Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

NMR-baserade aktivitets analyser för bestämning av sammansatt hämning, IC50 -värden, artifaktuella aktiviteter och helcellsaktivitet av Nukleosidribohydrolaser

Published: June 30, 2019 doi: 10.3791/59928
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

Summary

NMR-baserade aktivitets analyser har utvecklats för att identifiera och karakterisera hämmare av två nukleosidribohydrolase-enzymer. Protokoll tillhandahålls för initiala sammansatta analyser vid 500 μM och 250 μM, DOS-respons-analyser för bestämning av IC50 -värden, disk medels räknare skärm analyser, hopp utspädning Counter-Screen analyser, och analyser i E. coli hela celler.

Abstract

NMR spektroskopi används ofta för identifiering och karakterisering av enzym hämmare i Drug discovery, särskilt i samband med fragment screening. NMR-baserade aktivitets analyser är idealiska för att arbeta vid de högre koncentrationer av test föreningar som krävs för att upptäcka dessa svagare hämmare. Det dynamiska omfånget och spridningen av kemisk förskjutning i ett NMR-experiment kan enkelt lösa resonanser från substrat-, produkt-och test föreningar. Detta kontrasterar mot spektrofotometriska analyser, där problem med utläsnings störningar ofta uppstår från föreningar med överlappande UV-VIS absorptionsprofiler. Dessutom, eftersom de saknar reporter enzymer, den enda enzym NMR-analyser är inte benägna att kopplade-assay falska positiva identifieringar. Detta attribut gör dem användbara som ortogonala analyser, kompletterar traditionella hög genom strömning screening analyser och bänkmonterade triage analyser. Detaljerade protokoll tillhandahålls för initiala sammansatta analyser vid 500 μM och 250 μM, DOS-respons-analyser för bestämning av IC50 -värden, disk medels räknare, test av avskärmnings räknare, Jump-utspädningstester och analyser i E. coli -helceller. Metoderna demonstreras med hjälp av två nukleosidribohydrolase-enzymer. Användning av 1H NMR visas för det purinspecifika enzymet, medan 19F NMR visas för det pyrimidinspecifika enzymet. Protokollen är i allmänhet tillämpliga på alla enzym där substrat-och produkt resonanser kan observeras och särskiljas genom NMR-spektroskopi. För att vara den mest användbara i samband med läkemedels upptäckt, bör den slutliga koncentrationen av substrat inte vara mer än 2-3x sitt Km -värde. Valet av NMR experiment beror på enzymet reaktion och substrat tillgängliga samt tillgängliga NMR instrumentering.

Introduction

Kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi är väl etablerad för karakterisering och övervakning enzym reaktioner1,2. Skillnader i kemiska SKIFT och kopplings mönster används för att särskilja substrat och produkt resonanser, och relativ resonans intensitet används för att kvantifiera procent av reaktionen. Både förbrukningen av substrat och skapandet av produkten observeras direkt i NMR spektrum. Detta kontrasterar mot spektrofotometri eller fluorescensspektroskopi, där reaktions tiden indikeras av en förändring i absorbansen som kan hänföras till vissa kemiska arter som konsumeras eller skapas. Precis som med andra metoder, NMR kan användas för att studera enzym reaktioner som en funktion av temperatur, pH, eller andra lösnings villkor, och effekterna av inhibitorer kan bestämmas.

På senare tid har NMR-baserade enzym aktivitets analyser visats för fragment screening3,4. NMR-baserade analyser är idealiska för att arbeta vid de högre koncentrationerna av test föreningar (ofta så höga som 1 mM) som krävs för att upptäcka dessa svagare hämmare. Det dynamiska omfånget och spridningen av kemisk förskjutning i NMR-experimentet kan enkelt lösa resonanser från substrat-, produkt-och test föreningar. Detta jämför positivt med spektrofotometriska analyser där utläsnings störningar ofta uppstår från föreningar med överlappande UV-VIS absorptionsprofiler. Dessutom, eftersom de saknar reporter enzymer, den enda enzym NMR-analyser är inte benägna att kopplade-assay falska positiva identifieringar. Denna fördel gör dem användbara som ortogonala analyser, kompletterar traditionella hög genom strömning screening analyser och bänkmonterade triage analyser5.

I vårt forsknings laboratorium används NMR-baserade aktivitets analyser för att identifiera och utvärdera hämmare av Trichomonas vaginalis nukleosidribohydrolaser. Den T. vaginalis parasit orsakar de vanligaste icke-viral sexuellt överförbara sjukdomar6. Ökad resistens mot befintliga terapier7 driver behovet av nya, mekanismbaserade behandlingar, med viktiga nukleosid bärgning utbildningsavsnitt enzymer som representerar Prime mål8. NMR-baserade aktivitets analyser har utvecklats för både pyrimidin-och purinspecifika enzymer, uridinnukleosidribohydrolas (UNH)9, och adenosin/guanosin som föredrar nukleosidribohydrolas (agnh)10. De reaktioner som katalyseras av dessa två enzymer visas i figur 1. NMR-analyserna används för att avskärma fragmentbiblioteken för kemiska start punkter, fastställa IC50 -värden och rensa agg regeringsbaserade eller kovalent bindande hämmare11. Samma analyser översätts också för att bedöma enzym aktivitet i hela celler12.

Detaljerade protokoll tillhandahålls för initiala sammansatta analyser vid 500 μM och 250 μM, DOS-respons-analyser för bestämning av IC50 -värden, disk medels räknare, test av avskärmnings räknare, Jump-utspädningstester och analyser i E. coli -helceller. Protokollen är i allmänhet tillämpliga på alla enzym där substrat-och produkt resonanser kan observeras och särskiljas genom NMR-spektroskopi. Tre antaganden har gjorts för enkelhetens skull. Först anges inte substratet. För NMR-baserad aktivitet analyser att vara användbara, den slutliga koncentrationen av substrat bör inte vara mer än 2-3x Km värde4. I de exempel som visas är de slutliga koncentrationerna av adenosin och 5-fluorouridin 100 μM (km = 54 μM) och 50 μm (km = 15 μm). Att uppnå dessa koncentrationer i protokollen motsvarar 12 μL 5 mM adenosin eller 12 μL 2,5 mM 5-fluorouridin.

För det andra valdes den mängd enzym som föreskrivs i protokollen, 5 μL, till att motsvara det belopp som krävs för att resultera i cirka 75% omvandling av substrat till produkten på 30 min. Denna mängd motsvarar vanligt vis en stor utspädning från ett renat enzym bestånd, och spädningen måste bestämmas i förväg för varje enzym. Renas AGNH och UNH enzym lager lösningar lagras vid-80 ° c i Ali kvoter som ger tillräckligt enzym för flera tusen reaktioner. Därför behöver utspädnings faktorn helst endast bestämmas eller val IDE ras med några månaders mellanrum. För det tredje har det specifika 1D NMR-experimentet inte angetts. I representativa resultat visas 1H NMR för agnh10 och 19F NMR visas för UNH9, med NMR-experimentet som beskrivs i motsvarande referenser. Valet av NMR experiment beror på enzymet reaktion och substrat tillgängliga samt tillgängliga NMR instrumentering. Slutligen bör det påpekas att den beskrivna experimentella metoden inte följer de stränga kraven i kvantitativ NMR (qnmr)13,14. I protokollet bestäms en procentuell reaktion med hjälp av de relativa förändringarna i intensitet av samma resonans i varje spektrum, snarare än genom bestämning av absoluta koncentrationer. Detta tillvägagångs sätt eliminerar behovet av data insamling och bearbetning ändringar samt interna eller externa standarder, som krävs för qNMR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. inledande test sammansatta analyser vid 500 μM och 250 μM

  1. Förbered substrat och test förening för reaktioner.
    1. Bered stam lösningar av substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) i vatten och 50 mM test substans i deutera dimetylsulfoxid (DMSO). Se inlednings avsnittet för koncentrationer av substrat lösning att använda.
    2. Tillsätt 12 μL substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) till vart och ett av fyra 1,5 mL mikrofugerör, 1 – 4.
    3. Tillsätt 6 μL deuterat DMSO till rör 1 (0 min kontroll) och 4 (30 min kontroll). Tillsätt 6 μL av test substansen till rör 2. Tillsätt 3 μL av test substansen och 3 μL deuteerats DMSO till rör 3.
  2. Förbered tillräcklig reaktion stam lösning.
    Anmärkning: stam lösningen är fem reaktioner som vardera innehåller 517 μL buffert, 60 μL deuterium oxid och 5 μL enzym lösning (AGNH eller UNH). Se inlednings avsnittet för koncentrationer av enzym lösning att använda.
    1. Tillsätt 2,59 mL reaktionsbuffert (50 mM kalium fosfat, 0,3 M KCl, pH 6,5) till ett 15 mL koniskt rör. Tillsätt 300 μL deuterium oxid till det koniska röret. Tillsätt 25 μL enzym lösning (AGNH eller UNH) till den koniska.
    2. Vänd försiktigt det koniska röret två gånger för att blanda.
  3. Samtidigt initiera och släcka 0 min kontroll reaktion. Överför 582 μL av reaktions beståndets lösning till ett rent mikrofugerör. Tillsätt 10 μL 1,5 M HCl till detta mikrofugerör. Överför det kombinerade 592 μL till mikrofugeröret 1. Aspirera och Dispensera provet två gånger på ett långsamt men medvetet sätt.
  4. Initiera och köra de återstående tre reaktionerna i vacklade mode. Vid tiden 0 min, överför 582 μl av reaktionen stam lösning till mikrofugrör Tube 2. Aspirera och Dispensera provet två gånger på ett långsamt men medvetet sätt. Upprepa vid 30 s intervall för mikrofusrören 3 och 4. Vänta 30 min.
  5. Släcka reaktionerna. Vid tiden 30 min, tillsätt 10 μl 1,5 M HCl till mikrofugrör 2. Upprepa vid 30 s intervall för mikrofusrören 3 och 4. Överför 600 μL lösning från varje mikrofuge till NMR-rör.
  6. Förvärva en 1D NMR spektrum på varje prov. Bearbeta data för att säkerställa korrekt fasning och platta bas linjer.
  7. Beräkna procent omvandlingen av substrat för kontroll spektra.
    1. Överlägg spektrat för 0 min och 30 min kontroller. Skala substratsignalen i 0 min kontroll för att matcha 30 min kontroll. Notera denna procents ATS.
    2. Beräkna procent konverteringen som (100 – procent bestäms i steg 1.7.1).
  8. Beräkna procent omvandlingen av substrat för reaktioner som innehåller test substans.
    1. Overlay Spectra för 0 min kontroll och första reaktion som innehåller 500 μM test förening. Skala substratsignalen i 0 min kontroll för att matcha spektrumet med test förening. Notera denna procents ATS. Beräkna procent konvertering som (100 – procent bestämd).
    2. Upprepa för den andra reaktionen som innehåller test substansen 250 μM.
  9. Beräkna procent reaktionen och procentuell hämning för varje test sammansatt koncentration.
    1. Beräkna procent reaktionen som (1.8.1/1.7.2) x 100.
    2. Beräkna procent hämning som (100 – procent fastställt i steg 1.9.1).

2. bestämning av IC50 -värden

  1. Förbered substrat och test förening för reaktioner.
    1. Förbered lager lösningar av substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) i vatten och 10 mM test förening i deutade DMSO. Se inlednings avsnittet för koncentrationer av substrat lösning att använda.
  2. Förbered serie utspädningar av 10 mM test förening (i deutinerats DMSO).
    1. Tillsätt 36 μl deutererats DMSO till fem 1,5 ml mikrofugrör rör, 1 – 5.
    2. Tillsätt 12 μL 10 mM test substans till tub 1 och knacka lätt för att blanda. Test sammansättningen är nu 2,5 mM.
    3. Överför 12 μL från rör 1 till rör 2 och knacka lätt för att blanda. Test sammansättningen är nu 0,63 mM. Överför 12 μL från rör 2 till rör 3 och knacka lätt för att blanda. Test sammansättningen är nu 0,16 mM. Överför 12 μL från rör 3 till rör 4 och knacka lätt för att blanda. Test sammansättningen är nu 0,04 mM. Överför 12 μL från röret 4 till rör 5 och knacka lätt för att blanda. Test sammansättningen är nu 0,01 mM.
  3. Förbered 14 1,5 mL mikrofugerör för reaktioner.
    1. Tillsätt 12 μL substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) till var och en av 14 1,5 mL mikrofugerör, 1-14.
    2. Tillsätt 12 μL deuterat DMSO till rör 1 (0 min kontroll) och 14 (30 min kontroll).
    3. Tillsätt 12 μL 10 mM test substans i rör 2 och 3. Tillsätt 12 μL 2,5 mM prov substans till rören 4 och 5. Tillsätt 12 μL 0,63 mM prov substans i rör 6 och 7. Tillsätt 12 μL 0,16 mM prov substans i rören 8 och 9. Tillsätt 12 μL 0,04 mM prov substans till rören 10 och 11. Tillsätt 12 μL 0,01 mM prov substans till rören 12 och 13.
  4. Bered tillräcklig reaktions stam lösning för att köra 15 reaktioner som innehåller 511 μL buffert, 60 μL deuterium oxid och 5 μL enzym lösning (AGNH eller UNH) vardera. Se inlednings avsnittet för koncentrationer av enzym lösning att använda.
    1. Tillsätt 7,67 mL reaktionsbuffert (50 mM kalium fosfat, 0,3 M kaliumklorid, pH = 6,5) till ett 15 mL koniskt rör. Tillsätt 900 μL deuterium oxid till det koniska röret. Tillsätt 75 μL enzym lösning (AGNH eller UNH) till den koniska.
    2. Vänd försiktigt det koniska röret 2x för att blanda.
  5. Följ de steg som beskrivs i steg 1.3 – 1.9 till (med 576 μL reaktions stam lösning) för att fastställa procent reaktion för varje koncentration av test sammansättningen.
  6. Beräkna IC50 värde med hjälp av Graphpad Prism.
    1. Skapa en data tabell korrelera loggen för reaktion test sammansatta koncentrationer (200 μM, 50 μM, 12,5 μM, 3,13 μM, 0,78 μM, 0,20 μM) med procent reaktion (två värden vardera).
    2. Använd en icke-linjär kurv passning för att fastställa IC50 -värdet och standard felet.

3. rengörings medels räknare skärm analyser vid 100 μM och 50 μM

  1. Förbered substrat och test förening för reaktioner.
    1. Förbered lager lösningar av substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) i vatten och 10 mM test förening i deutade DMSO. Se inlednings avsnittet för koncentrationer av substrat lösning att använda.
    2. Tillsätt 12 μl substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) till var och en av åtta 1,5 ml mikrofugrör rör, 1 – 8.
    3. Tillsätt 6 μL deuterat DMSO till rören 1 och 5 (0 min kontroller) och 4 och 8 (30 min kontroller). Tillsätt 6 μL test substans i rören 2 och 6. Tillsätt 3 μL test förening och 3 μL deutererats DMSO till rör 3 och 7.
  2. Bered tillräcklig reaktions stam lösning utan tvätt medel för att köra fem reaktioner som innehåller 517 μL buffert, 60 μL deuterium oxid och 5 μL enzym lösning (AGNH eller UNH) vardera. Se inlednings avsnittet för koncentrationer av enzym lösning att använda.
    1. Tillsätt 2,59 mL reaktionsbuffert (50 mM kalium fosfat, 0,3 M kaliumklorid, pH = 6,5) till ett 15 mL koniskt rör. Tillsätt 300 μL deuterium oxid till det koniska röret. Tillsätt 25 μL enzym lösning (AGNH eller UNH) till den koniska.
    2. Vänd försiktigt det koniska röret 2x för att blanda.
  3. Bered tillräcklig reaktions lager lösning med 0,01% v/v Triton X-100 rengörings medel för att köra fem reaktioner som innehåller 517 μL buffert, 60 μL deuterium oxid och 5 μL enzym lösning (AGNH eller UNH) vardera.
    1. Tillsätt 2 μL Triton X-100 rengörings medel till 20 mL reaktionsbuffert (50 mM kalium fosfat, 0,3 M kaliumklorid, pH = 6,5). Rengörings medels lösningar måste användas inom 1 dag.
    2. Tillsätt 2,59 mL reaktionsbuffert innehåll ande 0,01% Triton X-100 rengörings medel till ett 15 mL koniskt rör. Tillsätt 300 μL deuterium oxid till det koniska röret. Tillsätt 25 μL enzym lösning (AGNH eller UNH) till den koniska.
    3. Vänd försiktigt det koniska röret 2x för att blanda.
  4. För rör 1 – 4, med hjälp av reaktions beståndets lösning utan tvätt medel, Följ de steg som beskrivs i steg 1.3 – 1.9 för att bestämma procenthämningen för varje test sammansatt koncentration.
  5. För rör 5 – 8, med hjälp av reaktions beståndets lösning med 0,01% v/v Triton X-100 rengörings medel, Följ de steg som beskrivs i steg 1.3 – 1.9 för att bestämma procentuell hämning för varje test sammansatt koncentration.

4. test av räknare för snabb utspädning

  1. Förbered substrat-och test föreningarna för reaktioner
    1. Förbered lager lösningar av substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) i vatten och 10 mM test förening i deutade DMSO. Se inlednings avsnittet för koncentrationer av substrat lösning att använda.
    2. Tillsätt 53,8 μL reaktionsbuffert (50 mM kalium fosfat, 0,3 M kaliumklorid, pH = 6,5) till två 1,5 mL mikrofugerör (vardera), 1 och 2. Tillsätt 5 μL av enzymet (AGNH eller UNH) till rören 1 och 2.
    3. Tillsätt 511 μL reaktionsbuffert till två 1,5 mL mikrofugerör, 3 och 4 (vardera). Tillsätt 60 μL deuterium oxid till rör 3 och 4. Tillsätt 5 μL av enzymet (AGNH eller UNH) till rören 3 och 4.
    4. Tillsätt 1,2 μL deuteerats DMSO till rör 1 (30 min kontroll). Tillsätt 1,2 μL test substans till rör 2. Tillsätt 12 μL deutera DMSO till rör 3 (30 min kontroll). Tillsätt 12 μL av test substansen till rör 4. Inkubera i 30 min.
  2. Förbered två 1,5 mL mikrofugerör med spädnings lösning.
    1. Tillsätt 468 μL reaktionsbuffert till var och en av två 1,5 mL mikrofugerör, 5 och 6. Tillsätt 60 μL deuterium oxid till varje tub (5 och 6).
  3. Förbered fyra 1,5 mL mikrofugerör för reaktionerna.
    1. Tillsätt 12 μL substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) till var och en av fyra 1,5 mL mikrofuge rör, 7 – 10.
  4. Utför hopp-utspädningar och initiera reaktionerna.
    1. Överför 528 μL lösning från röret 5 till rör 1. Aspirera och Dispensera provet två gånger på ett långsamt men medvetet sätt. Överför 528 μL lösning från rör 6 till rör 2. Aspirera och Dispensera provet två gånger på ett långsamt men medvetet sätt.
    2. Vid tiden 0 min, överför 588 μL lösning från rör 1 till rör 7. Aspirera och Dispensera provet 2x på ett långsamt men medvetet sätt. Vid 30-intervaller, överför 588 μL lösning från rör 2 till rör 8, rör 3 till rör 9 och rör 4 till rör 10. Aspirera och Dispensera provet två gånger på ett långsamt men medvetet sätt. Vänta 30 min.
  5. För rören 7 – 10, Följ de steg som beskrivs i steg 1.5 – 1.9 för att bestämma procentuell hämning för varje test sammansatt koncentration.

5. sammansatta analyser i E. coli hela celler

  1. Förbered 10 mL över natten kultur av E. coli på dagen före experiment.
  2. Förbered E. coli -celler för NMR-experiment.
    1. Centrifugera cellerna i 1 mL Ali kvoter i 10 min vid 15 000 x g.
    2. Kassera supernatanten och resuspendera varje alikvot av cellerna i 1 mL reaktionsbuffert (50 mM kalium fosfat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) genom att vortexing.
  3. Följ avsnitt 1 eller 2 för den önskade analysen med följande ändringar:
    1. Ersätt 280 μL buffert i reaktionsstocklösningen med 280 μL återsuspenderade celler.
    2. Ersätt 5 μL av enzymet (AGNH eller UNH) i reaktionsstocklösningen med 5 μL buffert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 visar resultaten för att testa två föreningar mot agnh med 1H NMR enligt avsnitt 1. Enzymet reaktion är lättast observeras och kvantifieras av försvinnandet av adenosin singlet och Doublet resonanser vid 8,48 ppm och 6,09 ppm, respektive, och utseendet på en adenin singlet resonans vid 8,33 ppm som observerats i 30 min kontroll Spektrum. I närvaro av 500 μM sammansatta 1, ingen produkt bildas som framgår av avsaknaden av en adenin resonans vid 8,33 ppm. I närvaro av 250 μM sammansatt 1, ca 10% av substratet har omvandlats till produkt. Däremot, ingen koncentration av sammansatta 2 hämmar enzymet som framgår av substrat och produkt resonanser liknar dem i 30 min kontroll spektrum. Dessa data identifierar sammansatta 1 som en bra AGNH-hämmare. Observera att resonanser som härrör från sammansatta 1 (7,70-8.00 och 8,50-8.60 ppm) och sammansatta 2 (7.40-7.80 ppm) också observeras. Samma substrat och produkt resonanser används för att övervaka reaktionerna som visas i figur 4, figur 6, figur 8och figur 10. Figur 3 visar resultaten för att testa två föreningar mot UNH med 19F NMR enligt avsnitt 1. Enzym reaktionen observeras och kvantifieras enkelt genom försvinnandet av 5-fluorouridinresonans vid-165,8 ppm och utseendet av en 5-fluorouracil resonans vid-169,2 ppm som observerats i 30 min kontroll spektrum. För detta enzym, sammansatta 2 hämmar helt reaktionen vid båda koncentrationerna medan sammansatta 1 har ingen effekt. Dessa data identifierar sammansatta 2 som en bra UNH-hämmare. Samma substrat och produkt resonanser används för att övervaka reaktionerna som visas i figur 5, figur 7, figur 9och figur 11.

Figur 4 visar dos-responsnmr-data och resulterande IC50 kurva som erhållits för en förening med agnh-aktivitet med 1H NMR enligt avsnitt 2. NMR-data visas endast för en av de dubbla prövningarna. Observera att resonanser som härrör från den testade föreningen (6.90-7.40 ppm) inte stör substratet eller produkten resonanser. IC50 Curve var lämplig med hjälp av data från båda studierna och resulterade i ett värde av 12,3 ± 5,0 μM. Detta resultat är förenligt med NMR data i att betydande förlust av substrat signalen inte observeras förrän den sammansatta koncentrationen reduceras till 12,5 μM. Figur 5 visar NMR-data för DOS-respons och resulterande IC50 kurva som erhållits för en förening med UNH-aktivitet med hjälp av 19F NMR enligt avsnitt 2. NMR-data visas endast för en av de dubbla prövningarna. IC50 Curve var lämplig med hjälp av data från båda studierna och resulterade i ett värde av 16,7 ± 10,4 μM. Detta värde överensstämmer med NMR-data i att signifikant förlust av substrat signalen inte observeras förrän den sammansatta koncentrationen reduceras till 12,5 μM.

Figur 6 visar resultaten för att testa en förening vid två koncentrationer mot agnh i frånvaro av och förekomst av 0,01% Triton X-100 rengörings medel med 1H NMR enligt avsnitt 3. Endast minimala skillnader observeras i intensiteter av substratet och produkt signalerna med hjälp av de två betingelserna, vilket indikerar att den observerade enzymhämningen inte är en artefakt av sammansatt agg regering. Observera att resonanser som härrör från den testade föreningen (7.10-7,70 ppm) och Triton X-100 (6,90 och 7,40 ppm) inte stör substratet eller produktens resonanser. Figur 7 visar resultaten för att testa en förening vid två koncentrationer mot UNH i frånvaro och förekomst av 0,01% Triton X-100 rengörings medel med 19F NMR enligt avsnitt 3. Endast minimala skillnader observeras i intensiteter av substratet och produkt signalerna med hjälp av de två betingelserna, vilket indikerar att den observerade enzymhämningen inte är en artefakt av sammansatt agg regering.

Figur 8 visar resultaten för att testa en substans i test metoden för hopp utspädning mot agnh med hjälp av 1H NMR enligt avsnitt 4. Den reducerade intensiteten hos substrat signalen i reaktionen på 20 μM jämfört med reaktionen på 200 μM indikerar att hämningen är reversibel. Den testade föreningen har ett IC50 -värde på 21,0 μM, och dess resonanser observeras vid 6.90-8.30 ppm. I detta exempel, resonanser från föreningen störa de av adenin produkt signalen, och reaktions förloppet är lättare att övervaka med hjälp av adenosinresonans vid 6,09 ppm. Figur 9 visar resultaten för att testa en substans i test metoden för hopp utspädning mot UNH med hjälp av 19F NMR enligt avsnitt 4. Den ökade intensiteten av produkt signalen vid-169,2 ppm i reaktionen på 20 μM jämfört med reaktionen på 200 μM indikerar att hämningen är reversibel. Den testade föreningen har ett IC50 -värde på 16,7 μM.

Figur 10 visar nyttan av metoden för att utföra analyser i hela celler med hjälp av 1H NMR följande avsnitt 5. Adenosinsubstrat signalerna är nästan helt borta efter 30 min i närvaro av hela celler, vilket indikerar hydrolys av substratet. Däremot förblir underlaget oförändrat efter 30 min i närvaro av cell Growth Media supernatant, vilket indikerar att hydrolysreaktionen är cell beroende. Notera förekomsten av många bakgrunds signaler i supernatanten spektra, inklusive intensiva triplett signaler från NH4+ joner på 6.90-7.15 ppm som också är närvarande i en mindre grad i hela cell spektra. Figur 11 visar nyttan av metoden för att utföra analyser i hela celler med hjälp av 19F NMR efter avsnitt 5. Den 5-fluorouridin substrat signalen är helt borta efter 60 min i närvaro av hela celler, vilket indikerar hydrolys av substratet. Däremot förblir underlaget oförändrat efter 60 min i närvaro av cell Growth Media supernatant, vilket indikerar att hydrolysreaktionen är cell beroende.

Figure 1
Figur 1: reaktioner katalyseras av UNH (överst) och AGNH (nederst). Observera att UNH kommer att katalysera hydrolys av både uridin och 5-fluorouridin (visas). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativa initiala sammansatta analyser vid 500 μ M och 250 μ M mot AGNH med 1H NMR. Regioner i 1H NMR reaktions spektra för två föreningar, vardera vid 500 μm och 250 μm, tillsammans med 0 min och 30 min kontroll spektra. 0 min kontroll spektrum innehåller adenosinsubstrat resonansar på 6,09, 8,38, och 8,48 ppm. 30 min kontroll spektrum innehåller en ny adenin produkt resonans vid 8,33 ppm. Test spektra innehåller ytterligare resonanser som härrör från den sammansatta testade. 1 den första H kemiska förändringar refererade till externa trimetylsilylpropionic Acid på 0,0 ppm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: representativa initiala sammansatta analyser vid 500 μ M och 250 μ M mot UNH med 19F NMR. Regioner i 19F NMR reaktions spektra för två föreningar, vardera vid 500 μm och 250 μm, tillsammans med 0 min och 30 min kontroll spektra. 0 min kontroll spektrum innehåller en 5-fluorouridin substrat resonans vid-165,8 ppm. 30 min kontroll spektrum innehåller en ny 5-fluorouracil produkt resonans vid-169,2 ppm. den 19 F kemiska förändringar refererade till extern 50 μM trifluoroetanol vid-76,7 ppm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: representativ dos-respons NMR-data och resulterande IC50 kurva erhålls för en förening med agnh-aktivitet med 1H NMR. Regioner i 1H NMR reaktions spektra för variabla koncentrationer av en förening (200-0,20 μM) tillsammans med 0 min och 30 min kontroll spektra. Resonanser från 6.90-7.40 ppm uppstår från den testade föreningen. IC50 Curve var Fit med hjälp av data från NMR data uppsättningar körs i dubblett. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: representativ dos-respons NMR-data och resulterande IC50 kurva erhålls för en förening med UNH-aktivitet med 19F NMR. Regioner i 19F NMR reaktions spektra för variabla koncentrationer av en förening (200-0,20 μM) tillsammans med 0 min och 30 min kontroll spektra. IC50 Curve var Fit med hjälp av data från NMR data uppsättningar körs i dubblett. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: representativa disk medels räknarens skärm analyser för en förening med AGNH-aktivitet med 1H NMR. Regioner i 1H NMR reaktions spektra för en förening vid 100 μM och 50 μm, tillsammans med 0 min och 30 min kontroll spektra, i närvaro och avsaknad av 0,01% Triton X-100. Resonanser vid 7.10-7,70 ppm och 6,90 och 7,40 ppm uppstår från den testade föreningen och Triton X-100, respectively. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: representativa disk medels räknarens skärm analyser för en förening med UNH-aktivitet med 19F NMR. Regioner i 19F NMR reaktions spektra för en förening vid 100 μM och 50 μm, tillsammans med 0 min och 30 min kontroll spektra, i närvaro och avsaknad av 0,01% Triton X-100. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: representativ skärm test för att motverka utspädning för en förening med AGNH-aktivitet med 1H NMR. Regioner i 1H NMR reaktions spektra för en förening vid 200 μM och 20 μm, tillsammans med 30 min kontroll spektra. Enzym inkuberades i 30 minuter vid 200 μM förening före början av reaktionerna, med 20 μM reaktion utspädd omedelbart innan reaktionen påbörjas. Resonanser på 6.90-8.30 ppm uppstår från den testade föreningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: representativ skärm test för att motverka utspädning för en förening med UNH-aktivitet med 19F NMR. Regioner i 19F NMR reaktions spektra för en förening vid 200 μM och 20 μm, tillsammans med 30 min kontroll spektra. Enzym inkuberades i 30 minuter vid 200 μM förening före början av reaktionerna, med 20 μM reaktion utspädd omedelbart innan reaktionen påbörjas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10: representativa analyser i hela celler med 1H NMR. Regioner i 1H NMR reaktions spektra för prover som innehåller antingen 280 ΜL av E. coli -celler resuspenderade i buffert (0, 15, och 30 min) eller cell Growth Media supernatanten (30 min). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 11
Figur 11: representativa analyser i hela celler med 19F NMR. Regioner i 19F NMR-reaktionsspektra för prover som innehåller antingen 280 μl E. coli -celler som återsuspenderas i buffert (0, 15, 30 och 60 min) eller supernatanten för cell tillväxt (60 min). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De beskrivna protokollen är allmänt tillämpliga på många enzymer, förutsatt att substrat och/eller produkter har matchas signaler i NMR-spektrumet. Det är dock viktigt att koncentrationen av substrat ligger nära sitt Km -värde och tillräckligt hög för att upptäckas i ett NMR-experiment inom en rimlig tidsram. En substrat koncentration som inte är högre än 2-3x Km -värdet är optimalt för att upptäcka konkurrens kraftiga, icke-konkurrenshämmande och icke-konkurrenshämmande hämmare4. Som visats här för UNH, substrat, Km värden så låg som 15 μM är lämpliga. Användningen av substrat med CH3 eller CF3 signaler, tillsammans med NMR data insamling på kryogena sonder, kan sänka denna tröskel ännu ytterligare15. Enzymer som har substrat Km värden under 1 μM, emellertid, är sannolikt svårt att studera med hjälp av denna metod på grund av den inneboende låg känslighet av NMR experiment. I dessa situationer är spektrofotometri eller fluorescensspektroskopi lämpligare tekniker.

En annan begränsning till tillämpningen av dessa metoder är en lämplig kylning agent. Alla protokoll som beskrivs här är fasta tids analyser, med reaktionen släckt efter 30 min genom tillsats av HCl. För både agnh och UNH, hade det tidigare fastställts att HCl omedelbart stoppade reaktionen, och höll den stoppad för perioder av veckor9,10. Detta är viktigt eftersom dussin tals reaktioner ofta körs samtidigt och sedan köas för NMR data insamling under en period av flera timmar. Det är också viktigt att fastställa att icke-enzymatisk nedbrytning av substrat eller produkt signaler inte uppstår efter kylning men före NMR data insamling. Förutom HCl, andra vanliga sätt att släcka reaktionerna är genom tillsats av en känd HDAC vid nanomolära hämmare16 eller, i fråga om reaktioner som involverar adenosintrifosfat, tillsats av kelatbildare etylendiamintetraättiksyra17.

NMR-baserade aktivitets analyser ger mervärde när de används för fragment screening eller ortogonala analyser för att validera hög genom strömning screening träffar4. I motsats till bindande analyser identifierar eller bekräftar NMR-baserade aktivitets analyser föreningar som faktiska hämmare. Aktivitets analyserna använder också mycket mindre mål enzym än bindande analyser. Samma metoder är oerhört robust för två typer av Counter skärmar utförs för att validera reversibel, mål-specifik aktivitet och utesluta artifaktuella assay aktivitet18. Disk medel och hopp utspädning analyser är Counter-screens för kolloidal aggregation19 och irreversibel hämning20, respektive. Föreningar som klarar dessa tester är validerade utgångs punkter för läkemedels kemi och strukturstyrd inhibitor optimering. NMR-baserade aktivitets analyser kan fortsätta att tillhandahålla sammansatta aktivitets data allteftersom projektet fortskrider mot nanomolära hämmare.

Slutligen, nyttan av dessa analyser för övervakning reaktioner i hela celler är anmärknings värt21. Korrelera hämning av renat enzym med hämning av in-cell enzym skulle ge definitiva bevis för den biokemiska mekanismen bakom den observerade fenotypisk effekt22. För de två enzymer som presenteras här, den önskade fenotypiska effekten är förlust av lönsamhet (antitrichomonal aktivitet). Ett samband mellan renat enzym hämning, i-cell enzym hämning, och parasit celldöd skulle utgöra bevis på hämmaren verkningsmekanismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Dr Dean Brown för att tillhandahålla föreningar från AstraZeneca fragment biblioteket och Dr David Parkin för att ge AGNH och UNH enzymer. Forskning som rapporter ATS i denna publikation stöddes av det nationella institutet för allergi-och infektions sjukdomar vid nationella hälso institut under Award Number R15AI128585 till B. J. S. Innehållet är ensamt ansvaret för författarna och inte nödvändigt vis företräder de officiella synpunkter från de nationella instituten för hälsa. Research stöddes också av en Horace G. McDonell Summer Research stipendium tilldelas S. N. M., en Landesberg familj Stipendium tilldelas J. A. G., och fakultets utvecklings bidrag och Frederick Bettelheim Research Award från Adelphi University till B. J. S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AGNH Purified in-house N/A TVAG_213720
UNH Purified in-house N/A TVAG_092730
Adenosine Sigma A9251
5-Fluorouridine Sigma F5130
Dimethyl sulfoxide-D6 Cambridge Isotope Labs DLM-10-100 D, 99.9%
Potassium phosphate monobasic Sigma P0662
Potassium phosphate dibasic Sigma P3786
Potassium chloride Sigma P9541
Deuterium oxide Cambridge Isotope Labs DLM-4-100 D, 99.9%
Hydrochloric acid Fisher Chemical A144212
Triton X-100 Sigma X100
3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP) Sigma 269913 D, 98%
2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2 Sigma 612197 D, 99.5%
Pipette Gilson F123602 PIPETMAN Classic P1000
Pipette Gilson F123601 PIPETMAN Classic P200
Pipette Gilson F123600 PIPETMAN Classic P20
Microfuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
Conical tubes Corning 352099
Microcentrifuge Eppendorf 5418
Vortex mixer Fisher Scientific 02215365
NMR tubes Norell 502-7 Or as appropriate for the NMR
NMR spectrometer Bruker N/A AvanceIII500
Prism software GraphPad N/A Version 5.04

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
  2. Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
  3. Dalvit, C., et al. A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening. Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).
  4. Dalvit, C. Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery. Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).
  5. Stockman, B. J., et al. Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments. Chemical Biology & Drug Design. 73, 179-188 (2009).
  6. Hirt, R. P., Sherrard, J. Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations. Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).
  7. Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world. Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).
  8. Versées, W., Steyaert, J. Catalysis by nucleoside hydrolases. Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).
  9. Shea, T. A., et al. Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).
  10. Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).
  11. Muellers, S. N., et al. Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase. ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).
  12. Veronesi, M., et al. Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells. Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).
  13. Holzgrabe, U. Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications. Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).
  14. Bharti, S. K., Roy, R. Quantitative 1H NMR spectroscopy. Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).
  15. Dalvit, C., et al. Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications. Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).
  16. Lambruschini, C., et al. Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH. ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).
  17. Stockman, B. J. 2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening. Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).
  18. Aldrich, C., et al. The ecstasy and agony of assay interference compounds. ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).
  19. Feng, B. Y., Shoichet, B. K. A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors. Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).
  20. Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis. Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).
  21. Griveta, J. -P., Delort, A. -M. NMR for microbiology: In vivo and in situ applications. Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).
  22. Nijman, S. M. B. Functional genomics to uncover drug mechanism of action. Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).

Tags

Kemi disk medels disk skärm enzym aktivitets analys IC50 värde Jump-spädning 1H NMR 19F NMR hela cellen NMR nukleosidribohydrolase
NMR-baserade aktivitets analyser för bestämning av sammansatt hämning, IC<sub>50</sub> -värden, artifaktuella aktiviteter och helcellsaktivitet av Nukleosidribohydrolaser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stockman, B. J., Kaur, A., Persaud,… More

Stockman, B. J., Kaur, A., Persaud, J. K., Mahmood, M., Thuilot, S. F., Emilcar, M. B., Canestrari, M., Gonzalez, J. A., Auletta, S., Sapojnikov, V., Caravan, W., Muellers, S. N. NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases. J. Vis. Exp. (148), e59928, doi:10.3791/59928 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter