Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

NMR-baserede Aktivitetsassays til bestemmelse af sammensatte hæmning, IC50 -værdier, artifaktuel aktivitet og helcelle aktivitet af Nukleosid-Ribohydrolaser

Published: June 30, 2019 doi: 10.3791/59928
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

Summary

Der er udviklet NMR-baserede aktivitets analyser for at identificere og karakterisere inhibitorer af to nukleosid-ribohydrolase-enzymer. Protokoller er fastsat for indledende sammensatte analyser på 500 μm og 250 μm, dosis-respons analyser til bestemmelse af IC50 værdier, vaskemiddel tæller skærm analyser, hoppe-fortynding Counter skærm analyser, og analyser i E. coli hele celler.

Abstract

NMR spectroskopi anvendes ofte til identifikation og karakterisering af enzyminhibitorer i lægemiddel opdagelse, især i forbindelse med fragment screening. NMR-baserede aktivitet analyser er velegnet til at arbejde på de højere koncentrationer af test forbindelser, der kræves for at påvise disse svagere hæmmere. Det dynamiske område og den kemiske Skift dispersion i et NMR-eksperiment kan nemt løse resonanser fra substrat-, produkt-og test forbindelser. Dette står i kontrast til spektrofotometriske analyser, hvor der ofte opstår problemer med udlæsning af interferens fra forbindelser med overlappende UV-Vis-absorptions profiler. Desuden, da de mangler reporter enzymer, de enkelt-enzym NMR-analyser er ikke tilbøjelige til at koblet-assay falske positiver. Denne attribut gør dem nyttige som ortogononale analyser, der supplerer traditionelle højt gennemløb screening analyser og stationære triage analyser. Detaljerede protokoller er fastsat for indledende sammensatte analyser på 500 μm og 250 μm, dosis-respons analyser til bestemmelse af IC50 værdier, vaskemiddel tæller skærm analyser, hoppe-fortynding Counter skærm analyser, og analyser i E. coli hele celler. Metoderne påvises ved hjælp af to nukleosid-ribohydrolase-enzymer. Brugen af 1H NMR er vist for det purine-specifikke enzym, mens 19F NMR er vist for det pyrimidinspecifikke enzym. Protokollerne er generelt gældende for ethvert enzym, hvor substrat og produkt resonanser kan observeres og skelnes fra NMR spectroscopy. For at være den mest nyttige i forbindelse med narkotika opdagelse, bør den endelige koncentration af substrat ikke være mere end 2-3x sin Km værdi. Valget af NMR eksperiment afhænger af enzymreaktionen og substrater til rådighed samt tilgængelige NMR Instrumentation.

Introduction

Nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopi er veletableret til karakterisering og overvågning af enzymreaktioner1,2. Forskelle i kemiske forskydninger og koblings mønstre bruges til at skelne mellem substrat-og produkt resonanser, og relative resonans intensiteter bruges til at kvantificere procentdelen af reaktionen. Både forbruget af substrat og skabelsen af produktet er direkte observeret i NMR spektrum. Dette står i kontrast til spektrofotomometri eller fluorescens spektroskopi, hvor reaktionstiden indikeres ved en ændring i absorbans, der kan tilskrives visse kemiske arter, der forbruges eller dannes. Ligesom med de andre metoder, NMR kan bruges til at studere enzymreaktioner som en funktion af temperatur, pH, eller andre løsning betingelser, og virkningerne af inhibitorer kan bestemmes.

For nylig er der påvist NMR-baserede enzym aktivitetsassays for fragment screening3,4. NMR-baserede analyser er velegnet til at arbejde ved de højere koncentrationer af test forbindelser (ofte så høje som 1 mm), der kræves for at detektere disse svagere inhibitorer. Det dynamiske område og den kemiske Skift dispersion i NMR-eksperimentet kan nemt løse resonanser fra substrat-, produkt-og test forbindelser. Dette kan sammenlignes positivt med spektrofotometriske analyser, hvor der ofte opstår problemer med udlæsning af interferens fra forbindelser med overlappende UV-Vis-absorptions profiler. Desuden, da de mangler reporter enzymer, de enkelt-enzym NMR-analyser er ikke tilbøjelige til at koblet-assay falske positiver. Denne fordel gør dem nyttige som ortogononale analyser, der supplerer traditionelle højt gennemløb screening analyser og stationære triage analyser5.

I vores forskningslaboratorium anvendes NMR-baserede aktivitets analyser til at identificere og evaluere inhibitorer af Trichomonas vaginalis nukleosid-ribohydrolaser. Den T. vaginalis parasit forårsager den mest udbredte ikke-viral seksuelt overførte sygdom6. Stigende resistens over for eksisterende terapier7 driver behovet for nye, mekanisme baserede behandlinger, med essentielle nukleosid bjærgnings pathway enzymer, der repræsenterer primære mål8. Der er udviklet NMR-baserede aktivitets analyser for både pyrimidin-og purin-specifikke enzymer, uridine nucleosid ribohydrolase (unh)9og adenosin/guanosin foretrækker nukleosid ribohydrolase (agnh)10. De reaktioner, der katalyseres af disse to enzymer, er vist i figur 1. NMR-analyser bruges til at screene fragment biblioteker for kemiske udgangspunkter, bestemme IC50 -værdier og frasortere aggregerings baserede eller kovalente bindings inhibitorer11. De samme analyser er også ved at blive oversat til at vurdere enzymaktivitet i hele cellerne12.

Detaljerede protokoller er fastsat for indledende sammensatte analyser på 500 μm og 250 μm, dosis-respons analyser til bestemmelse af IC50 værdier, vaskemiddel tæller skærm analyser, hoppe-fortynding Counter skærm analyser, og analyser i E. coli hele celler. Protokollerne er generelt gældende for ethvert enzym, hvor substrat og produkt resonanser kan observeres og skelnes fra NMR spectroscopy. Tre antagelser er blevet gjort for enkelhed. For det første er substratet ikke specificeret. For NMR-baserede aktivitet analyser at være nyttig, den endelige koncentration af substrat bør ikke være mere end 2-3x Km værdi4. I de viste eksempler er de endelige koncentrationer af adenosin og 5-fluorouridin 100 μM (km = 54 μM) og 50 μm (km = 15 μm) hhv. I protokollerne svarer opnåelsen af disse koncentrationer til 12 μL 5 mM adenosin eller 12 μL 2,5 mM 5-fluorouridin.

For det andet blev den mængde enzym, der er fastsat i protokollerne, 5 μL, valgt til at svare til den mængde, der kræves for at resultere i ca. 75% omdannelse af substrat til produkt i 30 min. Denne mængde repræsenterer typisk en stor fortynding fra en renset enzym bestand, og fortyndingen skal bestemmes på forhånd for hvert enzym. Rensede AGNH-og UNH-enzym stamopløsninger opbevares ved-80 °C i aliquoter, der giver nok enzym til flere tusinde reaktioner. Fortyndingsfaktoren skal derfor ideelt set kun bestemmes eller valideres hvert par måneder. For det tredje er den specifikke 1D NMR eksperiment ikke specificeret. I de repræsentative resultater, 1h NMR er vist for agnh10 og 19F NMR er vist for unh9, med NMR eksperiment beskrevet i de tilsvarende referencer. Valget af NMR eksperiment afhænger af enzymreaktionen og substrater til rådighed samt tilgængelige NMR Instrumentation. Endelig skal det påpeges, at den beskrevne eksperimentelle fremgangsmåde ikke overholder de strenge krav til kvantitative NMR (qnmr)13,14. I protokollen, en procent reaktion bestemmes ved hjælp af de relative ændringer i intensiteten af samme resonans i hvert spektrum, snarere end ved at bestemme absolutte koncentrationer. Denne fremgangsmåde eliminerer behovet for dataindsamling og behandling ændringer samt interne eller eksterne standarder, som er nødvendige for qNMR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. indledende test sammensatte analyser ved 500 μm og 250 μm

  1. Forbered substrat og teststof til reaktioner.
    1. Forbered stamopløsninger af substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) i vand og 50 mM test forbindelse i deutererede dimethylsulfoxid (DMSO). Se introduktions afsnittet for koncentrationer af substratopløsning, der skal anvendes.
    2. Der tilsættes 12 μL substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) til hver af de fire 1,5 mL microfuge Tubes, 1 – 4.
    3. Tilsæt 6 μL deutereret DMSO til rør 1 (0 min kontrol) og 4 (30 min kontrol). Der tilsættes 6 μL teststof til slange 2. Der tilsættes 3 μL teststof og 3 μL deutereret DMSO til slange 3.
  2. Forbered en tilstrækkelig reaktions stamopløsning.
    Bemærk: stamopløsningen er for fem reaktioner, der hver indeholder 517 μL buffer, 60 μL deuterium oxid og 5 μL enzym opløsning (AGNH eller UNH). Se introduktions afsnittet for koncentrationer af enzym opløsning, der skal anvendes.
    1. Der tilsættes 2,59 mL reaktionsbuffer (50 mM kaliumphosphat, 0,3 M KCl, pH 6,5) til et 15 mL konisk rør. Der tilsættes 300 μL deuterium oxid til det koniske rør. Der tilsættes 25 μL enzym opløsning (AGNH eller UNH) til det koniske.
    2. Vend forsigtigt det koniske rør to gange for at blande.
  3. Samtidig initiere og slukke 0 min kontrol reaktion. Overfør 582 μL af reaktions stamopløsningen til et rent microfuge-rør. Der tilsættes 10 μL 1,5 M HCl til dette mikrofuge rør. Overfør den kombinerede 592 μL til mikrofuge røret 1. Prøven Aspirér og dispenseres to gange på en langsom, men bevidst måde.
  4. Start og kør de resterende tre reaktioner i forskudt mode. Til tiden 0 min., Overfør 582 μL af reaktions stamopløsningen til mikrofuge røret 2. Prøven Aspirér og dispenseres to gange på en langsom, men bevidst måde. Gentag med 30 s intervaller for mikrofuge slanger 3 og 4. Vent 30 min.
  5. Sluk for reaktionerne. På tidspunktet 30 min, tilsættes 10 μL af 1,5 M HCl til mikrofuge 2. Gentag med 30 s intervaller for mikrofuge slanger 3 og 4. Overfør 600 μL opløsning fra hver mikrofuge til NMR-rør.
  6. Erhverve en 1D NMR spektrum på hver prøve. Behandl dataene for at sikre korrekt indfasning og flade basislinjer.
  7. Beregn den procentvise omdannelse af substrat for kontrolspektre.
    1. Overlay spektrene for 0 min og 30 min kontrol. Skala substrat signalet i 0 min kontrol for at matche 30 min kontrol. Bemærk denne procentdel.
    2. Beregn den procentvise omregning som (100-procent bestemt i trin 1.7.1).
  8. Beregn den procentvise omdannelse af substrat for reaktioner, der indeholder teststoffet.
    1. Overlay spektre for 0 min kontrol og første reaktion, der indeholder 500 μM test forbindelse. Skala substrat signalet i 0 min kontrol til at matche spektret med teststof. Bemærk denne procentdel. Beregn procent omregning som (100 – procent bestemt).
    2. Gentag for den anden reaktion, der indeholder 250 μM-test forbindelsen.
  9. Beregn procent reaktionen og procent hæmning for hver test sammensatte koncentration.
    1. Procent reaktionen beregnes som (1.8.1/1.7.2) x 100.
    2. Beregn den procentuelle hæmning som (100 – procent bestemt i trin 1.9.1).

2. bestemmelse af IC50 -værdier

  1. Forbered substrat og teststof til reaktioner.
    1. Forbered stamopløsninger af substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) i vand og 10 mm teststof i deuterede DMSO. Se introduktions afsnittet for koncentrationer af substratopløsning, der skal anvendes.
  2. Forbered serielle fortyndinger af 10 mm test forbindelse (i deuterede DMSO).
    1. Tilsæt 36 μL deutereret DMSO til fem 1,5 mL microfuge Tubes, 1 – 5.
    2. Tilsæt 12 μL 10 mM test forbindelse til slange 1 og Tap let for at blande. Test forbindelsen er nu 2,5 mM.
    3. Der overføres 12 μL fra tube 1 til slange 2, og der trykkes let for at blande. Test forbindelsen er nu 0,63 mM. Overfør 12 μL fra slange 2 til slange 3 og Tap let for at blande. Test forbindelsen er nu 0,16 mM. Overfør 12 μL fra røret 3 til røret 4 og Tap let for at blande. Test forbindelsen er nu 0,04 mM. Overfør 12 μL fra røret 4 til røret 5 og Tap let for at blande. Test forbindelsen er nu 0,01 mM.
  3. Forbered 14 1,5 mL mikrofuge slanger til reaktioner.
    1. Der tilsættes 12 μL substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) til hver af 14 1,5 mL mikrofuge-rør, 1-14.
    2. Der tilsættes 12 μL deutereret DMSO til rør 1 (0 min kontrol) og 14 (30 minutters kontrol).
    3. Der tilsættes 12 μL 10 mM test forbindelse til rør 2 og 3. Der tilsættes 12 μL 2,5 mM test forbindelse til rør 4 og 5. Der tilsættes 12 μL 0,63 mM test forbindelse til rør 6 og 7. Der tilsættes 12 μL 0,16 mM test forbindelse til rør 8 og 9. Der tilsættes 12 μL 0,04 mM test forbindelse til rør 10 og 11. Der tilsættes 12 μL 0,01 mM test forbindelse til rørene 12 og 13.
  4. Forbered en tilstrækkelig reaktions stamopløsning til at køre 15 reaktioner, der indeholder 511 μL buffer, 60 μL deuterium oxid og 5 μL enzym opløsning (AGNH eller UNH) hver. Se introduktions afsnittet for koncentrationer af enzym opløsning, der skal anvendes.
    1. Der tilsættes 7,67 mL reaktionsbuffer (50 mM kaliumphosphat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) til et 15 mL konisk rør. Der tilsættes 900 μL deuterium oxid til det koniske rør. Der tilsættes 75 μL enzym opløsning (AGNH eller UNH) til det koniske.
    2. Vend forsigtigt det koniske rør 2x for at blande.
  5. Følg trinene beskrevet i trin 1.3 – 1.9 til (ved hjælp af 576 μL reaktions stamopløsning) for at bestemme procent reaktionen for hver test sammensatte koncentration.
  6. Beregn IC50 -værdi ved hjælp af GraphPad prisme.
    1. Opret en datatabel, der korrelaterer loggen over reaktions test sammensatte koncentrationer (200 μM, 50 μM, 12,5 μM, 3,13 μM, 0,78 μM, 0,20 μM) med procent reaktion (to værdier hver).
    2. Brug en ikke-lineær kurve, der passer til at bestemme IC50 -værdien og standardfejlen.

3. test af vaskemiddel tæller skærm ved 100 μM og 50 μM

  1. Forbered substrat og teststof til reaktioner.
    1. Forbered stamopløsninger af substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) i vand og 10 mm teststof i deuterede DMSO. Se introduktions afsnittet for koncentrationer af substratopløsning, der skal anvendes.
    2. Tilsæt 12 μL substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) til hver af de otte 1,5 mL microfuge Tubes, 1 – 8.
    3. Der tilsættes 6 μL deutereret DMSO til rør 1 og 5 (0 min. kontrol) og 4 og 8 (30 min. kontrol). Der tilsættes 6 μL teststof til rør 2 og 6. Der tilsættes 3 μL teststof og 3 μL deutereret DMSO til rør 3 og 7.
  2. Der tilberedes en tilstrækkelig reaktions stamopløsning uden rengøringsmiddel til at køre fem reaktioner, der indeholder 517 μL buffer, 60 μL deuterium oxid og 5 μL enzym opløsning (AGNH eller UNH) hver. Se introduktions afsnittet for koncentrationer af enzym opløsning, der skal anvendes.
    1. Der tilsættes 2,59 mL reaktionsbuffer (50 mM kaliumphosphat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) til et 15 mL konisk rør. Der tilsættes 300 μL deuterium oxid til det koniske rør. Der tilsættes 25 μL enzym opløsning (AGNH eller UNH) til det koniske.
    2. Vend forsigtigt det koniske rør 2x for at blande.
  3. Forbered en tilstrækkelig reaktions stamopløsning med 0,01% v/v Triton X-100 vaskemiddel til at køre fem reaktioner, der indeholder 517 μL buffer, 60 μL deuterium oxid og 5 μL enzym opløsning (AGNH eller UNH) hver.
    1. Der tilsættes 2 μL Triton X-100 vaskemiddel til 20 mL reaktionsbuffer (50 mM kaliumphosphat, 0,3 M KCl, pH = 6,5). Rengøringsopløsninger skal anvendes inden for 1 dag.
    2. Der tilsættes 2,59 mL reaktionsbuffer indeholdende 0,01% Triton X-100 vaskemiddel til et 15 mL konisk rør. Der tilsættes 300 μL deuterium oxid til det koniske rør. Der tilsættes 25 μL enzym opløsning (AGNH eller UNH) til det koniske.
    3. Vend forsigtigt det koniske rør 2x for at blande.
  4. For rør 1 – 4 skal du ved hjælp af reaktions stamopløsningen uden rengøringsmiddel følge trinene i trin 1.3 – 1.9 for at bestemme procent hæmningen for hver test sammensatte koncentration.
  5. For rør 5 – 8, ved hjælp af reaktionen stamopløsning med 0,01% v/v Triton X-100 vaskemiddel, skal du følge trinene i trin 1.3 – 1.9 for at bestemme procent hæmning for hver test sammensatte koncentration.

4. visning af hop-fortyndings tæller skærm

  1. Forbered substrat og test forbindelser til reaktioner
    1. Forbered stamopløsninger af substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) i vand og 10 mm teststof i deuterede DMSO. Se introduktions afsnittet for koncentrationer af substratopløsning, der skal anvendes.
    2. Der tilsættes 53,8 μL reaktionsbuffer (50 mM kaliumphosphat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) til to 1,5 mL microfuge-rør (hver), 1 og 2. Der tilsættes 5 μL enzym (AGNH eller UNH) til rør 1 og 2.
    3. Der tilsættes 511 μL reaktionsbuffer til to 1,5 mL mikrofuge rør, 3 og 4 (hver). Der tilsættes 60 μL deuterium oxid til rør 3 og 4. Der tilsættes 5 μL enzym (AGNH eller UNH) til rør 3 og 4.
    4. Der tilsættes 1,2 μL deutereret DMSO til tube 1 (30 minutters kontrol). Der tilsættes 1,2 μL teststof til slange 2. Der tilsættes 12 μL deutereret DMSO til slange 3 (30 minutters kontrol). Der tilsættes 12 μL teststof til slange 4. Inkubeter i 30 min.
  2. Der tilberedes to 1,5 mL mikrofuge rør med fortyndings opløsning.
    1. Der tilsættes 468 μL reaktionsbuffer til hver af de to 1,5 mL mikrofuge rør, 5 og 6. Der tilsættes 60 μL deuterium oxid til hvert rør (5 og 6).
  3. Forbered fire 1,5 mL mikrofuge rør til reaktionerne.
    1. Tilsæt 12 μL substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) til hver af fire 1,5 mL microfuge Tubes, 7 – 10.
  4. Udfør hop-fortyndinger og initiere reaktionerne.
    1. Overfør 528 μL opløsning fra slange 5 til slange 1. Prøven Aspirér og dispenseres to gange på en langsom, men bevidst måde. Overfør 528 μL opløsning fra slange 6 til slange 2. Prøven Aspirér og dispenseres to gange på en langsom, men bevidst måde.
    2. Til tiden 0 min., Overfør 588 μL opløsning fra slange 1 til slange 7. Aspirér og Udvis prøven 2x på en langsom, men bevidst måde. Ved 30 s intervaller overføres 588 μL af opløsningen fra røret 2 til røret 8, røret 3 til røret 9 og røret 4 til røret 10. Prøven Aspirér og dispenseres to gange på en langsom, men bevidst måde. Vent 30 min.
  5. For rør 7-10, Følg trinene beskrevet i trin 1.5-1.9 at bestemme procent hæmning for hver test sammensatte koncentration.

5. sammensatte analyser i E. coli hele celler

  1. Forbered 10 mL natten kultur af E. coli på dagen før eksperimenter.
  2. Forbered E. coli -celler til NMR-eksperimenter.
    1. Cellerne centrifugeres i 1 mL aliquoter i 10 minutter ved 15.000 x g.
    2. Supernatanten kasseres, og hver alikvot celle genindstilles i 1 mL reaktionsbuffer (50 mM kaliumphosphat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) ved vortexing.
  3. Følg afsnit 1 eller 2 for den ønskede analyse med følgende ændringer:
    1. Udskift 280 μL buffer i reaktions stamopløsningen med 280 μL resuspenderede celler.
    2. Udskift 5 μL enzym (AGNH eller UNH) i reaktions stamopløsningen med 5 μL buffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 viser resultaterne for afprøvning af to forbindelser mod agnh ved hjælp af 1H NMR efter punkt 1. Enzymet reaktion er lettest observeret og kvantificeret ved forsvinden af adenosin singlet og tvivlet resonanser på 8,48 ppm og 6,09 ppm, henholdsvis, og udseendet af en adenin singlet resonans ved 8,33 ppm som observeret i 30 min kontrol Spektrum. Ved tilstedeværelse af 500 μM sammensatte 1 dannes der ikke noget produkt, som det fremgår af manglen på en adenin resonans ved 8,33 ppm. Ved tilstedeværelse af 250 μM sammensatte 1 er ca. 10% af substratet blevet konverteret til produkt. I modsætning hertil hæmmer ingen koncentration af sammensatte 2 enzymet, som det fremgår af substratet og produkt resonanser, der ligner dem i 30 minutters kontrol spektrum. Disse data identificerer sammensatte 1 som en god AGNH-hæmmer. Bemærk, at der også observeres resonanser som følge af sammensatte 1 (7.70-8.00 og 8,50-8.60 ppm) og sammensatte 2 (7.40-7.80 ppm). De samme substrat-og produkt resonanser anvendes til at overvåge Reaktionerne vist i figur 4, figur 6, figur 8og figur 10. Figur 3 viser resultaterne for afprøvning af to forbindelser mod unh ved hjælp af 19F NMR efter afsnit 1. Enzymreaktionen er let observeret og kvantificeret ved forsvinden af 5-fluorouridin resonans ved-165,8 ppm og udseendet af en 5-fluorouracil resonans ved-169,2 ppm som observeret i 30 min kontrol spektrum. For dette enzymhæmmer sammensatte 2 fuldstændigt reaktionen ved begge koncentrationer, hvorimod sammensatte 1 ikke har nogen effekt. Disse data identificerer sammensatte 2 som en god UNH-hæmmer. Det samme substrat og produkt resonanser anvendes til at overvåge Reaktionerne vist i figur 5, figur 7, figur 9, og Figur 11.

Figur 4 viser dosis-respons NMR data og resulterende IC50 kurve opnået for en forbindelse med agnh aktivitet ved hjælp af 1H NMR efter punkt 2. NMR-data vises kun for én af dublet forsøgene. Bemærk, at resonanser som følge af den testede forbindelse (6.90-7.40 ppm) ikke forstyrrer substratet eller produktets resonans. IC50 -kurven var egnet ved hjælp af data fra begge forsøg og resulterede i en værdi på 12,3 ± 5,0 μM. Dette resultat er i overensstemmelse med NMR-data, idet der ikke observeres signifikant tab af substrat signal, før den sammensatte koncentration reduceres til 12,5 μM. Figur 5 viser dosis-respons NMR data og resulterende IC50 kurve opnået for en forbindelse med unh aktivitet ved hjælp af 19F NMR efter punkt 2. NMR-data vises kun for én af dublet forsøgene. IC50 -kurven var egnet ved hjælp af data fra begge forsøg og resulterede i en værdi på 16,7 ± 10,4 μM. Denne værdi er i overensstemmelse med NMR-data, idet der ikke observeres signifikant tab af substrat signal, før den sammensatte koncentration reduceres til 12,5 μM.

Figur 6 viser resultaterne for afprøvning af en forbindelse i to koncentrationer mod agnh i fravær af og tilstedeværelse af 0,01% Triton X-100 rengøringsmiddel ved hjælp af 1H NMR efter punkt 3. Der observeres kun minimale forskelle i intensiteten af substratet og produkt signalerne ved hjælp af de to betingelser, hvilket indikerer, at den observerede enzym hæmning ikke er en artefakt af sammensat aggregering. Bemærk, at resonanser som følge af den testede forbindelse (7.10-7.70 ppm) og Triton X-100 (6,90 og 7,40 ppm) ikke forstyrrer substratet eller produktets resonans. Figur 7 viser resultaterne for afprøvning af en forbindelse i to koncentrationer mod unh i fravær og tilstedeværelse af 0,01% Triton X-100 vaskemiddel med 19F NMR efter punkt 3. Der observeres kun minimale forskelle i intensiteten af substratet og produkt signalerne ved hjælp af de to betingelser, hvilket indikerer, at den observerede enzym hæmning ikke er en artefakt af sammensat aggregering.

Figur 8 viser resultaterne for afprøvning af en forbindelse i springet-fortynding analyse mod agnh ved hjælp af 1H NMR efter punkt 4. Den reducerede intensitet af substrat signalet i 20 μM-reaktionen sammenlignet med 200 μM-reaktionen indikerer, at hæmningen er reversibel. Den testede forbindelse har en IC50 -værdi på 21,0 μM, og dens resonanser observeres ved 6.90-8.30 ppm. I dette eksempel, resonanser fra sammensat forstyrre dem af adenin produktsignal, og reaktion fremskridt er lettere at overvåge ved hjælp af adenosin resonans på 6,09 ppm. Figur 9 viser resultaterne for afprøvning af en forbindelse i springet-fortynding analyse mod unh ved hjælp af 19F NMR efter punkt 4. Den øgede intensitet af produkt signalet ved-169,2 ppm i 20 μM-reaktionen sammenlignet med 200 μM-reaktionen indikerer, at hæmningen er reversibel. Den testede forbindelse har en IC50 -værdi på 16,7 μM.

Figur 10 viser nytten af metoden til udførelse af analyser i hele celler ved hjælp af 1H NMR efter afsnit 5. Adenosin substrat signaler er næsten helt forsvundet efter 30 min i tilstedeværelsen af hele celler, hvilket indikerer hydrolyse af substratet. Derimod forbliver substratet uændret efter 30 minutter ved tilstedeværelse af celle vækstmediesupernatant, hvilket indikerer, at hydrolyse reaktionen er celle afhængig. Bemærk tilstedeværelsen af mange baggrunds signaler i supernatanten spektrene, herunder intense triplet signaler fra NH4+ ioner på 6.90-7.15 ppm, som også er til stede i mindre grad i hele celle spektrene. Figur 11 viser nytten af metoden til udførelse af analyser i hele celler ved hjælp af 19F NMR efter afsnit 5. Det 5-fluorouridin substrat signal er helt forsvundet efter 60 min ved tilstedeværelse af hele celler, hvilket indikerer hydrolyse af substratet. Derimod forbliver substratet uændret efter 60 minutter ved tilstedeværelse af celle vækstmediesupernatant, hvilket indikerer, at hydrolyse reaktionen er celle afhængig.

Figure 1
Figur 1: reaktioner katalyseret af UNH (top) og AGNH (nederst). Bemærk, at UNH vil katalysere hydrolyse af både uridine og 5-fluorouridin (vist). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative indledende sammensatte analyser på 500 μ M og 250 μ M mod AGNH ved hjælp af 1H NMR. Regioner af 1H NMR reaktions spektre for to forbindelser, hver på 500 μm og 250 μm, sammen med 0 min og 30 min kontrol spektre. 0 min kontrol spektrum indeholder adenosin substrat resonanser ved 6,09, 8,38, og 8,48 ppm. 30 min kontrol spektrum indeholder en ny adenin produkt resonans ved 8,33 ppm. Test spektre indeholder yderligere resonanser, der hidrører fra den testede forbindelse. 1 af H kemiske Skift blev refereret til ekstern trimethylsilylpropionsyre ved 0,0 ppm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentative indledende sammensatte analyser på 500 μ M og 250 μ M mod UNH ved hjælp af 19F NMR. Regioner af de 19F NMR reaktions spektre for to forbindelser, hver på 500 μm og 250 μm, sammen med 0 min og 30 min kontrol spektre. 0 min kontrol spektrum indeholder en 5-fluorouridin substrat resonans ved-165,8 ppm. 30 min kontrol spektrum indeholder en ny 5-fluorouracil produkt resonans ved-169,2 ppm. 19 ud af F kemiske Skift blev refereret til ekstern 50 μM trifluoroethanol ved-76,7 ppm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: repræsentativt dosis-respons NMR data og resulterende IC50 kurve opnået for et stof med agnh aktivitet ved hjælp af 1H NMR. Regioner af 1H NMR reaktions spektre for variable koncentrationer af en forbindelse (200-0,20 μM) sammen med 0 min og 30 min kontrol spektre. Resonanser fra 6.90-7.40 ppm opstår fra den testede forbindelse. IC50 -kurven passede ved hjælp af data fra NMR data-sæt, der køres i to eksemplarer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: repræsentativt dosis-respons NMR data og resulterende IC50 kurve opnået for en forbindelse med unh aktivitet ved hjælp af 19F NMR. Regioner af de 19F NMR reaktions spektre for variable koncentrationer af en forbindelse (200-0,20 μM) sammen med 0 min og 30 min kontrol spektre. IC50 -kurven passede ved hjælp af data fra NMR data-sæt, der køres i to eksemplarer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: repræsentativ vaskemiddel skærm analyser for et stof med agnh aktivitet ved hjælp af 1H NMR. Regioner af 1H NMR reaktions spektre for en forbindelse ved 100 μM og 50 μm, sammen med 0 min og 30 min kontrol spektre, ved tilstedeværelse og fravær af 0,01% Triton X-100. Resonanser på 7.10-7.70 ppm og 6,90 og 7,40 ppm stammer fra henholdsvis den testede forbindelse og Triton X-100. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: repræsentativ vaskemiddel skærm analyser for et stof med unh aktivitet ved hjælp af 19F NMR. Regioner af de 19F NMR reaktions spektre for en forbindelse ved 100 μM og 50 μm sammen med 0 min og 30 min kontrol spektre, ved tilstedeværelse og fravær af 0,01% Triton X-100. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: repræsentative skærm analyser af hoppe-fortyndinger til et stof med AGNH-aktivitet ved hjælp af 1H NMR. Regioner af 1H NMR reaktions spektre for en forbindelse ved 200 μM og 20 μm sammen med 30 min kontrol spektre. Enzymet blev inkueret i 30 min ved 200 μM-sammensatte før starten af reaktionerne, og 20 μM-reaktionen blev fortyndet umiddelbart før initiering af reaktionen. Resonanser ved 6.90-8.30 ppm opstår fra den testede forbindelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: repræsentativt jump-fortynding Counter skærm analyser for en forbindelse med unh aktivitet ved hjælp af 19F NMR. Regioner af de 19F NMR reaktions spektre for en forbindelse ved 200 μM og 20 μm, sammen med 30 min kontrol spektre. Enzymet blev inkueret i 30 min ved 200 μM-sammensatte før starten af reaktionerne, og 20 μM-reaktionen blev fortyndet umiddelbart før initiering af reaktionen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: repræsentative analyser i hele celler ved hjælp af 1H NMR. Regioner af 1H NMR reaktions spektre for prøver indeholdende enten 280 μl E. coli -celler resuspenderet i buffer (0, 15 og 30 min) eller cellevækst medier supernatanten (30 min). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11: repræsentative analyser i hele celler ved hjælp af 19F NMR. Regioner af de 19F NMR reaktions spektre for prøver indeholdende enten 280 μl E. coli -celler resuspenderet i buffer (0, 15, 30, og 60 min) eller cellevækst medier supernatanten (60 min). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De beskrevne protokoller gælder generelt for mange enzymer, forudsat at substrater og/eller produkter har afvikles signaler i NMR-spektret. Men det er afgørende, at koncentrationen af substrat er tæt på sin Km værdi og høj nok til at blive opdaget i en NMR eksperiment inden for en rimelig tidsramme. En substratkoncentration, der ikke er højere end 2-3x Km -værdien, er optimal til påvisning af konkurrencedygtige, ikke-konkurrencedygtige og ukompetitive inhibitorer4. Som påvist her for UNH, substrat, Km værdier så lavt som 15 μM er egnede. Brugen af substrater med CH3 eller CF3 signals, kombineret med NMR dataindsamling på kryogene sonder, kan sænke denne tærskel endnu yderligere15. Enzymer, der har substrat Km -værdier under 1 μM, er dog sandsynligvis svære at studere ved hjælp af denne metode på grund af NMR eksperimentets iboende lave følsomhed. I disse situationer er spektrofotomometri eller fluorescens spektroskopi mere velegnede teknikker.

En anden begrænsning til anvendelsen af disse metoder er en passende dæmper agent. Alle de protokoller, der er beskrevet her, er tidsbegrænsede assays, og reaktionen dæmpede efter 30 minutter ved tilsætning af HCl. For både agnh og unh var det tidligere blevet fastslået, at HCL straks stoppede reaktionen, og holdt det stoppet i perioder af uge9,10. Dette er vigtigt, da snesevis af reaktioner ofte kører samtidigt og derefter i kø til NMR dataindsamling over en periode på flere timer. Det er også vigtigt at fastslå, at ikke-Enzymatisk nedbrydning af substratet eller produkt signalerne ikke forekommer efter slukning, men før NMR-dataindsamlingen. Ud over HCl, andre almindelige måder at slukke reaktioner er ved tilsætning af en kendt nanomolær inhibitor16 eller, i tilfælde af reaktioner, der involverer adenosin trifosfat, tilsætning af chelaterende stof ethylenediaminetetraeddikesyre17.

NMR-baserede aktivitets analyser giver merværdi, når de anvendes til fragment screening eller ortogonale analyser for at validere High-gennemløb screening hits4. I modsætning til bindende analyser identificerer eller bekræfter NMR-baserede aktivitets analyser forbindelser som faktiske inhibitorer. Aktiviteten analyser også bruge langt mindre målenzym end gøre bindende analyser. De samme metoder er utroligt robuste for to typer af Counter skærme udført for at validere reversibel, målspecifik aktivitet og udelukke artifaktuel assay aktivitet18. Opvaskemiddel og hop-fortynding analyser er kontra skærme til kolloid aggregering19 og irreversibel hæmning20, hhv. Forbindelser, der passerer disse tests er valideret udgangspunkter for medicinsk kemi og struktur-styrede inhibitor optimering. De NMR-baserede aktivitetsassays kan fortsætte med at levere sammensatte aktivitetsdata, efterhånden som projektet skrider frem mod nanomolarhæmmere.

Endelig, nytten af disse analyser for overvågning reaktioner i hele celler er bemærkelsesværdigt21. Korrelation hæmning af det rensede enzym med hæmning af in-celle enzym ville give endegyldigt bevis for den biokemiske mekanisme, der ligger til grund for den observerede fænotypiske effekt22. For de to enzymer, der præsenteres her, er den ønskede fænotypiske virkning tab af levedygtighed (antitrichomonal aktivitet). En korrelation mellem renset enzym hæmning, in-celle enzym hæmning og parasithæcelledød ville udgøre bevis for inhibitor virkningsmekanismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Dean Brown for at levere forbindelser fra AstraZenecas fragment bibliotek og Dr. David Parkin for at levere AGNH-og UNH-enzymerne. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of allergi og smitsomme sygdomme af de nationale institutter for sundhed under Award nummer R15AI128585 til B. J. S. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra de nationale institutter for sundhed. Research blev også støttet af en Horace G. McDonell Summer Research Fellowship tildelt S. N. M., en Landesberg familie Stipendium tildelt til J. A. G. og Fakultets Udviklingsstipendier og Frederick Bettelheim Research Award fra Adelphi University til B. J. S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AGNH Purified in-house N/A TVAG_213720
UNH Purified in-house N/A TVAG_092730
Adenosine Sigma A9251
5-Fluorouridine Sigma F5130
Dimethyl sulfoxide-D6 Cambridge Isotope Labs DLM-10-100 D, 99.9%
Potassium phosphate monobasic Sigma P0662
Potassium phosphate dibasic Sigma P3786
Potassium chloride Sigma P9541
Deuterium oxide Cambridge Isotope Labs DLM-4-100 D, 99.9%
Hydrochloric acid Fisher Chemical A144212
Triton X-100 Sigma X100
3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP) Sigma 269913 D, 98%
2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2 Sigma 612197 D, 99.5%
Pipette Gilson F123602 PIPETMAN Classic P1000
Pipette Gilson F123601 PIPETMAN Classic P200
Pipette Gilson F123600 PIPETMAN Classic P20
Microfuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
Conical tubes Corning 352099
Microcentrifuge Eppendorf 5418
Vortex mixer Fisher Scientific 02215365
NMR tubes Norell 502-7 Or as appropriate for the NMR
NMR spectrometer Bruker N/A AvanceIII500
Prism software GraphPad N/A Version 5.04

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
  2. Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
  3. Dalvit, C., et al. A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening. Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).
  4. Dalvit, C. Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery. Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).
  5. Stockman, B. J., et al. Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments. Chemical Biology & Drug Design. 73, 179-188 (2009).
  6. Hirt, R. P., Sherrard, J. Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations. Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).
  7. Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world. Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).
  8. Versées, W., Steyaert, J. Catalysis by nucleoside hydrolases. Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).
  9. Shea, T. A., et al. Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).
  10. Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).
  11. Muellers, S. N., et al. Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase. ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).
  12. Veronesi, M., et al. Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells. Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).
  13. Holzgrabe, U. Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications. Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).
  14. Bharti, S. K., Roy, R. Quantitative 1H NMR spectroscopy. Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).
  15. Dalvit, C., et al. Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications. Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).
  16. Lambruschini, C., et al. Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH. ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).
  17. Stockman, B. J. 2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening. Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).
  18. Aldrich, C., et al. The ecstasy and agony of assay interference compounds. ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).
  19. Feng, B. Y., Shoichet, B. K. A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors. Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).
  20. Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis. Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).
  21. Griveta, J. -P., Delort, A. -M. NMR for microbiology: In vivo and in situ applications. Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).
  22. Nijman, S. M. B. Functional genomics to uncover drug mechanism of action. Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).

Tags

Kemi vaskemiddel tæller skærm enzymaktivitet assay IC50 værdi hoppe-fortynding 1H NMR 19F NMR hele celle NMR nukleosid ribohydrolase
NMR-baserede Aktivitetsassays til bestemmelse af sammensatte hæmning, IC<sub>50</sub> -værdier, artifaktuel aktivitet og helcelle aktivitet af Nukleosid-Ribohydrolaser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stockman, B. J., Kaur, A., Persaud,… More

Stockman, B. J., Kaur, A., Persaud, J. K., Mahmood, M., Thuilot, S. F., Emilcar, M. B., Canestrari, M., Gonzalez, J. A., Auletta, S., Sapojnikov, V., Caravan, W., Muellers, S. N. NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases. J. Vis. Exp. (148), e59928, doi:10.3791/59928 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter