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Chemistry

화합물 억제, IC50 값, 관절 활성 및 뉴클레오시드 리보하이드라제의 전세포 활성을 결정하기 위한 NMR 기반 활성 반응

Published: June 30, 2019 doi: 10.3791/59928
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

Summary

NMR 기반 활성 세포는 2개의 뉴클레오시드 리보하이드로라제 효소의 억제제를 식별하고 특성화하기 위해 개발되었다. 프로토콜은 500 μM 및 250 μM에서 초기 화합물 분석, IC50 값, 세제 카운터 스크린 분석, 점프 희석 카운터 스크린 분석, 및 대장균 전체 세포에서 분석법을 결정하기 위한 투여 량 반응 분석법을 위해 제공된다.

Abstract

NMR 분광법은 약물 발견에서 효소 억제제의 식별 및 특성화, 특히 단편 스크리닝의 맥락에서 종종 사용됩니다. NMR 기반 활성 측정은 이러한 약한 억제제를 검출하는 데 필요한 시험 화합물의 고농도에서 작업하는 데 이상적입니다. NMR 실험에서 다이나믹 레인지및 화학적 시프트 분산은 기판, 제품 및 테스트 화합물의 공명을 쉽게 해결할 수 있습니다. 이는 UV-vis 흡수 프로파일이 겹치는 화합물에서 판독 간섭 문제가 종종 발생하는 분광광도 측정 분석과 대조됩니다. 또한, 리포터 효소가 부족하기 때문에, 단일 효소 NMR 분석법은 결합-분석 거짓 양성에 취약하지 않다. 이 속성은 전통적인 높은 처리량 검열 검문 및 벤치탑 분류 검문 검사를 보완하는 직교 검문 검사로 그(것)들을 유용하게 합니다. 상세한 프로토콜은 500 μM 및 250 μM에서 초기 화합물 분석, IC50 값, 세제 카운터 스크린 분석, 점프 희석 카운터 스크린 분석, 및 대장균 전체 세포에서 분석법을 결정하기 위한 투여 량 반응 분석법을 위해 제공된다. 이 방법은 2개의 뉴클레오시드 리보하이드로라제 효소를 사용하여 입증된다. 1H NMR의 사용은 푸린 특이적 효소에 대해, 19F NMR은 피리미딘 특이적 효소에 대해 나타난 다. 프로토콜은 일반적으로 기질 및 생성물 공진이 NMR 분광법에 의해 관찰되고 구별될 수 있는 모든 효소에 적용됩니다. 약물 발견의 맥락에서 가장 유용하게 사용하려면, 기판의 최종 농도는 Km 값의 2-3 배 이상이어야한다. NMR 실험의 선택은 사용 가능한 효소 반응 및 기질뿐만 아니라 사용 가능한 NMR 계측에 달려 있습니다.

Introduction

핵 자기 공명 (NMR) 분광법은 효소 반응을 특성화하고 모니터링하기위한 잘 확립되어 있습니다 1,2. 화학 적 변화와 커플링 패턴의 차이는 기판과 제품 공명을 구별하는 데 사용되며 상대 공명 강도는 반응의 백분율을 정량화하는 데 사용됩니다. 기판의 소비와 제품의 생성은 모두 NMR 스펙트럼에서 직접 관찰된다. 이는 분광광도법 또는 형광 분광법과 대조되는데, 반응 시간 과정은 일부 화학 종에 기인하는 흡광도의 변화로 인해 소비되거나 생성됩니다. 다른 방법과 마찬가지로 NMR은 효소 반응을 온도, pH 또는 다른 용액 조건의 함수로 연구하는 데 사용할 수 있으며 억제제의 효과를 결정할 수 있습니다.

보다 최근에는, NMR 계 효소 활성 성검사가 단편 스크리닝 3,4에대해 입증되었다. NMR 기반 측정은 이러한 약한 억제제를 검출하는 데 필요한 시험 화합물(종종 1mMM)의 고농도에서 작업하는 데 이상적입니다. NMR 실험에서 다이나믹 레인지및 화학적 시프트 분산은 기판, 생성물 및 테스트 화합물의 공명을 쉽게 해결할 수 있습니다. 이는 UV-vis 흡수 프로파일이 겹치는 화합물에서 판독 간섭 문제가 종종 발생하는 분광광도 측정 분석과 유리하게 비교됩니다. 또한, 리포터 효소가 부족하기 때문에, 단일 효소 NMR 분석법은 결합-분석 거짓 양성에 취약하지 않다. 이러한 장점은 기존의 높은 처리량 선별 검문 및 벤치탑 심사 검문 5를 보완하는 직교 검문 검사로 유용하게 만듭니다.

우리의 연구 실험실에서, NMR 기지를 둔 활동 시험은 트리코모나스 질 핵핵리보하이드라제의 억제제기준을 확인하고 평가하기 위하여 이용됩니다. 상기 T. 질성 기생충은 가장 널리 퍼진 비바이러스성 성병6을일으킨다. 기존 치료법에 대한 저항성 증가 7은 주요 표적을 나타내는 필수 뉴클레오시드 인양 경로 효소와 함께 새로운 메커니즘 기반 치료법에 대한 필요성을 주도하고있다8. NMR 기반 활성 세포는 피리미딘- 및 푸린 특이적 효소, 우리딘 뉴클레오시드 리보하이드라제(UNH)9,및 아데노신/구아노신을 선호하는 뉴클레오시드 리보하이드로라제(AGNH)10모두에 대해 개발되었다. 이 두 효소에 의해 촉매작용된 반응은 그림1에 나타내었다. NMR 분석을 사용하여 화학적 시작점에 대한 단편 라이브러리를 스크리팅하고, IC50 값을 결정하고, 응집기반 또는 공유 결합 억제제(11)를 잡초아웃한다. 동일한 아세이역시 전체 세포에서 효소 활성을 평가하기 위해 번역되고있다 12.

상세한 프로토콜은 500 μM 및 250 μM에서 초기 화합물 분석, IC50 값, 세제 카운터 스크린 분석, 점프 희석 카운터 스크린 분석, 및 대장균 전체 세포에서 분석법을 결정하기 위한 투여 량 반응 분석법을 위해 제공된다. 프로토콜은 일반적으로 기질 및 생성물 공진이 NMR 분광법에 의해 관찰되고 구별될 수 있는 모든 효소에 적용됩니다. 단순성에 대한 세 가지 가정이 만들어졌습니다. 첫째, 기판은 지정되지 않는다. NMR 기반 활성 반응의 유용성을 위해, 기판의 최종 농도는 Km 값 4의2-3배 이하이어야 한다. 도시된 예에서, 아데노신 및 5-플루오로우리딘의 최종 농도는 각각 100 μM(Km = 54 μM) 및 50 μM(Km= 15 μM)이다. 프로토콜에서, 이들 농도를 달성하는 것은 5 mM 아데노신의 12 μL 또는 2.5 mM 5-플루오루리딘의 12 μL에 해당한다.

둘째, 프로토콜에 제공된 효소의 양은 5 μL로, 30분 내에 기질의 약 75% 변환을 초래하는 데 필요한 양에 대응하기 위해 선택되었다. 이러한 양은 전형적으로 정제된 효소 스톡으로부터 큰 희석을 나타내며, 희석은 각 효소에 대해 미리 결정되어야 한다. 정제된 AGNH 및 UNH 효소 스톡 용액은 수천 개의 반응에 충분한 효소를 제공하는 양현표에 -80°C에 저장됩니다. 따라서, 희석 계수는 이상적으로 단지 몇 개월마다 결정되거나 검증될 필요가 있다. 셋째, 특정 1D NMR 실험은 지정되지 않았다. 대표적인 결과에서, 1H NMR은 UNH 9에 대해 도시된 AGNH10 및 19F NMR에 대해 도시되며, 해당 참조에 기재된 NMR 실험과 함께 도시된다. NMR 실험의 선택은 사용 가능한 효소 반응 및 기질뿐만 아니라 사용 가능한 NMR 계측에 달려 있습니다. 마지막으로, 설명된 실험 접근법이 정량적 NMR(qNMR)13,14의엄격한 요건을 준수하지 않는다는 점을 지적해야 한다. 프로토콜에서 백분율 반응은 절대 농도를 결정하는 것이 아니라 각 스펙트럼에서 동일한 공진의 강도의 상대적 변화를 사용하여 결정됩니다. 이 방법을 사용하면 qNMR에 필요한 내부 또는 외부 표준뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리 수정이 필요하지 않습니다.

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Protocol

1. 500 μM 및 250 μM에서 초기 시험 화합물 검아

  1. 반응에 대한 기판 및 테스트 화합물을 준비합니다.
    1. 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 물 속기(아데노신 또는 5-플루오루리딘)와 50 mM 시험 화합물의 재고 용액을 준비합니다. 사용할 기판 용액의 농도에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.
    2. 기질 12 μL (아데노신 또는 5-플루오루리딘)을 각각 4 개의 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브, 1-4에 추가합니다.
    3. 튜브 1(0분 제어) 및 4(30분 제어)에 6 μL의 증분 DMSO를 추가합니다. 튜브 2에 6 μL의 테스트 화합물을 추가합니다. 시험 화합물 3 μL과 3 μL의 증정 된 DMSO를 튜브 3에 추가합니다.
  2. 충분한 반응 스톡 솔루션을 준비합니다.
    참고: 스톡 용액은 각각 완충액 517 μL, 60 μL의 중수소 산화물과 5 μL의 효소 용액 (AGNH 또는 UNH)을 포함하는 5 가지 반응을 위한 것입니다. 사용할 효소 용액의 농도에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.
    1. 2.59 mL의 반응 버퍼 (50 mM 칼륨 인산염, 0.3 M KCl, pH 6.5)를 15 mL 원추형 튜브에 추가합니다. 원유 관에 300 μL의 중수소 산화물을 추가합니다. 원엽에 25 μL의 효소 용액 (AGNH 또는 UNH)을 추가하십시오.
    2. 원추형 튜브를 두 번 부드럽게 뒤집어 섞어주세요.
  3. 동시에 0 분 제어 반응을 시작하고 담금질하십시오. 반응 스톡 용액의 582 μL을 깨끗한 마이크로퍼지튜브로 이송한다. 이 마이크로 퍼지 튜브에 10 μL의 1.5 M HCl을 추가합니다. 결합된 592 μL을 마이크로퍼지 튜브 1로 옮김. 느리지만 의도적인 방식으로 샘플을 두 번 흡인하고 분배합니다.
  4. 나머지 세 가지 반응을 비틀거리는 방식으로 시작하고 실행합니다. 시간 0 분, 마이크로 퍼지 튜브 2에 반응 스톡 용액의 582 μL을 전송합니다. 느리지만 의도적인 방식으로 샘플을 두 번 흡인하고 분배합니다. 마이크로 퍼지 튜브 3및 4의 경우 30초 간격으로 반복합니다. 30분 기다립니다.
  5. 반응을 담금질. 30분 동안 1.5M HCl의 10 μL을 마이크로퍼지2에 추가합니다. 마이크로 퍼지 튜브 3및 4의 경우 30초 간격으로 반복합니다. 각 마이크로퍼지에서 NMR 튜브로 600 μL의 용액을 전달합니다.
  6. 각 샘플에서 1D NMR 스펙트럼을 획득합니다. 데이터를 처리하여 올바른 진행 및 플랫 기준선을 보장합니다.
  7. 제어 스펙트럼에 대한 기판의 백분율 변환을 계산합니다.
    1. 0분 및 30분 컨트롤에 대한 스펙트럼을 오버레이합니다. 0분 컨트롤에서 기판 신호를 조정하여 30분 컨트롤과 일치시다. 이 백분율을 기록합니다.
    2. 백분율 전환을 (100 – 1.7.1 단계에서 결정된 백분율)으로 계산합니다.
  8. 테스트 화합물을 포함하는 반응에 대한 기판의 백분율 변환을 계산합니다.
    1. 500 μM 시험 화합물을 함유하는 0분 대조군 및 제1 반응에 대한 오버레이 스펙트럼. 0분 제어에서 기판 신호를 확장하여 스펙트럼과 테스트 화합물을 일치시다. 이 백분율을 기록합니다. 백분율 전환을 (100 – 백분율 결정)으로 계산합니다.
    2. 250 μM 시험 화합물을 함유하는 제2 반응에 대해 반복한다.
  9. 각 시험 화합물 농도에 대한 백분율 반응 및 퍼센트 억제를 계산합니다.
    1. 백분율 반응을 (1.8.1/1.7.2) x 100으로 계산합니다.
    2. 퍼센트 억제를 (100 – 단계 1.9.1에서 결정된 백분율)로 계산합니다.

2. IC50 값의 결정

  1. 반응에 대한 기판 및 테스트 화합물을 준비합니다.
    1. 기질(아데노신 또는 5-플루오루리딘)의 재고 용액을 수분 및 10 mM 테스트 화합물을 deuterated DMSO에서 준비합니다. 사용할 기판 용액의 농도에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.
  2. 10 mM 테스트 화합물의 연속 희석을 준비하십시오 (Deuterated DMSO에서).
    1. 5 개의 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브, 1-5에 36 μL deuterated DMSO를 추가합니다.
    2. 튜브 1에 12 μL 10 mM 테스트 화합물을 넣고 가볍게 두드려 섞어주세요. 테스트 화합물은 이제 2.5 mM입니다.
    3. 튜브 1에서 튜브 2로 12 μL을 옮기고 가볍게 두드려 섞어주세요. 테스트 화합물은 이제 0.63 mM입니다. 튜브 2에서 튜브 3로 12 μL을 옮기고 가볍게 눌러 섞어주세요. 테스트 화합물은 이제 0.16 mM입니다. 튜브 3에서 튜브 4로 12 μL을 옮기고 가볍게 눌러 섞어주세요. 테스트 화합물은 이제 0.04 mM입니다. 튜브 4에서 튜브 5로 12 μL을 옮기고 가볍게 눌러 섞어주세요. 테스트 화합물은 이제 0.01 mM입니다.
  3. 반응을 위해 14 개의 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브를 준비하십시오.
    1. 14 개의 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브, 1-14에 각각 기질 (아데노신 또는 5-플루오루딘)의 12 μL을 추가합니다.
    2. 튜브 1(0분 제어) 및 14(30분 제어)에 12 μL의 증분 DMSO를 추가합니다.
    3. 튜브 2와 3에 10 mM 테스트 화합물 12 μL을 추가합니다. 튜브 4와 5에 2.5 mM 테스트 화합물 12 μL을 추가합니다. 튜브 6 과 7에 0.63 mM 테스트 화합물의 12 μL을 추가합니다. 튜브 8과 9에 0.16 mM 테스트 화합물 12 μL을 추가합니다. 튜브 10 및 11에 0.04 mM 테스트 화합물의 12 μL을 추가합니다. 튜브 12 및 13에 0.01 mM 테스트 화합물의 12 μL을 추가합니다.
  4. 완충액 511 μL, 60 μL의 중수소 산화물과 5 μL의 효소 용액 (AGNH 또는 UNH)을 포함하는 15 개의 반응을 실행하기에 충분한 반응 스톡 솔루션을 준비하십시오. 사용할 효소 용액의 농도에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.
    1. 반응 버퍼 7.67 mL (50 mM 칼륨 인산염, 0.3 M KCl, pH = 6.5)를 15 mL 원추형 튜브에 추가합니다. 원유 관에 900 μL의 중수소 산화물을 추가합니다. 원유에 75 μL의 효소 용액 (AGNH 또는 UNH)을 추가하십시오.
    2. 원추형 튜브를 2x 부드럽게 뒤집어 섞습니다.
  5. 단계 1.3-1.9에 설명 된 단계를 따라 (반응 스톡 용액의 576 μL 사용) 각 시험 화합물 농도에 대한 퍼센트 반응을 결정합니다.
  6. 그래프 패드 프리즘을 사용하여 IC50 값을 계산합니다.
    1. 반응 테스트 화합물 농도(200 μM, 50 μM, 12.5 μM, 3.13 μM, 0.78 μM, 0.20 μM)와 백분율 반응(각각 2개 값)을 연관시키는 데이터 테이블을 작성합니다.
    2. 비선형 곡선 맞춤을 사용하여 IC50 값 및 표준 오차를 결정합니다.

3. 100 μM 및 50 μM에서 세제 카운터 스크린 검사

  1. 반응에 대한 기판 및 테스트 화합물을 준비합니다.
    1. 기질(아데노신 또는 5-플루오루리딘)의 재고 용액을 수분 및 10 mM 테스트 화합물을 deuterated DMSO에서 준비합니다. 사용할 기판 용액의 농도에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.
    2. 기질 12 μL(아데노신 또는 5-플루오루리딘)을 각각 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브 8개, 1-8개에 첨가합니다.
    3. 튜브 1과 5(0분 컨트롤) 및 4 및 8(30분 컨트롤)에 6 μL의 증정 된 DMSO를 추가합니다. 튜브 2와 6에 6 μL의 테스트 화합물을 추가합니다. 시험 화합물 3 μL과 3 μL의 증정 된 DMSO를 튜브 3 및 7에 추가하십시오.
  2. 세제 없이 충분한 반응 스톡 용액을 준비하여 각각 517 μL의 버퍼, 60 μL의 중수소 산화물과 5 μL의 효소 용액(AGNH 또는 UNH)을 포함하는 5개의 반응을 실행합니다. 사용할 효소 용액의 농도에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.
    1. 2.59 mL의 반응 버퍼 (50 mM 칼륨 인산염, 0.3 M KCl, pH = 6.5)를 15 mL 원추형 튜브에 추가합니다. 원유 관에 300 μL의 중수소 산화물을 추가합니다. 원엽에 25 μL의 효소 용액 (AGNH 또는 UNH)을 추가하십시오.
    2. 원추형 튜브를 2x 부드럽게 뒤집어 섞습니다.
  3. 0.01% v/v Triton X-100 세제로 충분한 반응 스톡 솔루션을 준비하여 완충액 517 μL, 중수소 산화물의 60 μL 및 5 μL의 효소 용액(AGNH 또는 UNH)을 각각 포함하는 5가지 반응을 실행합니다.
    1. 트리톤 X-100 세제 20 mL의 반응 버퍼 (50 mM 칼륨 인산염, 0.3 M KCl, pH = 6.5)를 추가합니다. 세제 용액은 1 일 이내에 사용해야합니다.
    2. 0.01% 트리톤 X-100 세제를 함유한 반응 완충액 2.59 mL를 15 mL 원엽 튜브에 추가합니다. 원유 관에 300 μL의 중수소 산화물을 추가합니다. 원엽에 25 μL의 효소 용액 (AGNH 또는 UNH)을 추가하십시오.
    3. 원추형 튜브를 2x 부드럽게 뒤집어 섞습니다.
  4. 튜브 1-4의 경우, 세제 없이 반응 스톡 용액을 사용하여, 단계 1.3-1.9에 설명된 단계를 따라 각 시험 화합물 농도에 대한 퍼센트 억제를 결정한다.
  5. 튜브 5-8의 경우, 반응 스톡 용액과 0.01% v/v 트리톤 X-100 세제를 사용하여, 단계 1.3-1.9에 설명된 단계를 따라 각 시험 화합물 농도에 대한 퍼센트 억제를 결정합니다.

4. 점프 희석 카운터 스크린 어세이

  1. 반응에 대한 기판 및 테스트 화합물을 준비
    1. 기질(아데노신 또는 5-플루오루리딘)의 재고 용액을 수분 및 10 mM 테스트 화합물을 deuterated DMSO에서 준비합니다. 사용할 기판 용액의 농도에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.
    2. 53.8 μL의 반응 버퍼(50 mM 칼륨 인산염, 0.3 M KCl, pH = 6.5)를 2개의 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브(각각), 1 및 2에 추가합니다. 튜브 1과 2에 5 μL의 효소(AGNH 또는 UNH)를 넣습니다.
    3. 511 μL의 반응 버퍼를 두 개의 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브, 3 및 4 (각각)에 추가합니다. 튜브 3과 4에 60 μL의 중수소 산화물을 추가합니다. 튜브 3과 4에 5 μL의 효소(AGNH 또는 UNH)를 넣습니다.
    4. 튜브 1(30분 제어)에 1.2 μL의 증분 DMSO를 추가합니다. 튜브 2에 1.2 μL의 테스트 화합물을 추가합니다. 튜브 3 (30 분 제어)에 12 μL의 증분 DMSO를 추가합니다. 튜브 4에 12 μL의 시험 화합물을 추가합니다. 30 분 동안 배양하십시오.
  2. 희석 액으로 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브 2개를 준비합니다.
    1. 468 μL의 반응 버퍼를 각각 2개의 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브, 5 및 6에 추가합니다. 각 튜브(5 및 6)에 60 μL의 중수소 산화물을 추가합니다.
  3. 반응에 대한 4 개의 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브를 준비하십시오.
    1. 기질 12 μL(아데노신 또는 5-플루오루리딘)을 각각 4개의 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브, 7-10에 첨가합니다.
  4. 점프 희석을 수행하고 반응을 시작합니다.
    1. 튜브 5에서 튜브 1로 용액 528 μL을 전달합니다. 느리지만 의도적인 방식으로 샘플을 두 번 흡인하고 분배합니다. 튜브 6에서 튜브 2로 용액 528 μL을 전달합니다. 느리지만 의도적인 방식으로 샘플을 두 번 흡인하고 분배합니다.
    2. 시간 0 분, 튜브 1에서 튜브 7에 용액의 588 μL을 전송합니다. 느리지만 의도적인 방식으로 샘플을 2배 흡인하고 분배합니다. 30 s 간격으로, 튜브 2에서 튜브 8, 튜브 3에서 튜브 9, 튜브 44에서 튜브 10으로 용액의 588 μL을 전송합니다. 느리지만 의도적인 방식으로 샘플을 두 번 흡인하고 분배합니다. 30분 기다립니다.
  5. 튜브 7-10의 경우, 단계 1.5-1.9에 설명된 단계를 수행하여 각 시험 화합물 농도에 대한 퍼센트 억제를 결정합니다.

5. 대장균 전체 세포의 화합물 세포

  1. 실험 전날 대장균의 10 mL 하룻밤 배양을 준비한다.
  2. NMR 실험을 위해 대장균 세포를 준비하십시오.
    1. 15,000 x g에서10 분 동안 1 mL aliquots로 세포를 원심 분리합니다.
    2. 상판을 버리고 1 mL의 반응 완충제(50 mM 칼륨 인산염, 0.3 M KCl, pH=6.5)에서 세포의 각 aliquot를 소용돌이에 의해 재중단한다.
  3. 다음 변경 사항과 함께 원하는 분석에 대한 섹션 1 또는 2를 따르십시오.
    1. 반응 스톡 용액에서 280 μL의 완충액을 280 μL의 재부유 된 세포로 대체합니다.
    2. 반응 스톡 용액에서 5 μL의 효소(AGNH 또는 UNH)를 완충액 5 μL로 대체합니다.

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Representative Results

도 2는 1H NMR을 사용하여 AGNH에 대하여 2개의 화합물을 시험한 결과를 다음 섹션 1을 나타낸다. 효소 반응은 각각 8.48 ppm 및 6.09 ppm에서 아데노신 싱글트와 더블음 공진의 실종에 의해 가장 쉽게 관찰및 정량화되고, 30분 대조군에서 관찰된 바와 같이 8.33 ppm에서 아데닌 싱글t 공진의 출현 스펙트럼. 500 μM 화합물 1의 존재에서, 어떤 생성물도 8.33 ppm에서 아데닌 공명의 부족에 의해 입증된 바와 같이 형성되지 않는다. 250 μM 화합물 1의 존재에서, 기판의 약 10%가 생성물로 전환되었다. 대조적으로, 화합물 2의 어느 농도도 30 분 제어 스펙트럼에서 그와 유사한 기질 및 생성물 공명에 의해 입증 된 바와 같이 효소를 억제하지 않습니다. 이 데이터는 화합물 1을 양호한 AGNH 억제제로서 식별한다. 화합물 1 (7.70-8.00 및 8.50-8.60 ppm)과 화합물 2 (7.40-7.80 ppm)에서 발생하는 공진도 관찰됩니다. 도 4, 도6, 도6, 도 10에도시된 반응을 모니터링하기 위해 동일한 기판 및 생성물 공진이 사용된다. 도 3은 19FNMR을 사용하여 UNH에 대하여 2개의 화합물을 시험한 결과를 다음 섹션 1을 나타낸다. 효소 반응은 -165.8 ppm에서 5-플루오로리딘 공진의 실종과 30분 대조군 스펙트럼에서 관찰된 바와 같이 -169.2 ppm에서 5-플루오로라실 공진의 출현에 의해 쉽게 관찰되고 정량화된다. 이 효소의 경우, 화합물 2는 두 농도모두에서 반응을 완전히 억제하는 반면 화합물 1은 아무런 효과가 없다. 이 데이터는 화합물 2를 양호한 UNH 억제제로서 식별한다. 도5, 도 7, 도 9및 도 11에도시된 반응을 모니터링하기 위해 동일한 기판 및 생성물 공진이 사용된다.

도 4는 1H NMR 을 이용한 AGNH 활성을 가진 화합물에 대해 수득된 투여량-응답 NMR 데이터 및 생성된 IC50 곡선을 다음 섹션 2를 나타낸다. NMR 데이터는 중복 평가판 중 하나에 대해서만 표시됩니다. 시험된 화합물(6.90-7.40 ppm)에서 발생하는 공진은 기판 또는 제품 공명을 방해하지 않습니다. IC50 곡선은 두 시험의 데이터를 사용하여 적합하고 12.3 ±5.0 μM의 값을 초래하였다. 이러한 결과는 화합물 농도가 12.5 μM으로 감소될 때까지 기질 신호의 현저한 손실이 관찰되지 않는다는 점에서 NMR 데이터와 일치한다. 도 5는 19FNMR 을 이용한 UNH 활성을 가진 화합물에 대해 수득된 투여량-응답 NMR 데이터 및 생성된 IC50 곡선을 다음 섹션 2를 나타낸다. NMR 데이터는 중복 평가판 중 하나에 대해서만 표시됩니다. IC50 곡선은 두 시험의 데이터를 사용하여 적합하고 16.7 ±10.4 μM의 값을 초래하였다. 이러한 값은 화합물 농도가 12.5 μM으로 감소될 때까지 기질 신호의 현저한 손실이 관찰되지 않는다는 점에서 NMR 데이터와 일치한다.

도 6은 1H NMR 다음 섹션 3을 사용하여 0.01% 트리톤 X-100 세제의 부재 및 존재 시 AGNH에 대하여 2농도에서 화합물을 시험한 결과를 나타낸다. 관찰된 효소 억제가 화합물 응집의 아티팩트가 아님을 나타내는 두 가지 조건을 이용한 기질 및 생성물 신호의 강도에서 최소한의 차이만이 관찰된다. 테스트된 화합물(7.10-7.70 ppm)과 트리톤 X-100(6.90 및 7.40 ppm)에서 발생하는 공진은 기판 또는 제품 공명을 방해하지 않습니다. 도 7은 19FNMR 다음 섹션 3을 사용하여 0.01% 트리톤 X-100 세제의 부재 및 존재 시 UNH에 대하여 2개의 농도에서 화합물을 시험한 결과를 나타낸다. 관찰된 효소 억제가 화합물 응집의 아티팩트가 아님을 나타내는 두 가지 조건을 이용한 기질 및 생성물 신호의 강도에서 최소한의 차이만이 관찰된다.

도 8은 1HNMR 다음 섹션 4를 사용하여 AGNH에 대한 점프 희석 분석에서 화합물을 시험한 결과를 나타낸다. 200 μM 반응에 비해 20 μM 반응에서 기질 신호의 감소된 강도는 억제가 가역적임을 나타낸다. 시험된 화합물은 IC50 값이 21.0 μM이고, 그 공명은 6.90-8.30 ppm에서 관찰된다. 이 예에서, 화합물로부터의 공진은 아데닌 생성물 신호의 공명을 방해하고, 반응 진행은 6.09 ppm에서 아데노신 공명을 사용하여 모니터링하기 쉽다. 도 9는 19FNMR 다음 섹션 4를 사용하여 UNH에 대한 점프 희석 분석에서 화합물을 시험한 결과를 나타낸다. 200 μM 반응에 비해 20 μM 반응에서 -169.2 ppm에서 생성물 신호의 증가된 강도는 억제가 가역적임을 나타낸다. 시험된 화합물은 IC50 값이 16.7 μM입니다.

도 10은 1H NMR을 이용하여 전체 세포에서 세포 전체를 대상으로 한 공술을 수행하는 방법의 유용성을 나타낸다. 아데노신 기판 신호는 전체 세포가 있는 30분 후에 거의 완전히 사라지며, 이는 기판의 가수분해를 나타낸다. 대조적으로, 기질은 세포 성장 매체 상층의 존재에서 30 분 후에 변경되지 않고, 가수 분해 반응이 세포 의존적임을 나타낸다. 6.90-7.15 ppm에서 NH4+ 이온의 강렬한 삼중항 신호를 포함하여 상층 스펙트럼에 많은 배경 신호가 존재하며 전체 셀 스펙트럼에서 더 작은 수준으로 존재합니다. 도 11은 19FNMR을 이용하여 전체 세포에서 검정을 수행하는 방법의 유용성을 나타낸다. 5-플루오로리딘 기질 신호는 전체 세포의 존재 에서 60 분 후에 완전히 사라지며, 기판의 가수 분해를 나타낸다. 대조적으로, 기질은 세포 성장 매체 상층의 존재 에서 60 분 후에 변경되지 않고, 가수 분해 반응이 세포 의존적임을 나타낸다.

Figure 1
그림 1: UNH(위)와 AGNH(아래)에 의해 촉매작용이 반응한다. UNH는 우리딘과 5-플루오로리딘(그림)의 가수분해를 촉매합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 500에서 대표적인 초기 화합물 애약사 μ M 및 250 μ 1H NMR을 사용하여 AGNH에 대한 M. 2개의 화합물에 대한 1H NMR 반응 스펙트럼의 영역은 각각 500 μM 및 250 μM에서, 0 분 및 30 분 제어 스펙트럼과 함께. 0분 제어 스펙트럼은 6.09, 8.38 및 8.48 ppm에서 아데노신 기질 공명을 포함합니다. 30분 제어 스펙트럼은 8.33 ppm의 새로운 아데닌 생성자 공명을 함유하고 있습니다. 시험 스펙트럼은 시험된 화합물에서 발생하는 추가공명을 함유한다. 1개 H 화학적 시프트는 0.0 ppm에서 외부 트리메틸실프로필산으로 참조되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 500에서 대표적인 초기 화합물 애약사 μ M 및 250 μ 19F NMR을 사용하여 UNH에 대한 M. 2개의 화합물에 대한 19FNMR 반응 스펙트럼의 영역, 각각 500 μM 및 250 μM에서, 0 분 및 30 분 제어 스펙트럼과 함께. 0분 제어 스펙트럼은 -165.8 ppm에서 5-플루오우리딘 기질 공명을 함유한다. 30분 제어 스펙트럼은 -169.2 ppm에서 새로운 5-플루오로라실 생성 공진을 포함합니다. 19세 F 화학적 시프트는 -76.7 ppm에서 외부 50 μM 트리플루오로에탄올을 참조했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: 대표적인 투여량-반응 NMR 데이터 및 결과 IC50 곡선은 1H NMR을 사용하여 AGNH 활성을 가진 화합물을 수득하였다. 화합물의 가변 농도에 대한 1H NMR 반응 스펙트럼의 영역 (200-0.20 μM)과 함께 0 분 및 30 분 제어 스펙트럼. 6.90-7.40 ppm의 공진은 시험된 화합물에서 발생합니다. IC50 곡선은 중복으로 실행되는 NMR 데이터 세트의 데이터를 사용하여 적합했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: 대표적인 투여량-반응 NMR 데이터 및 생성된 IC50 곡선은 19F NMR을 사용하여 UNH활성을 가진 화합물을 수득하였다. 화합물의 가변 농도에 대한 19FNMR 반응 스펙트럼의 영역 (200-0.20 μM)과 0 분 및 30 분 제어 스펙트럼. IC50 곡선은 중복으로 실행되는 NMR 데이터 세트의 데이터를 사용하여 적합했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
도 6: 1HNMR을 사용하여 AGNH 활성을 가진 화합물에 대한 대표적인 세제 카운터 스크린 어세이. 100 μM 및 50 μM에서 화합물에 대한 1H NMR 반응 스펙트럼의 영역은 0.01% 트리톤 X-100의 존재 및 부재 에서 0 분 및 30 분 제어 스펙트럼과 함께. 7.10-7.70 ppm및 6.90 및 7.40 ppm에서 공진은 각각 시험된 화합물 및 트리톤 X-100에서 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
도 7: 19F NMR을 사용하여 UNH 활성을 가진 화합물에 대한 대표적인 세제 카운터 스크린 검정. 100 μM 및 50 μM에서 화합물에 대한 19FNMR 반응 스펙트럼의 영역은 0.01% 트리톤 X-100의 존재 및 부재 상태에서 0분 및 30분 대조군 스펙트럼과 함께. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
도 8: 1H NMR을 사용하여 AGNH 활성을 가진 화합물에 대한 대표적인 점프 희석 카운터 스크린 어설션. 200 μM 및 20 μM에서 화합물에 대한 1H NMR 반응 스펙트럼의 영역과 30 분 제어 스펙트럼. 효소는 반응을 개시하기 전에 200 μM 화합물에서 30 분 동안 배양되었고, 20 μM 반응을 반응을 개시하기 직전에 희석하였다. 6.90-8.30 ppm에서 공진은 시험된 화합물에서 발생합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 9
도 9: 19FNMR을 이용한 UNH 활성을 가진 화합물에 대한 대표적인 점프 희석 카운터 스크린 검정. 200 μM 및 20 μM에서 화합물에 대한 19FNMR 반응 스펙트럼의 영역과 30 분 제어 스펙트럼. 효소는 반응을 개시하기 전에 200 μM 화합물에서 30 분 동안 배양되었고, 20 μM 반응을 반응을 개시하기 직전에 희석하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 10
도 10: 1HNMR을 사용하여 전체 세포에서 대표적인 세포를 이용한 세포. 완충제(0, 15, 및 30분) 또는 세포 성장 매체 상판(30분)에서 재중단된 대장균 세포의 280 μL을 함유하는 시료에 대한 1HNMR 반응 스펙트럼의 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 11
도 11: 19FNMR을 사용하여 전체 세포에서 대표적인 검문. 완충액(0, 15, 30, 및 60분) 또는 세포 성장 매체 상판(60분)에서 재중단된 대장균 세포의 280 μL을 함유하는 시료에 대한 19FNMR 반응 스펙트럼의 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

기질 및/또는 제품이 NMR 스펙트럼에서 용해 가능한 신호를 가지고 있는 경우, 설명된 프로토콜은 일반적으로 많은 효소에 적용가능하다. 그러나, 기판의 농도가 그 Km 값에 가깝고 합리적인 기간 내에 NMR 실험에서 검출될 수 있을 만큼 충분히 높다는 것이 중요하다. 기판 농도가 2-3배 이하인 Km 값은 경쟁력, 비경쟁성 및 비경쟁 억제제 4를 검출하는 데 최적입니다. 여기서 입증된 바와 같이 UNH, 기판, Km 값은 최저 15 μM이 적합하다. 극저온 프로브에 대한 NMR 데이터 수집과 결합된 CH3 또는 CF3 신호가 있는 기판을 사용하면 이 임계값을더욱낮출 수 있습니다 15. 그러나 1 μM 이하의 기질 Km 값을 가진 효소는 NMR 실험의 내재된 낮은 감도 때문에 이 방법을 사용하여 연구하기 어려울 가능성이 높습니다. 이러한 상황에서 분광광도법 또는 형광 분광법은 더 적합한 기술입니다.

이러한 방법의 적용에 대한 또 다른 제한은 적합한 담금질 제이다. 여기에 설명된 모든 프로토콜은 HCl의 첨가에 의해 30분 후에 담금질된 반응과 함께 고정 시간 분석이다. AGNH 및 UNH 모두에 대해, HCl이 즉시 반응을 중지하고,주9,10의기간 동안 중지 유지 이전에 결정되었다. 수십 개의 반응이 동시에 실행된 다음 몇 시간 동안 NMR 데이터 수집을 위해 큐에 대기되기 때문에 이는 중요합니다. 또한 기판 또는 제품 신호의 비 효소 분해가 담금질 이후가 아니라 NMR 데이터 수집 이전에 발생하지 않는다는 것을 확립하는 것이 중요합니다. HCl 이외에, 반응을 담금질하는 다른 일반적인 방법은 공지된 나노몰 억제제(16)의 첨가또는, 아데노신 삼인산염을 수반하는 반응의 경우, 킬레이트화제 에틸렌디아미네테트라아세트산(17)을 첨가한다.

NMR 기반 활성 검정은 단편 스크리닝 또는 직교 검정검에 사용될 때부가가치를 제공하여 고처리량 스크리닝 조회수 4를 검증한다. 결합 성 어세이스와는 달리, NMR 기반 활성 성 반응법은 화합물을 실제 억제제로서 확인하거나 확인한다. 활동 성 아세아는 또한 결합 한 asays보다는 훨씬 적은 표적 효소를 사용합니다. 동일한 방법은 가역적, 표적별 활성을 검증하고 관절분석 활동(18)을 배제하기 위해수행된 두 가지 유형의 카운터 스크린에 대해 매우 강력하다. 세제 및 점프 희석 어설션은 각각 콜로이드응집(19) 및 돌이킬 수 없는 억제(20)에 대한 카운터 스크린이다. 이 시험을 통과하는 화합물은 약용 화학 및 구조 유도 억제제 최적화를 위한 출발점이 유효합니다. NMR 기반 활성 분석제는 프로젝트가 나노몰 억제제쪽으로 진행됨에 따라 복합 활성 데이터를 계속 제공할 수 있다.

마지막으로, 전체 세포에서 반응을 모니터링하기 위한 이러한 검법의 유용성은 주목할 만하다21. 세포 내 효소의 억제와 정제 된 효소의 상관 관계 억제는 관찰 된 현상기 효과22의기초가되는 생화학 적 메커니즘의 확실한 증거를 제공 할 것입니다. 여기에 제시 된 두 효소의 경우, 원하는 자형 효과는 생존력의 손실 (항 연성 활성)입니다. 정제된 효소 억제, 세포 내 효소 억제 및 기생충 세포 사멸 사이의 상관관계는 억제기 작용 메커니즘의 증거를 구성할 것이다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

아스트라제네카 단편 라이브러리에서 화합물을 제공한 딘 브라운 박사와 AGNH 및 UNH 효소를 제공한 데이비드 파친 박사에게 감사드립니다. 이 간행물에 보고된 연구는 B. J. S에 상 번호 R15AI128585의 밑에 건강의 국가 학회의 알레르기그리고 감염증의 국가 학회에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.연구 는 또한 Horace G. McDonell 여름 연구 펠로우십에 의해 지원되었다 S. N. M., Landesberg 가족 J. A. G., 교수 개발 보조금 및 아델피 대학에서 B. J. S에 프레드릭 베텔하임 연구 상수여.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AGNH Purified in-house N/A TVAG_213720
UNH Purified in-house N/A TVAG_092730
Adenosine Sigma A9251
5-Fluorouridine Sigma F5130
Dimethyl sulfoxide-D6 Cambridge Isotope Labs DLM-10-100 D, 99.9%
Potassium phosphate monobasic Sigma P0662
Potassium phosphate dibasic Sigma P3786
Potassium chloride Sigma P9541
Deuterium oxide Cambridge Isotope Labs DLM-4-100 D, 99.9%
Hydrochloric acid Fisher Chemical A144212
Triton X-100 Sigma X100
3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP) Sigma 269913 D, 98%
2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2 Sigma 612197 D, 99.5%
Pipette Gilson F123602 PIPETMAN Classic P1000
Pipette Gilson F123601 PIPETMAN Classic P200
Pipette Gilson F123600 PIPETMAN Classic P20
Microfuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
Conical tubes Corning 352099
Microcentrifuge Eppendorf 5418
Vortex mixer Fisher Scientific 02215365
NMR tubes Norell 502-7 Or as appropriate for the NMR
NMR spectrometer Bruker N/A AvanceIII500
Prism software GraphPad N/A Version 5.04

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References

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