Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

NMR-baserte aktivitet analyser for å bestemme sammensatte hemming, IC50 verdier, Artifactual aktivitet, og hele cellen aktivitet av nukleosid Ribohydrolases

Published: June 30, 2019 doi: 10.3791/59928
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

Summary

NMR-baserte aktivitets analyser er utviklet for å identifisere og karakterisere hemmere av to nukleosid ribohydrolase enzymer. Protokoller er gitt for innledende sammensatte analyser på 500 μM og 250 μM, dose-respons analyser for fastsettelse av IC50 verdier, vaskemiddel Counter skjerm analyser, Jump-fortynning Counter skjerm analyser, og analyser i E. coli hele celler.

Abstract

NMR spektroskopi brukes ofte for identifisering og karakterisering av enzym hemmere i stoffet funnet, spesielt i sammenheng med fragment screening. NMR-baserte aktivitet analysene er ideelt egnet til å arbeide på høyere konsentrasjoner av test forbindelser som kreves for å oppdage disse svakere hemmere. Den dynamiske rekkevidden og kjemisk forskyvning dispersjon i et NMR eksperiment kan lett løse resonanser fra substrat, produkt, og test forbindelser. Dette står i kontrast til Spektrofotometriske analyser, der problemer med lese forstyrrelser ofte oppstår fra forbindelser med overlappende UV-Vis absorpsjons profiler. I tillegg, siden de mangler reporter enzymer, enkelt-enzym NMR analysene er ikke utsatt for koblet-analysen falske positiver. Dette attributtet gjør dem nyttige som ortogonale analyser, og supplerer tradisjonelle høy gjennomstrømming screening analyser og stasjonære sortering analyser. Detaljerte protokoller er gitt for innledende sammensatte analyser på 500 μM og 250 μM, dose-respons analyser for å bestemme IC50 verdier, vaskemiddel Counter skjerm analyser, Jump-fortynning Counter skjerm analyser, og analyser i E. coli hele celler. Metodene er demonstrert ved hjelp av to nukleosid ribohydrolase enzymer. Bruken av 1H NMR er vist for det purine-spesifikke enzymet, mens 19F NMR er vist for det pyrimidin-spesifikke enzymet. Protokollene er vanligvis gjelder for alle enzym der substrat og produkt resonanser kan observeres og skilles av NMR spektroskopi. For å være den mest nyttige i sammenheng med stoffet funnet, bør den endelige konsentrasjonen av underlaget ikke være mer enn 2-3x sin Km verdi. Valget av NMR eksperiment avhenger av enzymet reaksjon og underlag tilgjengelig samt tilgjengelig NMR instrumentering.

Introduction

Kjernefysisk magnetisk resonans (NMR) spektroskopi er godt etablert for karakteriserer og overvåking enzymreaksjoner1,2. Forskjeller i kjemiske Skift og koblings mønstre brukes til å skille substrat og produkt resonanser, og relativ resonans intensitet brukes til å kvantifisere prosent av reaksjonen. Både forbruk av substrat og etablering av produktet er direkte observert i NMR spektrum. Dette kontraster med Spektrofotometri eller fluorescens spektroskopi, der reaksjonstiden kurset er indikert av en endring i absorbansen tilskrives noen kjemiske arter blir konsumert eller opprettet. Akkurat som med de andre metodene, kan NMR brukes til å studere enzymreaksjoner som en funksjon av temperatur, pH, eller andre løsnings betingelser, og effekten av hemmere kan bestemmes.

Mer nylig har NMR-baserte enzym aktivitet analyser blitt demonstrert for fragment screening3,4. NMR-baserte analyser er ideelt egnet til å arbeide ved høyere konsentrasjoner av test forbindelser (ofte så høyt som 1 mM) som kreves for å oppdage disse svakere hemmere. Den dynamiske rekkevidden og kjemisk forskyvning dispersjon i NMR eksperimentet kan enkelt løse resonanser fra substrat, produkt, og test forbindelser. Dette sammenligner gunstig til Spektrofotometriske analyser der lese forstyrrelser problemer ofte oppstår fra forbindelser med overlappende UV-Vis absorpsjon profiler. I tillegg, siden de mangler reporter enzymer, enkelt-enzym NMR analysene er ikke utsatt for koblet-analysen falske positiver. Denne fordelen gjør dem nyttige som ortogonale analyser, supplerer tradisjonell høy gjennomstrømming screening analyser og stasjonære sortering analyser5.

I vårt forskningslaboratorium brukes NMR-baserte aktivitets analyser til å identifisere og evaluere hemmere av trichomonas vaginalis nukleosid ribohydrolases. T. vaginalis parasitten forårsaker de mest utbredte ikke-viral seksuelt overførbare sykdommer6. Økende motstand mot eksisterende terapier7 kjører behovet for romanen, mekanisme-baserte behandlinger, med essensielle nukleosid berging Pathway enzymer som representerer Prime mål8. NMR-baserte aktivitet analyser er utviklet for både pyrimidin-og purine-spesifikke enzymer, uridindifosfatglukuronosyltransferase nukleosid ribohydrolase (UNH)9, og adenosin/guanosin foretrakk nukleosid RIBOHYDROLASE (AGNH)10. Reaksjonene som katalysert av disse to enzymene er vist i figur 1. NMR-analysene brukes til å skjerm fragment biblioteker for kjemiske startpunkter, bestemme IC50 -verdier og Luke ut aggregering-baserte eller kovalente binding hemmere11. De samme analysene blir også oversatt for å vurdere enzym aktivitet i hele celler12.

Detaljerte protokoller er gitt for innledende sammensatte analyser på 500 μM og 250 μM, dose-respons analyser for å bestemme IC50 verdier, vaskemiddel Counter skjerm analyser, Jump-fortynning Counter skjerm analyser, og analyser i E. coli hele celler. Protokollene er generelt gjelder for alle enzym der substrat og produkt resonanser kan observeres og skilles av NMR spektroskopi. Tre forutsetninger har blitt gjort for enkelhet. Først er underlaget ikke spesifisert. For at NMR-baserte aktivitets analyser skal være nyttige, bør den endelige konsentrasjonen av underlaget ikke være mer enn 2-3x Km verdi4. I eksemplene som vises, er de endelige konsentrasjonene av adenosin og 5-fluorouridine 100 μM (km = 54 μM) og 50 μm (km = 15 μM), henholdsvis. I protokollene, som oppnår disse konsentrasjonene tilsvarer 12 μL av 5 mM adenosin eller 12 μL av 2,5 mM 5-fluorouridine.

For det andre, mengden av enzymet fastsatt i protokollene, 5 μL, ble valgt til å tilsvare det beløpet som kreves for å resultere i ca 75% konvertering av substrat til produktet i 30 min. Dette antallet representerer vanligvis en stor fortynning fra et renset enzym lager, og fortynning må fastsettes på forhånd for hvert enzym. Renset AGNH og UNH enzym lager løsninger er lagret ved-80 ° c i alikvoter som gir nok enzym for flere tusen reaksjoner. Således, det fortynning faktoren ideal bare nødvendig å bli besluttet eller godkjent enhver få måneder. For det tredje er ikke det spesifikke 1D NMR-eksperimentet angitt. I de representative resultatene vises 1H NMR for AGNH10 og 19F NMR vises for UNH9, med det NMR eksperimentet som er beskrevet i de tilsvarende referansene. Valget av NMR eksperiment avhenger av enzymet reaksjon og underlag tilgjengelig samt tilgjengelig NMR instrumentering. Til slutt bør det være påpekt at den eksperimentelle tilnærmingen beskrevet ikke overholder de strenge kravene til kvantitative NMR (qNMR)13,14. I protokollen bestemmes en prosent reaksjon ved hjelp av de relative endringene i intensiteten av den samme resonans i hvert spektrum, i stedet for ved å bestemme absolutte konsentrasjoner. Denne tilnærmingen eliminerer behovet for innhenting av data og behandling av modifikasjoner i tillegg til interne eller eksterne standarder, som kreves for qNMR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. innledende test sammensatte analyser ved 500 μM og 250 μM

  1. Forbered substrat og test sammensatte for reaksjoner.
    1. Forbered lager løsninger av substrat (adenosin eller 5-fluorouridine) i vann og 50 mM test sammensatte i deuterert dimethyl sulfoxide (DMSO). Se Introduksjons seksjonen for konsentrasjoner av substrat løsning å bruke.
    2. Tilsett 12 μL av substrat (adenosin eller 5-fluorouridine) til hver av de fire 1,5 mL microfuge rørene, 1 – 4.
    3. Tilsett 6 μL av deuterert DMSO til rør 1 (0 min kontroll) og 4 (30 min kontroll). Tilsett 6 μL av test stoff til rør 2. Tilsett 3 μL av test stoff og 3 μL av deuterert DMSO til rør 3.
  2. Forbered tilstrekkelig reaksjons lagerløsning.
    Merk: lager løsningen er for fem reaksjoner som hver inneholder 517 μL av buffer, 60 μL av deuteriumoksid og 5 μL enzym løsning (AGNH eller UNH). Se Introduksjons seksjonen for konsentrasjoner av enzym løsning som skal brukes.
    1. Tilsett 2,59 mL reaksjonsbuffer (50 mM kalium fosfat, 0,3 M KCl, pH 6,5) til et 15 mL konisk rør. Tilsett 300 μL av deuteriumoksid til det koniske røret. Tilsett 25 μL enzym løsning (AGNH eller UNH) til den koniske.
    2. Vend forsiktig den koniske slangen to ganger for å blande.
  3. Samtidig initiere og slukke 0 min kontroll reaksjon. Transfer 582 μL av reaksjons lager løsningen til et rent microfuge rør. Tilsett 10 μL av 1,5 M HCl til dette microfuge røret. Overfør den kombinerte 592 μL til microfuge rør 1. Aspirer og dispensere prøven to ganger på en langsom, men bevisst måte.
  4. Initiere og kjøre de resterende tre reaksjoner i forskjøvet mote. Ved tid 0 min, overføring 582 μL av reaksjons lager løsningen til microfuge tube 2. Aspirer og dispensere prøven to ganger på en langsom, men bevisst måte. Gjenta ved 30 s intervaller for microfuge rør 3 og 4. Vent 30 min.
  5. Slukke reaksjonene. Ved 30 min tid, tilsett 10 μL av 1,5 M HCl til microfuge 2. Gjenta ved 30 s intervaller for microfuge rør 3 og 4. Overføring 600 μL oppløsning fra hver microfuge til NMR-rør.
  6. Skaff et 1D NMR-spektrum på hver prøve. Behandle dataene for å sikre riktig fase og flate opprinnelige planer.
  7. Beregn prosentvis konvertering av substrat for kontroll Spectra.
    1. Overlapp Spectra for 0 min og 30 min kontroller. Skaler substrat signalet i 0 min kontroll for å matche 30 min kontroll. Merk denne prosentandelen.
    2. Beregn prosent konverteringen som (100 – prosent angitt i trinn 1.7.1).
  8. Beregn prosentvis konvertering av substrat for reaksjoner som inneholder test sammensatte.
    1. Overlapp Spectra for 0 min kontroll og første reaksjon som inneholder 500 μM test sammensatte. Skaler underlaget signal i 0 min kontroll for å matche spekteret med test sammensatte. Merk denne prosentandelen. Beregn prosent konvertering som (100 – prosent fastsatt).
    2. Gjenta for den andre reaksjonen som inneholder test forbindelsen 250 μM.
  9. Beregn prosent reaksjonen og prosent hemming for hver test sammensatte konsentrasjon.
    1. Beregn prosent reaksjonen som (1.8.1/1.7.2) x 100.
    2. Beregn prosent hemming som (100-prosent fastsatt i trinn 1.9.1).

2. fastsettelse av IC50 verdier

  1. Forbered substrat og test sammensatte for reaksjoner.
    1. Forbered lager løsninger av substrat (adenosin eller 5-fluorouridine) i vann og 10 mM test sammensatte i deuterert DMSO. Se Introduksjons seksjonen for konsentrasjoner av substrat løsning å bruke.
  2. Forbered seriell fortynninger på 10 mM test stoff (i deuterert DMSO).
    1. Tilsett 36 μL deuterert DMSO til 5 1,5 mL microfuge rør, 1 – 5.
    2. Tilsett 12 μL 10 mM test forbindelse til rør 1 og trykk lett for å blande. Test sammensatte er nå 2,5 mM.
    3. Overfør 12 μL fra rør 1 til rør 2 og trykk lett for å blande. Test sammensatte er nå 0,63 mM. Overfør 12 μL fra rør 2 til rør 3 og trykk lett for å blande. Test sammensatte er nå 0,16 mM. Overfør 12 μL fra rør 3 til rør 4 og trykk lett for å blande. Test sammensatte er nå 0,04 mM. Overfør 12 μL fra rør 4 til rør 5 og trykk lett for å blande. Test sammensatte er nå 0,01 mM.
  3. Forbered 14 1,5 mL microfuge rør for reaksjoner.
    1. Tilsett 12 μL av substrat (adenosin eller 5-fluorouridine) til hver av 14 1,5 mL microfuge rør, 1-14.
    2. Tilsett 12 μL av deuterert DMSO til rør 1 (0 min kontroll) og 14 (30 min kontroll).
    3. Tilsett 12 μL av 10 mM test stoff på rør 2 og 3. Tilsett 12 μL med 2,5 mM test forbindelse til rør 4 og 5. Tilsett 12 μL med 0,63 mM test forbindelse til rør 6 og 7. Tilsett 12 μL av 0,16 mM test stoff til rør 8 og 9. Tilsett 12 μL av 0,04 mM test forbindelse til rør 10 og 11. Tilsett 12 μL av 0,01 mM test stoff til rør 12 og 13.
  4. Forbered tilstrekkelig reaksjons lagerløsning for å kjøre 15 reaksjoner som inneholder 511 μL av buffer, 60 μL av deuteriumoksid og 5 μL enzym oppløsning (AGNH eller UNH) hver. Se Introduksjons seksjonen for konsentrasjoner av enzym løsning som skal brukes.
    1. Tilsett 7,67 mL reaksjonsbuffer (50 mM kalium fosfat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) til et 15 mL konisk rør. Tilsett 900 μL av deuteriumoksid til det koniske røret. Tilsett 75 μL enzym løsning (AGNH eller UNH) til den koniske.
    2. Vend den koniske slangen 2x forsiktig for å blande.
  5. Følg trinnene som er beskrevet i trinn 1.3 – 1.9 til (ved hjelp av 576 μL av reaksjons lagerløsning) for å bestemme prosent reaksjonen for hver test sammensatte konsentrasjon.
  6. Beregn IC50 verdi ved hjelp av GraphPad prisme.
    1. Opprett en datatabell samkjøre i en test av sammensatte konsentrasjoner (200 μM, 50 μM, 12,5 μM, 3,13 μM, 0,78 μM, 0,20 μM) med prosent reaksjon (to verdier hver).
    2. Bruk en ikke-lineær kurve passer for å fastslå IC50 verdi og standard feil.

3. vaskemiddel Counter Screen analyser på 100 μM og 50 μM

  1. Forbered substrat og test sammensatte for reaksjoner.
    1. Forbered lager løsninger av substrat (adenosin eller 5-fluorouridine) i vann og 10 mM test sammensatte i deuterert DMSO. Se Introduksjons seksjonen for konsentrasjoner av substrat løsning å bruke.
    2. Tilsett 12 μL av substrat (adenosin eller 5-fluorouridine) til hver av åtte 1,5 mL microfuge rør, 1 – 8.
    3. Tilsett 6 μL av deuterert DMSO til rør 1 og 5 (0 min kontroller) og 4 og 8 (30 min kontroller). Tilsett 6 μL av test stoff til rør 2 og 6. Tilsett 3 μL av test stoff og 3 μL av deuterert DMSO til rør 3 og 7.
  2. Forbered tilstrekkelig reaksjons lagerløsning uten vaskemiddel for å kjøre fem reaksjoner som inneholder 517 μL av buffer, 60 μL av deuteriumoksid og 5 μL enzym oppløsning (AGNH eller UNH) hver. Se Introduksjons seksjonen for konsentrasjoner av enzym løsning som skal brukes.
    1. Tilsett 2,59 mL reaksjonsbuffer (50 mM kalium fosfat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) til et 15 mL konisk rør. Tilsett 300 μL av deuteriumoksid til det koniske røret. Tilsett 25 μL enzym løsning (AGNH eller UNH) til den koniske.
    2. Vend den koniske slangen 2x forsiktig for å blande.
  3. Forbered tilstrekkelig reaksjons lagerløsning med 0,01% v/v Triton X-100 vaskemiddel for å kjøre fem reaksjoner som inneholder 517 μL av buffer, 60 μL av deuteriumoksid og 5 μL enzym løsning (AGNH eller UNH) hver.
    1. Tilsett 2 μL Triton X-100 vaskemiddel til 20 mL reaksjonsbuffer (50 mM kalium fosfat, 0,3 M KCl, pH = 6,5). Vaskemiddel løsninger må brukes innen 1 dag.
    2. Tilsett 2,59 mL reaksjonsbuffer som inneholder 0,01% Triton X-100 vaskemiddel til et 15 mL konisk rør. Tilsett 300 μL av deuteriumoksid til det koniske røret. Tilsett 25 μL enzym løsning (AGNH eller UNH) til den koniske.
    3. Vend den koniske slangen 2x forsiktig for å blande.
  4. For rør 1 – 4 ved hjelp av reaksjons lager løsningen uten vaskemiddel følger du trinnene som er beskrevet i trinn 1.3 – 1.9 for å fastslå prosent hemming for hver test sammensatte konsentrasjon.
  5. For rør 5 – 8 ved hjelp av reaksjons lager løsningen med 0,01% v/v Triton X-100 vaskemiddel, følger du trinnene som er beskrevet i trinn 1.3 – 1.9 for å fastslå prosent hemming for hver test sammensatte konsentrasjon.

4. Jump-fortynning Counter skjerm analyser

  1. Forbered underlaget og test sammensetninger for reaksjoner
    1. Forbered lager løsninger av substrat (adenosin eller 5-fluorouridine) i vann og 10 mM test sammensatte i deuterert DMSO. Se Introduksjons seksjonen for konsentrasjoner av substrat løsning å bruke.
    2. Tilsett 53,8 μL av reaksjonsbuffer (50 mM kalium fosfat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) til to 1,5 mL microfuge rør (hver), 1 og 2. Tilsett 5 μL enzym (AGNH eller UNH) til rør 1 og 2.
    3. Tilsett 511 μL av reaksjonsbuffer til to 1,5 mL microfuge rør, 3 og 4 (hver). Tilsett 60 μL av deuteriumoksid til rør 3 og 4. Tilsett 5 μL enzym (AGNH eller UNH) til rør 3 og 4.
    4. Tilsett 1,2 μL av deuterert DMSO til rør 1 (30 min kontroll). Tilsett 1,2 μL av test stoff til rør 2. Tilsett 12 μL av deuterert DMSO til rør 3 (30 min kontroll). Tilsett 12 μL av test stoff til rør 4. Ruge i 30 min.
  2. Forbered to 1,5 mL microfuge rør med fortynning løsning.
    1. Tilsett 468 μL av reaksjonsbuffer til hver av to 1,5 mL microfuge rør, 5 og 6. Tilsett 60 μL av deuteriumoksid i hvert rør (5 og 6).
  3. Forbered fire 1,5 mL microfuge rør for reaksjonene.
    1. Tilsett 12 μL av substrat (adenosin eller 5-fluorouridine) til hver av fire 1,5 mL microfuge rør, 7 – 10.
  4. Utfør Jump-fortynninger og starte reaksjonene.
    1. Transfer 528 μL oppløsning fra rør 5 til rør 1. Aspirer og dispensere prøven to ganger på en langsom, men bevisst måte. Transfer 528 μL oppløsning fra rør 6 til rør 2. Aspirer og dispensere prøven to ganger på en langsom, men bevisst måte.
    2. Ved tid 0 min, overføring 588 μL av oppløsning fra rør 1 til rør 7. Aspirer og dispenser prøven 2x på en langsom, men bevisst måte. Ved 30 s intervaller, overføring 588 μL av oppløsning fra rør 2 til rør 8, tube 3 til tube 9, og rør 4 til tube 10. Aspirer og dispensere prøven to ganger på en langsom, men bevisst måte. Vent 30 min.
  5. For rør 7 – 10 følger du trinnene som er skissert i trinn 1.5 – 1.9 for å fastslå prosent hemming for hver test sammensatte konsentrasjon.

5. sammensatte analyser i E. coli hele celler

  1. Forbered 10 mL over natten kultur av E. coli på dagen før eksperimenter.
  2. Forbered E. coli celler for NMR eksperimenter.
    1. Sentrifuger cellene i 1 mL alikvoter i 10 min ved 15 000 x g.
    2. Kast supernatanten og resuspend hver alikvot av celler i 1 mL reaksjonsbuffer (50 mM kalium fosfat, 0,3 M KCl, pH = 6,5) ved virvlingen.
  3. Følg avsnitt 1 eller 2 for den ønskede analysen med følgende endringer:
    1. Erstatning 280 μL av buffer i reaksjons lager løsningen med 280 μL av resuspendert celler.
    2. Erstatning 5 μL enzym (AGNH eller UNH) i reaksjons lager løsningen med 5 μL buffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 viser resultatene for testing av to FORBINDELSER mot AGNH med 1H NMR etter avsnitt 1. Enzymet reaksjonen er lettest observert og kvantifisert av forsvinningen av adenosin singlet og doublet resonanser ved 8,48 ppm og 6,09 ppm, henholdsvis, og utseendet av en adenine singlet resonans på 8,33 ppm som observert i 30 min kontroll Spekteret. I nærvær av 500 μM sammensatte 1, er ingen produkt dannet som dokumentert av mangelen på en adenine resonans på 8,33 ppm. I nærvær av 250 μM sammensatte 1 har omtrent 10% av underlaget blitt konvertert til produkt. I motsetning, verken konsentrasjon av sammensatte 2 hemmer enzymet som dokumentert av underlaget og produkt resonanser ligner de i 30 min kontroll spektrum. Disse dataene identifiserer sammensatte 1 som en god AGNH-hemmer. Merk at resonanser som oppstår fra sammensatte 1 (7.70-8.00 og 8,50-8.60 ppm) og sammensatte 2 (7.40-7.80 ppm) er også observert. Samme substrat og produkt resonanser brukes til å overvåke reaksjonene som vises i Figur 4, figur 6, Figur 8og Figur 10. Figur 3 viser resultatene for testing av to FORBINDELSER mot UNH med 19F NMR etter avsnitt 1. Enzymet reaksjonen er lett observert og kvantifisert av forsvinningen av 5-fluorouridine resonans på-165,8 ppm og utseendet på en 5-Fluorouracil resonans på-169,2 ppm som observert i 30 min kontroll spektrum. For dette enzymet, sammensatt 2 helt hemmer reaksjonen i begge konsentrasjoner, mens sammensatte 1 har ingen effekt. Disse dataene identifiserer sammensatte 2 som en god UNH-hemmer. Samme substrat og produkt resonanser brukes til å overvåke reaksjonene som vises i figur 5, figur 7, figur 9og Figur 11.

Figur 4 viser NMR-data for dose respons og resulterende IC50 -kurve innhentet for en forbindelse med AGNH-aktivitet med 1H NMR etter avsnitt 2. NMR-data vises bare for ett av duplikat forsøkene. Merk at resonanser som oppstår fra testet sammensatte (6.90-7.40 ppm) ikke forstyrrer underlaget eller produkt resonanser. IC50 Curve var egnet ved hjelp av data fra begge forsøkene og resulterte i en verdi på 12,3 ± 5,0 μM. Dette resultatet er konsistent med NMR data i at betydelig tap av substrat signal ikke er observert før den sammensatte konsentrasjonen er redusert til 12,5 μM. Figur 5 viser NMR-data for dose respons og resulterende IC50 -kurve innhentet for en forbindelse med UNH-aktivitet med 19F NMR etter avsnitt 2. NMR-data vises bare for ett av duplikat forsøkene. IC50 Curve var egnet ved hjelp av data fra begge forsøkene og resulterte i en verdi på 16,7 ± 10,4 μM. Denne verdien er i overensstemmelse med NMR-dataene ved at betydelig tap av substrat signal ikke overholdes før den sammensatte konsentrasjonen reduseres til 12,5 μM.

Figur 6 viser resultatene for testing av en forbindelse ved to KONSENTRASJONER mot AGNH i fravær og tilstedeværelse av 0,01% Triton X-100 vaskemiddel med 1H NMR etter avsnitt 3. Bare minimale forskjeller er observert i intensiteten av underlaget og produkt signaler ved hjelp av de to forholdene, noe som indikerer at den observerte enzymet hemming er ikke en gjenstand for sammensatte aggregering. Merk at resonanser som oppstår fra testet sammensatte (7.10-7.70 ppm) og Triton X-100 (6,90 og 7,40 ppm) ikke forstyrrer underlaget eller produktet resonanser. Figur 7 viser resultatene for å teste en sammensatt ved to KONSENTRASJONER mot UNH i fravær og tilstedeværelse av 0,01% Triton X-100 vaskemiddel med 19F NMR etter avsnitt 3. Bare minimale forskjeller er observert i intensiteten av underlaget og produkt signaler ved hjelp av de to forholdene, noe som indikerer at den observerte enzymet hemming er ikke en gjenstand for sammensatte aggregering.

Figur 8 viser resultatene for å teste et sammensatt i hoppe-fortynning ANALYSEN mot AGNH med 1H NMR etter avsnitt 4. Den reduserte intensiteten av substrat signalet i reaksjonen på 20 μM sammenlignet med 200 μM-reaksjonen indikerer at hemming er reversibel. Den testede forbindelsen har en IC50 -verdi på 21,0 μM, og dens resonanser er observert ved 6.90-8.30 ppm. I dette eksempelet, resonanser fra sammensatte forstyrre de av adenine produkt signalet, og reaksjon fremgang er lettere å overvåke ved hjelp av adenosin resonans på 6,09 ppm. Figur 9 viser resultatene for testing et sammensatt i hoppe-fortynning ANALYSEN mot UNH bruke 19F NMR følgende avsnitt 4. Den økte intensiteten på produkt signalet ved-169,2 ppm i reaksjonen på 20 μM sammenlignet med den 200 μM-reaksjonen indikerer at hemming er reversibel. Den testede forbindelsen har en IC50 -verdi på 16,7 μM.

Figur 10 viser nytten av metoden for å utføre analyser i hele celler ved hjelp av 1H NMR etter avsnitt 5. Den adenosin substrat signalene er nesten helt borte etter 30 min i nærvær av hele celler, indikerer hydrolyse av underlaget. Til sammenligning forblir underlaget uendret etter 30 min i nærvær av cellevekst Media supernatanten, noe som indikerer at hydrolyse reaksjonen er celle avhengig. Merk tilstedeværelsen av mange bakgrunns signaler i supernatanten Spectra, inkludert intense Triplet signaler fra NH4+ ioner på 6.90-7.15 ppm som også er til stede i mindre grad i hele cellen Spectra. Figur 11 viser nytten av metoden for å utføre analyser i hele celler ved hjelp av 19F NMR etter avsnitt 5. Den 5-fluorouridine substrat signal er helt borte etter 60 min i nærvær av hele celler, indikerer hydrolyse av underlaget. I motsetning forblir underlaget uendret etter 60 min i nærvær av cellevekst Media supernatanten, noe som indikerer at hydrolyse reaksjonen er celle avhengig.

Figure 1
Figur 1: reaksjoner katalysert av UNH (øverst) og AGNH (nederst). Merk at UNH vil katalysere hydrolyse av både uridindifosfatglukuronosyltransferase og 5-fluorouridine (vist). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representative innledende sammensatte analyser på 500 μ M og 250 μ M mot AGNH med 1H NMR. Regioner av 1H NMR reaksjon Spectra for to forbindelser, hver på 500 μM og 250 μm, sammen med 0 min og 30 min kontroll Spectra. Den 0 min kontroll spekteret inneholder adenosin substrat resonanser på 6,09, 8,38, og 8,48 ppm. Den 30 min kontroll spekteret inneholder en ny adenine produkt resonans på 8,33 ppm. Test Spectra inneholde ekstra resonanser som følge av sammensatt testet. 1 den andre H kjemiske Skift ble referert til ekstern trimethylsilylpropionic syre på 0,0 ppm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representative innledende sammensatte analyser på 500 μ M og 250 μ M mot UNH med 19F NMR. Regioner av 19F NMR reaksjon Spectra for to forbindelser, hver på 500 μM og 250 μm, sammen med 0 min og 30 min kontroll Spectra. Den 0 min kontroll spekteret inneholder en 5-fluorouridine substrat resonans på-165,8 ppm. Det 30 min kontroll spekteret inneholder en ny 5-Fluorouracil produkt resonans på-169,2 ppm. 19 andre priser F kjemiske Skift ble referert til eksterne 50 μM trifluoroethanol på-76,7 ppm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: representativ dose-respons NMR data og resulterende IC50 kurve innhentet for en forbindelse med AGNH aktivitet med 1H NMR. Regioner av 1H NMR reaksjon Spectra for variable konsentrasjoner av et sammensatt (200-0.20 μM) sammen med 0 min og 30 min kontroll Spectra. Resonanser fra 6.90-7.40 ppm oppstår fra testet sammensatte. IC50 -kurven ble tilpasset ved hjelp av data fra NMR datasett Run i duplikat. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: representant dose-respons NMR data og resulterende IC50 kurve innhentet for en forbindelse med UNH aktivitet med 19F NMR. Regioner av 19F NMR reaksjon Spectra for variable konsentrasjoner av et sammensatt (200-0.20 μM) sammen med 0 min og 30 min kontroll Spectra. IC50 -kurven ble tilpasset ved hjelp av data fra NMR datasett Run i duplikat. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: representative vaskemiddel teller skjerm analyser for en forbindelse med AGNH-aktivitet med 1H NMR. Regioner av 1H NMR reaksjon Spectra for en sammensatt på 100 μM og 50 μM, sammen med 0 min og 30 min kontroll Spectra, i nærvær og fravær av 0,01% Triton X-100. Resonanser på 7.10-7.70 ppm og 6,90 og 7,40 ppm oppstår fra testet sammensatte og Triton X-100, henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: representativ vaskemiddel teller skjerm analyser for en forbindelse med UNH-aktivitet med 19F NMR. Regioner av 19F NMR reaksjon Spectra for en sammensatt på 100 μM og 50 μM, sammen med 0 min og 30 min kontroll Spectra, i nærvær og fravær av 0,01% Triton X-100. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: representant hoppe-fortynning Counter skjerm analyser for en forbindelse med AGNH aktivitet med 1H NMR. Regionene i 1H NMR reaksjon Spectra for en forbindelse ved 200 μM og 20 μM, sammen med 30 min kontroll Spectra. Enzymet ble inkubert i 30 minutter ved 200 μM sammensatte før starten av reaksjonene, med den 20 μM-reaksjonen fortynnet umiddelbart før reaksjonen igangsettes. Resonanser på 6.90-8.30 ppm oppstår fra testet sammensatte. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: representant hoppe-fortynning teller skjerm analyser for en forbindelse med UNH-aktivitet med 19F NMR. Regioner av 19F NMR reaksjon Spectra for en forbindelse ved 200 μM og 20 μM, sammen med 30 min kontroll Spectra. Enzymet ble inkubert i 30 minutter ved 200 μM sammensatte før starten av reaksjonene, med den 20 μM-reaksjonen fortynnet umiddelbart før reaksjonen igangsettes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: representative analyser i hele celler ved hjelp av 1H NMR. Regioner av 1H NMR reaksjon Spectra for prøver som inneholder enten 280 ΜL av E. coli celler resuspendert i buffer (0, 15 og 30 min) eller cellevekst Media supernatanten (30 min). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11: representative analyser i hele celler ved hjelp av 19F NMR. Regioner av 19F NMR reaksjon Spectra for prøver som inneholder enten 280 ΜL av E. coli celler resuspendert i buffer (0, 15, 30, og 60 min) eller cellevekst Media supernatanten (60 min). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollene beskrevet er generelt gjelder for mange enzymer, forutsatt at underlag og/eller produkter har kan løses signaler i NMR spektrum. Det er imidlertid avgjørende at konsentrasjonen av underlaget er nær sin Km verdi og høy nok til å bli oppdaget i et NMR eksperiment innen rimelig tidsramme. Et substrat konsentrasjon ikke høyere enn 2-3x Km -verdien er optimal for påvisning av konkurrerende, nonkompetitiv og utkonkurrert hemmere4. Som vist her for UNH, substrat, Km verdier så lavt som 15 μM er egnet. Bruk av underlag med CH3 eller CF3 SIGNALER, kombinert med NMR datainnsamling på kryogene sonder, kan senke denne terskelen ytterligere15. Enzymer som har substrat Km verdier under 1 μM, er imidlertid sannsynligvis vanskelig å studere ved hjelp av denne metoden på grunn av den iboende lav følsomhet av NMR eksperimentet. I disse situasjonene, Spektrofotometri eller fluorescens spektroskopi er mer egnede teknikker.

En annen begrensning til anvendelsen av disse metodene er en passende slukke agent. Alle protokollene beskrevet her er fast-time analyser, med reaksjonen slukket etter 30 min ved tilsetning av HCl. For både AGNH og UNH, hadde det tidligere blitt fastslått at HCL umiddelbart stoppet reaksjonen, og holdt den stoppet for perioder på uker9,10. Dette er viktig siden dusinvis av reaksjoner er ofte kjøres samtidig, og deretter i kø for NMR datainnsamling over en periode på flere timer. Det er også viktig å fastslå at ikke-enzymatisk degradering av underlaget eller produkt signaler ikke oppstår etter å slukke men før NMR datainnsamling. I tillegg til HCl, andre vanlige måter å slukke reaksjoner er ved tilsetning av en kjent nanomolar inhibitor16 eller, i tilfelle av reaksjoner som involverer adenosin trifosfat, tillegg av chelaterande agent ethylenediaminetetraacetic acid17.

NMR-baserte aktivitet analyser gir merverdi når det brukes for fragment screening eller ortogonale analyser for å validere høy gjennomstrømming screening treff4. I motsetning til bindende analyser, NMR-baserte aktivitet analyser identifisere eller bekrefte forbindelser som faktiske hemmere. Aktiviteten analysene også bruke langt mindre mål enzym enn gjøre bindende analyser. De samme metodene er utrolig robust for to typer Counter skjermer utført for å validere reversibel, mål-spesifikk aktivitet og utelukke artifactual analysen aktivitet18. Vaskemiddel og hoppe-fortynning analysene er Counter-skjermer for kolloidalt aggregering19 og irreversible hemming20, henholdsvis. Forbindelser som passerer disse testene er validert utgangspunkt for medisinsk kjemi og struktur-guidet inhibitor optimalisering. De NMR-baserte aktivitets analysene kan fortsette å gi sammensatte aktivitetsdata etter hvert som prosjektet utvikler seg mot nanomolar hemmere.

Til slutt, nytten av disse analysene for overvåking reaksjoner i hele celler er bemerkelsesverdig21. Samkjøre hemming av renset enzym med hemming av i-celle-enzymet ville gi definitive bevis på den biokjemiske mekanismen underliggende den observerte fenotypiske effekt22. For de to enzymene som presenteres her, er den ønskede fenotypiske effekten tap av levedyktighet (antitrichomonal aktivitet). En sammenheng mellom renset enzym hemming, i-celle enzym hemming, og parasitten celle død ville utgjøre bevis på inhibitor virkningsmekanismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Dean Brown for å gi forbindelser fra AstraZeneca fragment biblioteket og Dr. David Parkin for å gi AGNH og UNH enzymer. Forskning som rapporteres i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of allergi og smittsomme sykdommer i National Institutes of Health under Award Number R15AI128585 til B. J. S. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Research ble også støttet av en Horace G. McDonell Summer Research Fellowship tildelt S. N. M., en Landesberg familie Fellowship tildelt J. G., og fakultet utviklings stipend og Frederick Bettelheim Research Award fra Adelphi University til JP S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AGNH Purified in-house N/A TVAG_213720
UNH Purified in-house N/A TVAG_092730
Adenosine Sigma A9251
5-Fluorouridine Sigma F5130
Dimethyl sulfoxide-D6 Cambridge Isotope Labs DLM-10-100 D, 99.9%
Potassium phosphate monobasic Sigma P0662
Potassium phosphate dibasic Sigma P3786
Potassium chloride Sigma P9541
Deuterium oxide Cambridge Isotope Labs DLM-4-100 D, 99.9%
Hydrochloric acid Fisher Chemical A144212
Triton X-100 Sigma X100
3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP) Sigma 269913 D, 98%
2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2 Sigma 612197 D, 99.5%
Pipette Gilson F123602 PIPETMAN Classic P1000
Pipette Gilson F123601 PIPETMAN Classic P200
Pipette Gilson F123600 PIPETMAN Classic P20
Microfuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
Conical tubes Corning 352099
Microcentrifuge Eppendorf 5418
Vortex mixer Fisher Scientific 02215365
NMR tubes Norell 502-7 Or as appropriate for the NMR
NMR spectrometer Bruker N/A AvanceIII500
Prism software GraphPad N/A Version 5.04

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
  2. Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
  3. Dalvit, C., et al. A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening. Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).
  4. Dalvit, C. Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery. Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).
  5. Stockman, B. J., et al. Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments. Chemical Biology & Drug Design. 73, 179-188 (2009).
  6. Hirt, R. P., Sherrard, J. Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations. Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).
  7. Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world. Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).
  8. Versées, W., Steyaert, J. Catalysis by nucleoside hydrolases. Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).
  9. Shea, T. A., et al. Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).
  10. Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).
  11. Muellers, S. N., et al. Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase. ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).
  12. Veronesi, M., et al. Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells. Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).
  13. Holzgrabe, U. Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications. Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).
  14. Bharti, S. K., Roy, R. Quantitative 1H NMR spectroscopy. Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).
  15. Dalvit, C., et al. Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications. Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).
  16. Lambruschini, C., et al. Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH. ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).
  17. Stockman, B. J. 2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening. Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).
  18. Aldrich, C., et al. The ecstasy and agony of assay interference compounds. ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).
  19. Feng, B. Y., Shoichet, B. K. A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors. Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).
  20. Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis. Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).
  21. Griveta, J. -P., Delort, A. -M. NMR for microbiology: In vivo and in situ applications. Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).
  22. Nijman, S. M. B. Functional genomics to uncover drug mechanism of action. Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).

Tags

Kjemi vaskemiddel Counter skjerm enzym aktivitet analysen IC50 verdi Jump-fortynning 1H NMR 19F NMR hele cellen NMR nukleosid ribohydrolase
NMR-baserte aktivitet analyser for å bestemme sammensatte hemming, IC<sub>50</sub> verdier, Artifactual aktivitet, og hele cellen aktivitet av nukleosid Ribohydrolases
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stockman, B. J., Kaur, A., Persaud,… More

Stockman, B. J., Kaur, A., Persaud, J. K., Mahmood, M., Thuilot, S. F., Emilcar, M. B., Canestrari, M., Gonzalez, J. A., Auletta, S., Sapojnikov, V., Caravan, W., Muellers, S. N. NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases. J. Vis. Exp. (148), e59928, doi:10.3791/59928 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter