توفر الاختبارات القائمة على نشاط NMR قيمة مضافة عند استخدامها لفحص الشظايا أوالاختبارات المتعامدة للتحقق من صحة الفحص عالي الإنتاجية 4 . وعلى النقيض من الاختبارات الملزمة، تحدد الاختبارات القائمة على النشاط القائم على NMR المركبات أو تؤكدها كمثبطات فعلية. كما تستخدم الفحوصات النشطة إنزيمًا مستهدفًا أقل بكثير من الفحوصات الملزمة. نفس الأساليب هي قوية بشكل لا يصدق بالنسبة لنوعين من الشاشات المضادة نفذت للتحقق من صحة عكسها، والنشاط المستهدف محددة واستبعاد نشاط الشبهة artifactual18. المنظفات واختبارات تخفيف القفز هي الشاشات المضادة للتراكم الغرواني19 وتثبيط لا رجعة فيه20، على التوالي. المركبات التي تجتاز هذه الاختبارات يتم التحقق من نقاط البداية للكيمياء الطبية والأمثل المانع الموجهة بالبنية. ويمكن أن تستمر الاختبارات القائمة على النشاط القائم على معدل الوفيات النانومترية في توفير بيانات النشاط المركب مع تقدم المشروع نحو مثبطات نانومولار.

وأخيرا، فإن فائدة هذه الاختبارات لرصد ردود الفعل فيالخلايا كلها جدير ة 21 . ومن شأن تثبيط الإنزيم النقي مع تثبيط الإنزيم في الخلية توفير دليل قاطع على الآلية البيوكيميائية الكامنة وراء تأثير phenotypic لوحظ22. بالنسبة للأنزيمين المعروضين هنا، فإن التأثير الفينوتيبيك المطلوب هو فقدان القدرة على البقاء (النشاط المضاد للتريوميومنت). ومن شأن وجود ارتباط بين تثبيط الإنزيم النقي، وتثبيط الإنزيم في الخلية، وموت الخلايا الطفيلية أن يشكل دليلاعلى آلية المثبط للعمل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر الدكتور دين براون على توفير مركبات من مكتبة أجزاء استرازينيكا والدكتور ديفيد باركين على توفير انزيمات AGNH و UNH. وقد تم دعم البحوث الواردة في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية للمعاهد الوطنية للصحة بموجب جائزة رقم R15AI128585 إلى B. J. S. المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.كما تم دعم البحوث من قبل هوراس G. ماكدونيل زمالة البحوث الصيفية منحت لS. N. M., عائلة لاندسبرغ زمالة منحت لجي أ. ج.، ومنحة تطوير أعضاء هيئة التدريس وجائزة فريدريك بيتلهايم للأبحاث من جامعة أدلفي إلى ب. ج.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AGNH Purified in-house N/A TVAG_213720
UNH Purified in-house N/A TVAG_092730
Adenosine Sigma A9251
5-Fluorouridine Sigma F5130
Dimethyl sulfoxide-D6 Cambridge Isotope Labs DLM-10-100 D, 99.9%
Potassium phosphate monobasic Sigma P0662
Potassium phosphate dibasic Sigma P3786
Potassium chloride Sigma P9541
Deuterium oxide Cambridge Isotope Labs DLM-4-100 D, 99.9%
Hydrochloric acid Fisher Chemical A144212
Triton X-100 Sigma X100
3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP) Sigma 269913 D, 98%
2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2 Sigma 612197 D, 99.5%
Pipette Gilson F123602 PIPETMAN Classic P1000
Pipette Gilson F123601 PIPETMAN Classic P200
Pipette Gilson F123600 PIPETMAN Classic P20
Microfuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
Conical tubes Corning 352099
Microcentrifuge Eppendorf 5418
Vortex mixer Fisher Scientific 02215365
NMR tubes Norell 502-7 Or as appropriate for the NMR
NMR spectrometer Bruker N/A AvanceIII500
Prism software GraphPad N/A Version 5.04

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
  2. Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
  3. Dalvit, C., et al. A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening. Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).
  4. Dalvit, C. Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery. Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).
  5. Stockman, B. J., et al. Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments. Chemical Biology & Drug Design. 73, 179-188 (2009).
  6. Hirt, R. P., Sherrard, J. Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations. Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).
  7. Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world. Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).
  8. Versées, W., Steyaert, J. Catalysis by nucleoside hydrolases. Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).
  9. Shea, T. A., et al. Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).
  10. Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).
  11. Muellers, S. N., et al. Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase. ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).
  12. Veronesi, M., et al. Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells. Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).
  13. Holzgrabe, U. Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications. Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).
  14. Bharti, S. K., Roy, R. Quantitative 1H NMR spectroscopy. Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).
  15. Dalvit, C., et al. Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications. Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).
  16. Lambruschini, C., et al. Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH. ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).
  17. Stockman, B. J. 2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening. Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).
  18. Aldrich, C., et al. The ecstasy and agony of assay interference compounds. ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).
  19. Feng, B. Y., Shoichet, B. K. A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors. Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).
  20. Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis. Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).
  21. Griveta, J. -P., Delort, A. -M. NMR for microbiology: In vivo and in situ applications. Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).
  22. Nijman, S. M. B. Functional genomics to uncover drug mechanism of action. Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).

Tags

الكيمياء، العدد 148، المنظفات مكافحة الشاشة، اختبار نشاط الإنزيم، IC50 قيمة، القفز التخفيف، 1H NMR، 19F NMR، خلية كاملة NMR، النوكليوسيد ريبيروهيدرولاز
NMR القائمة على تحليل النشاط لتحديد تثبيط مركب, قيم IC<sub>50,</sub> نشاط Artifactual, ونشاط الخلية الكاملة من النوكليوسيد الريبوهيدرولاسيس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stockman, B. J., Kaur, A., Persaud,… More

Stockman, B. J., Kaur, A., Persaud, J. K., Mahmood, M., Thuilot, S. F., Emilcar, M. B., Canestrari, M., Gonzalez, J. A., Auletta, S., Sapojnikov, V., Caravan, W., Muellers, S. N. NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases. J. Vis. Exp. (148), e59928, doi:10.3791/59928 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter