Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

ЯМР-анализ ы активности для определения ингибирования соединения, IC50 Значения, Артефактная активность, и цельноклеточной активности нуклеозидных рибогидроласов

Published: June 30, 2019 doi: 10.3791/59928
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

Summary

Для выявления и характеристики ингибиторов двух нуклеозидных ферментов рибогидролазы на основе ЯМР были разработаны анализы активности на основе ЯМР. Протоколы предусмотрены для первоначальных анализов соединения на 500 мкм и 250 мкм, дозы ответ ные анализы для определения значения IC50, моющее средство счетчик аспогеанализции экрана, скачок разбавления счетчик анализы экрана, и анализы в E. coli целые клетки.

Abstract

Спектроскопия ЯМР часто используется для идентификации и характеристики ингибиторов ферментов при обнаружении лекарств, особенно в контексте фрагментного скрининга. Анализы активности на основе ЯМР идеально подходят для работы при более высоких концентрациях испытательных соединений, необходимых для обнаружения этих более слабых ингибиторов. Динамический диапазон и дисперсия химических сдвигов в эксперименте NMR могут легко разрешить резонансы от субстрата, продукта и испытательных соединений. Это контрастирует со спектрофотометрическими анализами, в которых проблемы считывания интерференции часто возникают из соединений с перекрывающимися УФ-вис абсорбционными профилями. Кроме того, поскольку им не хватает региней репортера, одноэнзимные анализы ЯМР не склонны к сочетанию с ложными срабатываниями. Этот атрибут делает их полезными в качестве ортогоналовых анализов, дополняя традиционные анализы скрининга высокой пропускной их связи и анализы сортировки скамейки. Подробные протоколы предусмотрены для первоначальных анализов соединения на 500 мкм и 250 мкм, дозы-ответ анализы для определения значения IC50, моющее средство счетчик проверки экрана, скачок-разбавления счетчик анализы экрана, и анализы в E. coli целые клетки. Методы демонстрируются с использованием двух нуклеозидных ферментов рибогидролазы. Использование 1H IMR показано для пурина-специфического фермента, в то время как 19F NMR показано для пиримидина-специфического фермента. Протоколы, как правило, применимы к любому ферменту, где субстрат и резонанс продукта могут наблюдаться и отличаться спектроскопией ЯМР. Чтобы быть наиболее полезным в контексте открытия препарата, конечная концентрация субстрата должна быть не более 2-3x его Kм значение. Выбор эксперимента ЯМР зависит от ферментной реакции и доступных субстратов, а также от доступных приборов NMR.

Introduction

Ядерная магнитно-резонансная (НМР) спектроскопия хорошозарекомендовала себя для характеристики и мониторинга ферментных реакций 1,2. Различия в химических сдвигов и связывая моделей используются для различения субстрата и резонансов продукта, а относительная интенсивность резонанса используется для количественной оценки процента реакции. Как потребление субстрата, так и создание продукта непосредственно наблюдаются в спектре ЯМР. Это контрастирует со спектрофотометрией или флуоресценцией спектроскопии, в которой время реакции указывается на изменение абсорбции, связанные с некоторыми химическими видами потребляется или создается. Так же, как с другими методами, ЯМР может быть использован для изучения ферментных реакций в качестве функции температуры, рН, или других условий раствора, и эффекты ингибиторов могут быть определены.

Совсем недавно, На основе ЯМР ферментной активности анализы были продемонстрирована для фрагмента скрининга3,4. Анализы на основе ЯМР идеально подходят для работы при более высоких концентрациях испытательных соединений (часто до 1 мМ), необходимых для обнаружения этих более слабых ингибиторов. Динамический диапазон и дисперсия химических сдвигов в эксперименте NMR могут легко разрешить резонансы от субстрата, продукта и испытательных соединений. Это выгодно отличается от спектрофотометрических анализов, где проблемы ссчитывания помех часто возникают из соединений с перекрывающимися УФ-вис абсорбционными профилями. Кроме того, поскольку им не хватает региней репортера, одноэнзимные анализы ЯМР не склонны к сочетанию с ложными срабатываниями. Это преимущество делает их полезными в качестве ортогоналовых анализов, дополняя традиционныеанализы скрининга высокой пропускной их связи и анализы сортировки скамейки 5.

В нашей исследовательской лаборатории, На основе ЯМР анализы активности используются для выявления и оценки ингибиторов Trichomonas вагинального нуклеозида рибогидроласы. T. вагинальный паразит вызывает наиболее распространенные невирусные венерические заболевания6. Растущая устойчивость к существующим терапии7 является движущей необходимость новых, механизм на основе лечения, с основными нуклеозидных спасти пути ферментов, представляющих основные цели8. Анализы активности на основе ЯМР были разработаны как для пиримидин- и пурино-специфических ферментов, нуклеозидного арибогидролазы уридина (UNH)9, и аденозин/гуанозин предпочитая нуклеозид рибогидролазы (AGNH)10. Реакции, катализированные этими двумя ферментами, показаны на рисунке 1. Анализы NMR используются для проверки библиотек фрагментов для химических исходных точек, определения значений IC50 и отсечения агрегационных или ковалентных связывающих ингибиторов11. Те же ассисты также переводятся для оценки активности ферментов в целых клетках12.

Подробные протоколы предусмотрены для первоначальных анализов соединения на 500 мкм и 250 мкм, дозы-ответ анализы для определения значения IC50, моющее средство счетчик проверки экрана, скачок-разбавления счетчик анализы экрана, и анализы в E. coli целые клетки. Протоколы, как правило, применимы к любому ферменту, в котором субстрат и резонанспродукта продукта могут наблюдаться и отличаться спектроскопией ЯМР. Для простоты были сделаны три предположения. Во-первых, субстрат не указан. Для того чтобы анализы активности на основе ЯМР были полезными, конечная концентрация субстрата должна быть не более 2-3x значение Km 4. В приведенных примерах конечная концентрация аденозина и 5-фтороридинасоставляют 100 мкм (Км м 54 мкм) и 50 мм (Км 15 мКм), соответственно. В протоколах достижение этих концентраций соответствует 12 мл аденозина 5 мМ или 12 мЛ 2,5 мМ 5-фтороридина.

Во-вторых, количество фермента, предусмотренное в протоколах, 5 зЛ, было выбрано в соответствии с количеством, необходимым для преобразования субстрата примерно на 75% в продукт за 30 мин. Это количество обычно представляет собой большое разбавление из очищенного ферментного запаса, и разбавление должно быть определено заранее для каждого фермента. Очищенные растворы agNH и UNH ферментного запаса хранятся при -80 градусов по Цельсию в аликвотах, которые обеспечивают достаточное количество ферментов для нескольких тысяч реакций. Таким образом, коэффициент разбавления в идеале должен определяться или проверяться только каждые несколько месяцев. В-третьих, конкретный эксперимент 1D NMR не указан. В репрезентативных результатах показан 1H NMR для AGNH10 и 19F NMR для UNH9,при этом эксперимент ЯМР описан в соответствующих ссылках. Выбор эксперимента ЯМР зависит от ферментной реакции и доступных субстратов, а также от доступных приборов NMR. Наконец, следует отметить, что описанный экспериментальный подход не соответствует строгим требованиям количественных NMR (qNMR)13,14. В протоколе процентная реакция определяется с использованием относительных изменений интенсивности одного и того же резонанса в каждом спектре, а не путем определения абсолютных концентраций. Такой подход устраняет необходимость в модификациях для сбора и обработки данных, а также внутренних или внешних стандартов, которые необходимы для qNMR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Первоначальные тестовые анализы на уровне 500 мкм и 250 мкм

  1. Подготовка субстрата и испытания соединения для реакций.
    1. Подготовьте запасные растворы субстрата (аденозин или 5-фтороридин) в воде и испытательном комплексе 50 мМ в дейтерном диметилсулькидоксиде (ДМСО). Обратитесь к разделу введения для концентрации субстратного раствора для использования.
    2. Добавьте 12 кл. субстрата (аденозин или 5-фтороридин) к каждой из четырех микрофуговных трубок мощностью 1,5 мл, 1-4.
    3. Добавьте 6 зЛ deuterated DMSO к трубам 1 (0 мин управления) и 4 (30 мин управления). Добавьте 6 зл испытательного соединения в трубку 2. Добавьте 3 Зл испытательного соединения и 3 Зла дейтерированных DMSO в трубку 3.
  2. Подготовьте достаточное решение для реакции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Решение запасов предназначено для пяти реакций, каждая из которых содержит 517 кЛ буфера, 60 кЛ оксида дейтерия и 5 зл ферментного раствора (AGNH или UNH). Обратитесь к разделу введения для концентрации ферментного раствора для использования.
    1. Добавьте 2,59 мл буфера реакции (50 мм фосфат калия, 0,3 м ККЛ, рН 6,5) в коническую трубку 15 мл. Добавьте в коническую трубку 300 кЛ оксида дейтерия. Добавьте в конический раствор 25 кЛ ферментного раствора (AGNH или UNH).
    2. Аккуратно инвертировать коническую трубку дважды, чтобы смешать.
  3. Одновременно инициировать и утолить 0 мин реакции контроля. Передача 582 л раствора реакционного запаса в чистую микрофугевую трубку. Добавьте 10 кл. 1,5 М HCl к этой микрофуге трубки. Перенесите комбинированное 592 Зл в микрофугую трубку 1. Аспирировать и распределять образец дважды в медленном, но преднамеренным образом.
  4. Инициировать и запустить оставшиеся три реакции в шахматном порядке. В момент 0 мин, передача 582 л реакции бульона раствор микрофуга трубки 2. Аспирировать и распределять образец дважды в медленном, но преднамеренным образом. Повторите с интервалом 30 с для микрофуговых труб 3 и 4. Подождите 30 минут.
  5. Утолить реакции. В то время 30 мин, добавить 10 л 1,5 М HCl к микрофуге 2. Повторите с интервалом 30 с для микрофуговых труб 3 и 4. Передача 600 л раствора от каждого микрофуга к ямбер труб.
  6. Приобретите спектр 1D NMR на каждом образце. Обработайте данные, чтобы обеспечить правильное поспешность и плоские базовые линии.
  7. Рассчитайте процентное преобразование субстрата для контрольных спектров.
    1. Наложение спектра в течение 0 мин и 30 мин управления. Масштабируйте сигнал субстрата в 0 минуте управления, чтобы соответствовать 30-минутному контролю. Обратите внимание на этот процент.
    2. Рассчитайте процентное преобразование как (100 - процент, определенный в шаге 1.7.1).
  8. Рассчитайте процентное преобразование субстрата для реакций, содержащих испытательное соединение.
    1. Накладывайте спектры для контроля 0 мин и первой реакции, содержащей испытательное соединение 500 мкм. Масштабируйте субстратный сигнал в 0-минутном контроле, чтобы соответствовать спектру с испытательным соединением. Обратите внимание на этот процент. Рассчитайте процентное преобразование как (100 - процент определяется).
    2. Повторите вторую реакцию, содержащую 250 мкм испытательного соединения.
  9. Рассчитайте процентную реакцию и процентное ингибирование для каждой концентрации соединения теста.
    1. Рассчитайте процент реакции как (1.8.1/1.7.2) x 100.
    2. Рассчитайте процентное торможение как (100 - процент, определенный в шаге 1.9.1).

2. Определение значений IC50

  1. Подготовка субстрата и испытания соединения для реакций.
    1. Подготовьте запасные растворы субстрата (аденозин или 5-фтороридин) в воде и испытательном комплексе 10 мМ в дейтерном ДМСО. Обратитесь к разделу введения для концентрации субстратного раствора для использования.
  2. Подготовка серийных разбавлений испытательного соединения 10 мМ (в дейтерированных DMSO).
    1. Добавьте 36 л. Дейтерированный DMSO к пяти 1,5 мл микрофуговых трубок, 1-5.
    2. Добавьте 12 лэм 10 мМ испытательное соединение в трубку 1 и нажмите слегка, чтобы смешать. Испытательный комплекс в настоящее время составляет 2,5 мМ.
    3. Передача 12 Зл из трубки 1 в трубку 2 и нажмите слегка перемешать. Испытательное соединение в настоящее время 0,63 мМ. Передача 12 Зл из трубки 2 в трубку 3 и нажмите слегка перемешать. Испытательное соединение в настоящее время 0,16 мМ. Передача 12 Зл из трубки 3 в трубку 4 и нажмите слегка перемешать. Испытательное соединение теперь 0,04 мМ. Передача 12 QL из трубки 4 в трубку 5 и нажмите слегка перемешать. Испытательное соединение в настоящее время 0,01 мМ.
  3. Подготовьте 14 микрофуговых трубок 1,5 мл для реакций.
    1. Добавьте 12 кЛ субстрата (аденозин или 5-фтороридин) к каждой из 14 1,5 мл микрофуговых трубок, 1-14.
    2. Добавьте 12 зЛ deuterated DMSO к трубам 1 (0 мин управления) и 14 (30 мин управления).
    3. Добавьте 12 кл.л. 10 мМ испытательного соединения в трубки 2 и 3. Добавьте 12 кл 2,5 мМ испытательного соединения в трубки 4 и 5. Добавьте 12 кл.л. испытательного соединения 0,63 мМ в трубки 6 и 7. Добавьте 12 кл.л. испытательного соединения 0,16 мМ в трубки 8 и 9. Добавьте 12 кл.л. испытательного соединения 0,04 мМ в трубки 10 и 11. Добавьте 12 кл.л. испытательного соединения 0,01 мМ в трубки 12 и 13.
  4. Подготовьте достаточное решение для реакции, чтобы запустить 15 реакций, которые содержат 511 л буфера, 60 л оксида дейтерия и 5 зл ферментного раствора (AGNH или UNH) каждая. Обратитесь к разделу введения для концентрации ферментного раствора для использования.
    1. Добавьте 7,67 мл буфера реакции (50 мм фосфат калия, 0,3 М ККЛ, рН 6,5) в коническую трубку 15 мл. Добавьте в коническую трубку 900 кЛ оксида дейтерия. Добавьте к коническим раствором 75 кЛ ферментного раствора (AGNH или UNH).
    2. Аккуратно инвертировать коническую трубку 2x для смешивания.
  5. Следуйте шагам, изложенным в шагах 1.3-1.9 к (с использованием 576 л раствора реакционного запаса), чтобы определить процентную реакцию для каждой концентрации испытательного соединения.
  6. Рассчитайте значение IC50 с помощью GraphPad Prism.
    1. Создайте таблицу данных, сопоставляя концентрации сложных концентраций реакционных испытаний (200 мкм, 50 мкм, 12,5 мкм, 3,13 мкм, 0,78 мкм, 0,20 мкм) с процентной реакцией (по два значения каждый).
    2. Используйте нелинейную кривую, подгонки для определения значения IC50 и стандартной ошибки.

3. Детергент ный экран анализы на 100 ММ и 50 ММ

  1. Подготовка субстрата и испытания соединения для реакций.
    1. Подготовьте запасные растворы субстрата (аденозин или 5-фтороридин) в воде и испытательном комплексе 10 мМ в дейтерном ДМСО. Обратитесь к разделу введения для концентрации субстратного раствора для использования.
    2. Добавьте 12 кЛ субстрата (аденозин или 5-фтороридин) к каждой из восьми микрофуговных трубок 1,5 мл, 1-8.
    3. Добавьте 6 зЛ deuterated DMSO к трубам 1 и 5 (0 минут управления) и 4 и 8 (30 минут управления). Добавьте 6 зл исправления в трубки 2 и 6. Добавьте 3 Зл испытательного соединения и 3 Зла дейтерированных ДМСО в трубки 3 и 7.
  2. Подготовьте достаточное решение для реакции, чтобы запустить пять реакций, которые содержат 517 л буфера, 60 л оксида дейтерия и 5 зл ферментного раствора (AGNH или UNH) каждая. Обратитесь к разделу введения для концентрации ферментного раствора для использования.
    1. Добавьте 2,59 мл буфера реакции (50 мм фосфат калия, 0,3 М ККЛ, рН 6,5) в коническую трубку 15 мл. Добавьте в коническую трубку 300 кЛ оксида дейтерия. Добавьте в конический раствор 25 кЛ ферментного раствора (AGNH или UNH).
    2. Аккуратно инвертировать коническую трубку 2x для смешивания.
  3. Подготовьте достаточное решение для реакции с 0,01% v/v triton X-100 моющего средства для запуска пяти реакций, которые содержат 517 л буфера, 60 кЛ оксида дейтерия и 5 кЛ ферментного раствора (AGNH или UNH) каждая.
    1. Добавьте 2 зЛ моющего средства Triton X-100 в 20 мл реакционного буфера (50 мм фосфат калия, 0,3 М КЛ, рН 6,5). Детергентные растворы должны использоваться в течение 1 дня.
    2. Добавьте 2,59 мл буфера реакции, содержащего 0,01% моющего средства Triton X-100, в коническую трубку 15 мл. Добавьте в коническую трубку 300 кЛ оксида дейтерия. Добавьте в конический раствор 25 кЛ ферментного раствора (AGNH или UNH).
    3. Аккуратно инвертировать коническую трубку 2x для смешивания.
  4. Для труб 1-4, используя раствор реакционного запаса WITHOUT моющего средства, следуйте шагам, изложенным в шагах 1.3-1.9, чтобы определить процентное ингибирование для каждой концентрации соединения теста.
  5. Для труб 5-8, используя решение реакционного запаса с 0,01% v/v Triton X-100 моющего средства, следуйте шагам, изложенным в шагах 1.3-1.9, чтобы определить процентное ингибирование для каждой концентрации соединения теста.

4. Перепрыгивая-разбавления счетчик экран анализы

  1. Подготовка субстрата и испытания соединений для реакций
    1. Подготовьте запасные растворы субстрата (аденозин или 5-фтороридин) в воде и испытательном комплексе 10 мМ в дейтерном ДМСО. Обратитесь к разделу введения для концентрации субстратного раствора для использования.
    2. Добавьте 53,8 л буфера реакции (50 мм фосфат калия, 0,3 М ККЛ, рН и 6,5) к двум микрофуговым трубкам мощностью 1,5 мл (каждый), 1 и 2. Добавьте 5 зЛ фермента (AGNH или UNH) в трубки 1 и 2.
    3. Добавьте 511 йл буфера реакции к двум микрофуговым трубкам мощностью 1,5 мл, 3 и 4 (каждый). Добавьте 60 qL оксида дейтерия в трубки 3 и 4. Добавьте 5 qL фермента (AGNH или UNH) в трубки 3 и 4.
    4. Добавьте 1,2 злиц дейтерированных DMSO в трубку 1 (30 мин управления). Добавьте 1,2 злителка испытательного соединения в трубку 2. Добавьте 12 зЛ deuterated DMSO в трубку 3 (30 мин управления). Добавьте 12 qL испытательного соединения в трубку 4. Инкубировать в течение 30 мин.
  2. Приготовьте две микрофугевые трубки мощностью 1,5 мл с раствором разбавления.
    1. Добавьте 468 юл буфера реакции к каждой из двух микрофуговных труб оков мощностью 1,5 мл, 5 и 6. Добавьте в каждую трубку 60 кл/л оксида дейтерия (5 и 6).
  3. Подготовьте четыре микрофуговых трубки мощностью 1,5 мл для реакций.
    1. Добавьте 12 кЛ субстрата (аденозин или 5-фтороридин) к каждой из четырех микрофуговных трубок мощностью 1,5 мл, 7-10.
  4. Выполните прыжки-разбавления и инициировать реакции.
    1. Передача 528 Л раствора из трубки 5 в трубку 1. Аспирировать и распределять образец дважды в медленном, но преднамеренным образом. Передача 528 л раствора из трубки 6 в трубку 2. Аспирировать и распределять образец дважды в медленном, но преднамеренным образом.
    2. В срок 0 мин, передача 588 Злл раствора из трубки 1 в трубку 7. Аспирировать и распределять образец 2x в медленном, но преднамеренным образом. С интервалом в 30 с перенесите 588 л раствора из трубки 2 в трубку 8, трубку 3 в трубку 9 и трубку 4 на трубку 10. Аспирировать и распределять образец дважды в медленном, но преднамеренным образом. Подождите 30 минут.
  5. Для труб 7-10, следуйте шагам, изложенным в шагах 1,5-1,9, чтобы определить процент ингибирования для каждого теста соединения концентрации.

5. Соединение анализов в E. coli целые клетки

  1. Подготовьте 10 мл ночной культуры кишечной палочки на день, предшествующий экспериментам.
  2. Подготовьте клетки e. coli для экспериментов NMR.
    1. Центрифуги клетки в 1 мл aliquots в течение 10 минут на 15000 х г.
    2. Откажитесь от супернатанта и отбросите каждый аликот клеток в 1 мл реакционного буфера (50 мм фосфат калия, 0,3 М ККл, рН и 6,5) путем вихря.
  3. Следуйте разделам 1 или 2 для желаемого ассоциатса со следующими изменениями:
    1. Замените 280 л буфера в растворе реакционного запаса с 280 злителями перерывожных ячеек.
    2. Замените 5 зЛ фермента (AGNH или UNH) в растворе реакционного запаса с 5 зл буфера.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 2 показаны результаты тестирования двух соединений против AGNH с использованием 1H NMR следующих разделов 1. Реакция фермента наиболее легко наблюдается и количественно исчезновение аденозин синглет и дублет резонансов на 8,48 промилле и 6,09 промилле, соответственно, и появление аденина синглет резонанс на 8,33 промилле, как наблюдается в 30 мин контроля Спектра. При наличии соединения 500 мкм 1, ни один продукт не образуется, о чем свидетельствует отсутствие резонанса аденина при 8,33 промилле. При наличии соединения 1, около 10% субстрата было преобразовано в продукт. В отличие от этого, ни концентрация соединения 2 не ингибирует фермент, о чем свидетельствуют субстрат и резонансы продукта, напоминающие те, которые в 30-минутном спектре контроля. Эти данные идентифицируют соединение 1 как хороший ингибитор AGNH. Отметим, что также наблюдаются резонансы, возникающие из соединения 1 (7,70-8,00 и 8,50-8,60 промилле) и соединения 2 (7,40-7,80 промилле). Тот же субстрат и тожетовые резонансы используются для мониторинга реакций, показанных на рисунке 4, Рисунке6, Рисунке 8и рисунке 10. На рисунке 3 показаны результаты тестирования двух соединений против УНП с использованием 19F NMR после раздела 1. Реакция фермента легко наблюдается и количественно исчезновение 5-фтороридина резонанс ажиотажа при -165,8 промилле и появление 5-фторурацила резонанса при -169,2 промилле, как это наблюдается в 30 мин контроля спектра. Для этого фермента соединение 2 полностью подавляет реакцию в обеих концентрациях, в то время как соединение 1 не имеет никакого эффекта. Эти данные определяют соединение 2 как хороший ингибитор UNH. Тот же субстрат и тожетовые резонансы используются для мониторинга реакций, показанных на рисунке 5, рисунке7, рисунке 9и рисунке 11.

На рисунке 4 показаны данные о дозах-ответе ЯМР и полученная кривая IC50, полученная для соединения с активностью AGNH с использованием 1H NMR следующего раздела 2. Данные ЯМР отображаться только для одного из дублирующих испытаний. Обратите внимание, что резонансы, возникающие из испытанного соединения (6,90-7,40 промилле), не мешают подтексту или резонансам продукта. Кривая IC50 была приписана с использованием данных обоих испытаний и привела к значению 12,3 и 5,0 мкм. Этот результат согласуется с данными ЯМР в том, что значительная потеря субстрата сигнала не наблюдается до тех пор, пока концентрация соединения не будет снижена до 12,5 мкм. На рисунке 5 показаны данные о дозах-ответных ЯМР и полученная кривая IC50, полученная для соединения с деятельностью UNH с использованием 19F NMR следующего раздела 2. Данные ЯМР отображаться только для одного из дублирующих испытаний. Кривая IC50 была приписана с использованием данных обоих испытаний и привела к значению 16,7 и 10,4 мкм. Это значение согласуется с данными ЯМР в том, что значительная потеря субстрата сигнала не наблюдается до тех пор, пока концентрация соединения не будет снижена до 12,5 мкм.

На рисунке 6 показаны результаты тестирования соединения в двух концентрациях против AGNH при отсутствии и наличии 0,01% моющего средства Triton X-100 с использованием 1H NMR следующего раздела 3. Только минимальные различия наблюдаются в интенсивности субстрата и сигналов продукта с использованием двух условий, что свидетельствует о том, что наблюдаемое ингибирование фермента не является артефактом агрегации соединений. Обратите внимание, что резонансы, возникающие из исследуемого соединения (7,10-7,70 промилле) и Triton X-100 (6,90 и 7,40 промилле), не мешают подтексту или резонансу продукта. На рисунке 7 показаны результаты тестирования соединения в двух концентрациях против УНГ в отсутствие и наличие 0,01% моющего средства Triton X-100 с использованием 19F NMR после раздела 3. Только минимальные различия наблюдаются в интенсивности субстрата и сигналов продукта с использованием двух условий, что свидетельствует о том, что наблюдаемое ингибирование фермента не является артефактом агрегации соединений.

На рисунке 8 показаны результаты тестирования соединения в анализе поразливления в прыжках против AGNH с использованием 1H NMR следующих разделов 4. Снижение интенсивности субстрата сигнала в 20 мкм реакции по сравнению с 200 мкм реакции указывает на то, что ингибирование обратимо. Испытанное соединение имеет ic50 значение 21.0 мкм, и его резонансы наблюдаются на 6.90-8.30 ppm. В этом примере, резонансы из соединения вмешиваться в те из сигнала аденина продукта, и прогресс реакции легче контролировать с помощью аденозина резонанс на 6,09 промилле. На рисунке 9 показаны результаты тестирования соединения в анализе поразливию скачка в отношении UNH с использованием 19F NMR после раздела 4. Повышенная интенсивность сигнала продукта при -169,2 промилле при 20-мм реакции по сравнению с реакцией 200 мкм указывает на то, что ингибирование обратимо. Испытанное соединение имеет ic50 значение 16,7 мкм.

На рисунке 10 показана полезность метода для выполнения анализов в целых ячейках с использованием 1H NMR следующего раздела 5. Сигналы аденозина субстрата почти полностью исчезли после 30 мин в присутствии целых клеток, что указывает на гидролиз субстрата. В отличие от этого, субстрат остается неизменным после 30 минут в присутствии супернатанта среды роста клеток, что указывает на то, что реакция гидролизов зависит от клеток. Обратите внимание на наличие многих фоновых сигналов в супернатантных спектрах, в ключая интенсивные тройнясигналы от ионов NH4и на 6,90-7,15 промилле, которые также присутствуют в меньшей степени во всей спектре клеток. На рисунке 11 показана полезность метода для выполнения анализов в целых ячейках с использованием 19F NMR следующих разделов 5. Сигнал 5-фторуридина субстрата полностью исчез после 60 мин в присутствии целых клеток, что указывает на гидролиз субстрата. В отличие от этого, субстрат остается неизменным после 60 минут в присутствии супернатанта среды роста клеток, что указывает на то, что реакция гидролизов зависит от клеток.

Figure 1
Рисунок 1: Реакции, катализированные UNH (вверху) и AGNH (внизу). Обратите внимание, что UNH будет катализировать гидролиз как уридина, так и 5-фторуридина (на фото). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Представитель первоначальных анализов соединения на 500 Вопросы M и 250 Вопросы M против AGNH с использованием 1H NMR. Области 1H NMR спектрреакции для двух соединений, каждый на 500 мкм и 250 мкм, а также 0 мин и 30 мин спектров управления. Спектр управления 0 мин содержит аденозиновые подстратные резонансы на 6,09, 8,38 и 8,48 промилле. 30 мин контроля спектра содержит новый резонанс аденина продукта на 8,33 промилле. Тестовые спектры содержат дополнительные резонансы, возникающие в результате испытания соединения. 1 H химических сдвигов были ссылки на внешние триметилсилилпрофиновой кислоты на 0,0 промилле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Представитель первоначальных анализов соединения на 500 Вопросы M и 250 Вопросы M против UNH с использованием 19F NMR. Регионы 19F NMR спектр реакции для двух соединений, каждый на 500 мкм и 250 мкм, а также 0 мин и 30 мин спектра управления. Спектр управления 0 мин содержит 5-фторуридин субстрат резонанс на -165,8 промилле. 30-минутный контрольный спектр содержит новый 5-фторурацил овый продукт резонанс при -169,2 промилле. 19 лет F химические сдвиги были ссылки на внешние 50 ММ трифторэтанола на -76,7 промилле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Представитель дозы ответа ЯМР данных и в результате IC50 кривой, полученной для соединения с активностью AGNH с использованием 1H NMR. Области 1H NMR-спектра реакции для переменных концентраций соединения (200-0.20 мкм) вместе с 0 мин и 30 мин спектров управления. Резонансы от 6.90-7.40 ppm возникают от испытанного соединения. Кривая IC50 подходила с использованием данных из наборов данных ЯМР, запускаемых в дубликате. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Представитель дозы ответа ЯМР данных и в результате IC50 кривой, полученной для соединения с деятельностью UNH с использованием 19F NMR. Области спектра реакции 19F NMR для переменных концентраций соединения (200-0.20 мкм) наряду с 0 мин и 30 мин спектрами контроля. Кривая IC50 подходила с использованием данных из наборов данных ЯМР, запускаемых в дубликате. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Представитель моющего средства счетчик экран анализы для соединения с agNH деятельности с использованием 1H NMR. Области 1H NMR спектрреакции для соединения на 100 мкм и 50 мкм, наряду с 0 мин и 30 мин спектра управления, в присутствии и отсутствии 0,01% Тритон X-100. Резонансы при 7,10-7,70 промилле и 6,90 и 7,40 промилле возникают из исследуемого соединения и Triton X-100, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Представитель моющего средства счетчик проверки экрана для соединения с деятельностью UNH с использованием 19F NMR. Области 19F NMR спектр реакции для соединения на 100 мкм и 50 мкм, наряду с 0 мин и 30 мин спектра управления, в присутствии и отсутствии 0,01% Тритон X-100. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: Представитель скачок-разбавления счетчик проверки для соединения с AGNH деятельности с использованием 1H NMR. Области 1H NMR спектрреакции для соединения на 200 мкм и 20 мкм, а также 30 мин спектра управления. Фермент был инкубирован в течение 30 мин при 200 мкм соединения до начала реакции, с 20 мкм реакции разбавленной непосредственно перед началом реакции. Резонансы при 6,90-8,30 промилле возникают из испытанного соединения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 9
Рисунок 9: Представитель скачок-разбавления счетчик анализы для соединения с деятельностью UNH с использованием 19F NMR. Регионы 19F NMR спектр реакции для соединения на 200 мкм и 20 мкм, а также 30 мин спектра управления. Фермент был инкубирован в течение 30 мин при 200 мкм соединения до начала реакции, с 20 мкм реакции разбавленной непосредственно перед началом реакции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 10
Рисунок 10: Представитель анализы в целых клетках с использованием 1H NMR. Области 1H NMR спектрреакции для образцов, содержащих либо 280 Л клеток кишечной палочки, повторно вспеневаемых в буфере (0, 15 и 30 мин) или супернатанта медиа-натанта роста клеток (30 мин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 11
Рисунок 11: Представитель анализы в целых клетках с использованием 19F NMR. Регионы 19F NMR спектрреакции для образцов, содержащих либо 280 КЛ клеток кишечной палочки, вновь приостановленных в буфере (0, 15, 30 и 60 мин) или супернатанта медиа-среды роста клеток (60 мин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описанные протоколы, как правило, применимы ко многим ферментам, при условии, что субстраты и/или продукты имеют разрешимые сигналы в спектре ЯМР. Однако крайне важно, чтобы концентрация субстрата была близка к значению Km и была достаточно высокой, чтобы быть обнаруженной в эксперименте ЯМР в разумные сроки. Концентрация субстрата не выше 2-3x значение Km является оптимальной для обнаружения конкурентоспособных, неконкурентоспособных и неконкурентоспособных ингибиторов4. Как показано здесь для UNH, субстрат, Km значения как низко как 15 мкм подходят. Использование субстратов с сигналами CH3 или CF3 в сочетании со сбором данных ЯМР на криогенных зондах может снизить этот порог еще больше15. Ферменты, которые имеют значения субстрата Km ниже 1 м, однако, вероятно, трудно изучить с помощью этого метода из-за присущей низкой чувствительности эксперимента NMR. В таких ситуациях, спектромометрия или флуоресценция спектроскопии являются более подходящими методами.

Еще одним ограничением применения этих методов является подходящее закалочное средство. Все протоколы, описанные здесь, являются фиксированными анализами времени, с реакцией, угасаной после 30 минут добавлением HCl. Как для AGNH, так и для UNH, было ранее установлено, что HCl немедленно прекратил реакцию, и держал его остановился в течение периодовнедели 9,10. Это важно, так как десятки реакций часто запускаются одновременно, а затем стоят в очереди для сбора данных NMR в течение нескольких часов. Важно также установить, что неферментатная деградация субстрата или сигналов продукта происходит не после закалки, а до сбора данных ЯМР. В дополнение к HCl, другие распространенные способы утоления реакций путем добавления известного ингибитора наномолра16 или, в случае реакций с участием аденозин трифосфата, добавление хелатирующего агента этилэненедиаминтетраацетической кислоты17.

Анализы активности на основе ЯМР обеспечивают добавленную стоимость при использовании для скрининга фрагментов или ортогоналовых анализов для проверки высокой пропускной реакции хитов4. В отличие от связывающих анализов, анализы активности на основе ЯМР определяют или подтверждают соединения как фактические ингибиторы. В анализе активности также используется гораздо меньше целевого фермента, чем обязательные анализы. Те же методы невероятно надежны для двух типов встречных экранов, выполняемых для проверки обратимой, целевой активности и исключают артефактную деятельность асссеа18. Детергент ные и анализы на разбавление тормозов являются контрэкранами для коллоидной агрегации19 и необратимого ингибирования20,соответственно. Соединения, которые проходят эти тесты, являются проверенными отправными точками для лекарственной химии и оптимизации ингибитора, управляемого структурой. Анализ активности на основе ЯМР может продолжать предоставлять сложные данные о активности по мере продвижения проекта к наномолярным ингибиторам.

Наконец, полезность этих анализов для мониторинга реакций в целых клетках примечателен21. Коррелирование ингибирования очищенного фермента с ингибированием в-клеточного фермента обеспечит окончательное доказательство биохимического механизма, лежащего в основе наблюдаемого фенотипического эффекта22. Для двух ферментов, представленных здесь, желаемым фенотипическим эффектом является потеря жизнеспособности (антитрихомональная активность). Корреляция между ингибицией очищенных ферментов, ингибированием в клетках ферментов и гибелью паразитных клеток будет служить доказательством ингибиторного механизма действия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим д-ра Дина Брауна за предоставление соединений из библиотеки фрагментов АстраЗенека и д-ра Дэвида Паркина за предоставление ферментов AGNH и UNH. Исследование, о которых сообщается в этой публикации, было поддержано Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний Национальных институтов здравоохранения под номером премии R15AI128585 до B. J. S. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно представляют официальные взгляды Национальных институтов Health.Research также поддерживается Гораций Г. Макдонелл Летний научно-исследовательский стипендий присуждается С. Н. М., Ландесберг семьи Стипендия присуждена J. A. G., и гранты на развитие факультета и Фредерик Беттельхайм исследований премии от Университета Адельфи до B. J. S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AGNH Purified in-house N/A TVAG_213720
UNH Purified in-house N/A TVAG_092730
Adenosine Sigma A9251
5-Fluorouridine Sigma F5130
Dimethyl sulfoxide-D6 Cambridge Isotope Labs DLM-10-100 D, 99.9%
Potassium phosphate monobasic Sigma P0662
Potassium phosphate dibasic Sigma P3786
Potassium chloride Sigma P9541
Deuterium oxide Cambridge Isotope Labs DLM-4-100 D, 99.9%
Hydrochloric acid Fisher Chemical A144212
Triton X-100 Sigma X100
3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP) Sigma 269913 D, 98%
2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2 Sigma 612197 D, 99.5%
Pipette Gilson F123602 PIPETMAN Classic P1000
Pipette Gilson F123601 PIPETMAN Classic P200
Pipette Gilson F123600 PIPETMAN Classic P20
Microfuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
Conical tubes Corning 352099
Microcentrifuge Eppendorf 5418
Vortex mixer Fisher Scientific 02215365
NMR tubes Norell 502-7 Or as appropriate for the NMR
NMR spectrometer Bruker N/A AvanceIII500
Prism software GraphPad N/A Version 5.04

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
  2. Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
  3. Dalvit, C., et al. A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening. Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).
  4. Dalvit, C. Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery. Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).
  5. Stockman, B. J., et al. Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments. Chemical Biology & Drug Design. 73, 179-188 (2009).
  6. Hirt, R. P., Sherrard, J. Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations. Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).
  7. Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world. Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).
  8. Versées, W., Steyaert, J. Catalysis by nucleoside hydrolases. Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).
  9. Shea, T. A., et al. Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).
  10. Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).
  11. Muellers, S. N., et al. Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase. ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).
  12. Veronesi, M., et al. Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells. Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).
  13. Holzgrabe, U. Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications. Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).
  14. Bharti, S. K., Roy, R. Quantitative 1H NMR spectroscopy. Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).
  15. Dalvit, C., et al. Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications. Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).
  16. Lambruschini, C., et al. Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH. ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).
  17. Stockman, B. J. 2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening. Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).
  18. Aldrich, C., et al. The ecstasy and agony of assay interference compounds. ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).
  19. Feng, B. Y., Shoichet, B. K. A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors. Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).
  20. Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis. Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).
  21. Griveta, J. -P., Delort, A. -M. NMR for microbiology: In vivo and in situ applications. Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).
  22. Nijman, S. M. B. Functional genomics to uncover drug mechanism of action. Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).

Tags

Химия Выпуск 148 счетчик моющего средства ферментная активность анализа IC50 значение скачок-разбавления 1H NMR 19F NMR целая клетка ЯМР нуклеозид рибогидролаза
ЯМР-анализ ы активности для определения ингибирования соединения, IC<sub>50</sub> Значения, Артефактная активность, и цельноклеточной активности нуклеозидных рибогидроласов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stockman, B. J., Kaur, A., Persaud,… More

Stockman, B. J., Kaur, A., Persaud, J. K., Mahmood, M., Thuilot, S. F., Emilcar, M. B., Canestrari, M., Gonzalez, J. A., Auletta, S., Sapojnikov, V., Caravan, W., Muellers, S. N. NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases. J. Vis. Exp. (148), e59928, doi:10.3791/59928 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter