Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

NMR-מבוסס על פעילות מבוססת על קביעת עיכוב מורכבים, IC50 ערכים, פעילות פרועובדתית, ואת הפעילות התא כולו של נוקלאוטילסייד הריבוליטיות

Published: June 30, 2019 doi: 10.3791/59928
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

Summary

NMR-מבוסס על פעילות שפותחה כדי לזהות ולאפיין מעכבי של שני אנזימים ריבוהיהידרוקלז. הפרוטוקולים מסופקים עבור בחני התרכובת הראשונית ב-500 μm ו 250 μm, מינון התגובה בחני לקביעת ערכי IC50 , ניקוי נוזל מונה המסך, לקפוץ-דילול מונה מסך בחני, ו בחני בתאי E. coli שלם.

Abstract

ספקטרוסקופיית NMR משמש לעתים קרובות לזיהוי ואפיון של מעכבי אנזימים בגילוי הסמים, במיוחד בהקשר של הקרנת קטע. NMR-מבוסס על פעילות מבוססת באופן אידיאלי מתאים לעבוד בריכוזים גבוהים יותר של תרכובות מבחן הנדרש כדי לזהות אלה מעכבי חלשים. הטווח הדינמי ופיזור המשמרת הכימית בניסוי NMR יכול בקלות לפתור מהדהד ממצע, מוצר, ותרכובות בדיקה. זה ניגודים עם spectrophotometric assays, שבו לקרוא בעיות התערבות לעתים קרובות נובעים תרכובות עם חופפים UV-vis פרופילים הקליטה. בנוסף, מאז הם חסרי אנזימים עיתונאי, האנזים היחיד nmr בחני אינם נוטים להיות מצמידים משולב חיוביות שווא. תכונה זו הופכת אותם לשימושיים כמו אורתוגונאליות, משלימים את ההקרנה המסורתית של הקרנת התפוקה ואת שחקן הראש. פרוטוקולים מפורטים מסופקים עבור בחני התרכובת הראשונית ב 500 μm ו 250 μm, מינון התגובה בחני לקביעת ערכי IC50 , ניקוי המונה המסך מונה, לקפוץ-דילול מונה מסך בחני, ו בחני בתאי E. coli שלם. השיטות מודגמות באמצעות שני אנזימים ריבוהידרוקלז. השימוש 1H nmr מוצג עבור אנזים ספציפי purine, בעוד 19F nmr מוצג עבור האנזים הספציפי pyrimidine. הפרוטוקולים חלים בדרך כלל על כל אנזים שבו התהודה המצע מוצר ניתן לצפות ומכובד על ידי הספקטרוסקופיית NMR. כדי להיות שימושי ביותר בהקשר של גילוי סמים, הריכוז הסופי של מצע צריך להיות לא יותר 2-3x הערך Km שלה. הבחירה של הניסוי NMR תלוי בתגובת אנזימים ומצעים זמינים, כמו גם מכשור NMR זמין.

Introduction

תהודה מגנטית גרעינית (nmr) ספקטרוסקופיית מבוססת היטב לאפיון וניטור של תגובות אנזימים1,2. הבדלים במשמרות כימיים ודפוסי צימוד משמשים להבחנה בין המצע לבין מוצרים, ועוצמות תהודה יחסיות משמשות לכמת את אחוז התגובה. הן צריכת המצע והן יצירת המוצר מתבוננים ישירות בספקטרום NMR. זה נוגד את הספקטרוסקופיית הספקטרופוטומטר או הפלואורסצנטית, שבו קורס זמן התגובה מצוין על ידי שינוי בספיגה המיוחס למינים כימיים שנצרכים או נוצרו. בדיוק כמו עם שיטות אחרות, NMR יכול לשמש כדי ללמוד תגובות אנזימים כפונקציה של טמפרטורה, pH, או תנאי פתרון אחרים, ואת ההשפעות של מעכבי ניתן לקבוע.

לאחרונה, nmr-מבוססי האנזים פעילות אנזימים הוכחו עבור הקרנת קטע3,4. Nmr מבוסס בחני מתאים באופן אידיאלי לעבוד בריכוזים גבוהים יותר של תרכובות מבחן (לעתים קרובות גבוה כמו 1 מ"מ) נדרש כדי לזהות אלה מעכבי חלשים. הטווח הדינמי ופיזור המשמרת הכימית בניסוי NMR יכול בקלות לפתור מהדהד ממצע, מוצר, ותרכובות בדיקה. זה משווה בחיוב על spectrophotometric בחני היכן בעיות התערבות קריאה-out מתעוררות לעתים קרובות מתרכובות עם פרופילי UV-vis חופפים. בנוסף, מאז הם חסרי אנזימים עיתונאי, האנזים היחיד nmr בחני אינם נוטים להיות מצמידים משולב חיוביות שווא. יתרון זה הופך אותם לשימושיים כגון אורתוגונאליות, משלימים את ההקרנה המסורתית של הקרנת תפוקה גבוההומיון שחקן ראשי.

במעבדת המחקר שלנו, בחני-מבוסס על הפעילות המבוססת משמשים כדי לזהות ולהעריך מעכבי של trichomonas וגיפרוציץ נוקלאוסייד ריבוליסיס. הטפיל ה -T וגינגיט גורם למחלות המועברות במין הלא-נגיפית הנפוצות ביותר6. התנגדות הגוברת לטיפולים הקיימים7 הוא המניע את הצורך הרומן, מנגנון מבוססי טיפולים, עם מסלול הצלה נוקלאוטיבצד העיקרי המייצג יעדים ראשוניים8. NMR-מבוסס על פעילות שפותחה עבור pyrimidine ו-purine הסגולי, ולאחר הריבוהידקלז נוקלאוטיל9, ו אדנוזין/guanosine העדפת נוקלאוטיההידרוקלז (agnh)10. התגובות מזרז על ידי שני אנזימים אלה מוצגים באיור 1. Nmr בחני נמצאים בשימוש כדי להקרין ספריות קטע עבור נקודות ההתחלה כימיים, לקבוע את IC50 ערכים, ולעשב מתחת מעכבי מבוסס מצבור או מעכבים כריכה מבוססת11. אותו הדבר גם להיות מתורגם כדי להעריך את פעילות האנזים בתאים שלמים12.

פרוטוקולים מפורטים מסופקים עבור בחני התרכובת הראשונית ב 500 μm ו 250 μm, מינון התגובה בחני לקביעת ערכי IC50 , ניקוי המונה המסך מונה, לקפוץ-דילול מונה מסך בחני, ו בחני בתאי E. coli שלם. הפרוטוקולים חלים בדרך כלל על כל אנזים שבו ניתן להבחין במצע ומוצרי מוצר ולהבחין בספקטרוסקופיית NMR. . שלוש הנחות נעשו לפשטות ראשית, המצע לא צוין. עבור הפעילות nmr-מבוסס בחני אומר להיות שימושי, הריכוז הסופי של מצע צריך להיות לא יותר מ 2-3x הערך Km 4. בדוגמאות המוצגות, הריכוזים הסופיים של אדנוזין ו 5-פלואורוורידין הם 100 μM (km = 54 μm) ו 50 μm (km = 15 μm), בהתאמה. בפרוטוקולים, השגת ריכוזים אלה מתאים 12 μL של 5 מ"מ אדנוזין או 12 μL של 2.5 mM 5-פלואור.

שנית, כמות האנזים המסופק עבור בפרוטוקולים, 5 μL, נבחר להתאים את הסכום הנדרש כדי לגרום כ 75% המרה של מצע למוצר בתוך 30 דקות. כמות זו מייצגת בדרך כלל דילול גדול ממניות אנזימים מטוהרים, והדילול חייב להיקבע מראש לכל אנזים. מטוהרים AGNH ופתרונות מלאי אנזימים מאוחסנים ב-80 ° c ב ali, אשר מספקים מספיק אנזים עבור כמה אלפי תגובות. לפיכך, גורם הדילול באופן אידיאלי צריך להיקבע או להיות מאומת כל כמה חודשים. שלישית, ניסוי 1D NMR הספציפי לא צוין. בתוצאות הנציג, 1H nmr מוצג עבור agnh10 ו- 19F nmr מוצג עבור ללא9, עם ניסוי nmr המתואר ההפניות המתאימות. הבחירה של הניסוי NMR תלוי בתגובת אנזימים ומצעים זמינים, כמו גם מכשור NMR זמין. לבסוף, יש לציין כי הגישה הניסיונית תיאר אינו תואם את הדרישות הקפדניות של nmr כמותי (qnmr)13,14. בפרוטוקול, תגובת אחוז נקבעת באמצעות השינויים היחסיים באינטנסיביות של אותה תהודה בכל קשת, ולא על-ידי קביעת ריכוזים מוחלטים. גישה זו מבטלת את הצורך ברכישת נתונים ועיבוד שינויים, כמו גם סטנדרטים פנימיים או חיצוניים, אשר נדרשים qNMR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מתחם הבדיקה הראשונית בחני ב 500 μm ו 250 μm

  1. הכינו מצע ומתחם בדיקה לתגובות.
    1. הכנת פתרונות המניה של מצע (אדנוזין או 5-פלואורוורידיין) במים ובמתחם 50 mM במבחן diמתיל סולפוקסיד (DMSO). עיין בסעיף המבוא לריכוזים של פתרון מצע לשימוש.
    2. הוסף 12 μL של מצע (אדנוזין או 5-פלואורולדין) לכל אחד מ-4 1.5 mL microfuge צינורות, 1 – 4.
    3. הוסף 6 μL של DMSO הדאוטים לצינורות 1 (0 דקות בקרה) ו-4 (30 דקות בקרה). הוסף 6 μL של תרכובת הבדיקה לצינור 2. הוסף 3 μL של מתחם בדיקה 3 μL של DMSO שניוני כדי צינור 3.
  2. הכינו פתרון מספיק. מלאי התגובה
    הערה: פתרון המניה הוא עבור חמש תגובות כי כל אחד מכיל 517 μL של מאגר, 60 μL של תחמוצת דאומיום, ו 5 μL של פתרון אנזים (AGNH או לא). עיין בסעיף המבוא לריכוזים של פתרון אנזים לשימוש.
    1. הוסף 2.59 mL של מאגר התגובה (50 mM אשלגן פוספט, 0.3 M KCl, pH 6.5) ל 15 מ"ל צינור חרוט. הוסף 300 μL של תחמוצת דאונטיום לצינור החרוט. הוסף 25 μL של פתרון אנזים (AGNH או הארה ב) אל החרוט.
    2. הפוך בעדינות את צינור החרוט פעמיים כדי לערבב.
  3. במקביל ליזום ולהרוות את תגובת הבקרה 0 דקות. העברת 582 μL של פתרון מלאי התגובה לצינור microfuge נקי. הוסף 10 μL של 1.5 M HCl לצינור microfuge זה. העבר את משולב 592 μL ל microfuge tube 1. מנושף ומוותר על הדגימה פעמיים בצורה איטית אך מכוונת.
  4. ליזום ולהפעיל את שלוש התגובות הנותרות בצורה מתנדנדת. בזמן 0 דקות, להעביר 582 μL של פתרון מלאי התגובה microfuge tube 2. מנושף ומוותר על הדגימה פעמיים בצורה איטית אך מכוונת. חזור על מרווחי 30 עבור microfuge צינורות 3 ו 4. . חכה 30 דקות
  5. . להרוות את התגובות בזמן 30 דקות, להוסיף 10 μL של 1.5 M HCl כדי microfuge 2. חזור על מרווחי 30 עבור microfuge צינורות 3 ו 4. העברת 600 μL של פתרון מכל microfuge לצינורות NMR.
  6. השיגו ספקטרום של 1 d NMR בכל דוגמה. עבד את הנתונים כדי להבטיח תיקון שגוי ותוכניות בסיסיות שטוחות.
  7. לחשב את אחוז ההמרה של מצע עבור ספקטרום הבקרה.
    1. שכבת-על של הספקטרום עבור 0 דקות ו-30 דקות של פקדים. שנה את קנה המידה של אות המצע בפקד 0 דקות כדי להתאים לפקד 30 דקות. שים לב לאחוז זה.
    2. חישוב ההמרה אחוז כמו (100 – אחוז נקבע בשלב 1.7.1).
  8. לחשב את אחוז ההמרה של מצע לתגובות המכילות מתחם בדיקה.
    1. ספקטרום שכבת-על עבור הפקד 0 דקות והתגובה הראשונה המכילה את מתחם הבדיקה 500 μM. שנה את קנה המידה של אות המצע בפקד 0 דקות כדי להתאים לספקטרום עם מתחם הבדיקה. שים לב לאחוז זה. חישוב אחוז המרה כמו (100-אחוז נקבע).
    2. חזור על התגובה השנייה המכילה את מתחם הבדיקה 250 μM.
  9. לחשב את התגובה אחוז ואת אחוז עכבות עבור כל ריכוז מתחם מבחן.
    1. לחשב את התגובה אחוז כמו (1.8.1/1.7.2) x 100.
    2. חשב את אחוז העכבות כמו (100 – אחוז שנקבע בשלב 1.9.1).

2. קביעת ערכי50 IC

  1. הכינו מצע ומתחם בדיקה לתגובות.
    1. הכנת פתרונות מניות של מצע (אדנוזין או 5-פלואורוורידיין) במים ו 10 מ"מ בדיקה במתחם DMSO. עיין בסעיף המבוא לריכוזים של פתרון מצע לשימוש.
  2. הכנת הדלעות סדרתיות של שטח בדיקה של 10 מ"מ (ב DMSO הדאוט).
    1. הוסף 36 μL שניוני עד חמישה 1.5 mL microfuge צינורות, 1 – 5.
    2. הוסף 12 μL 10 מ"מ מתחם הבדיקה לצינור 1 ולהקיש בקלילות כדי לערבב. מתחם הבדיקה הוא עכשיו 2.5 מ"מ.
    3. העבר 12 μL מצינור 1 לצינור 2 ולהקיש בקלילות כדי לערבב. מתחם הבדיקה הוא עכשיו 0.63 מ"מ. העבר 12 μL מצינור 2 לצינור 3 ולהקיש בקלילות כדי לערבב. מתחם הבדיקה הוא עכשיו 0.16 מ"מ. העבר 12 μL מצינור 3 לצינור 4 ולהקיש בקלילות כדי לערבב. מתחם הבדיקה הוא עכשיו 0.04 מ"מ. העבר 12 μL מצינור 4 לצינור 5 ולהקיש בקלילות כדי לערבב. מתחם הבדיקה הוא עכשיו 0.01 מ"מ.
  3. הכינו 14 1.5 mL microfuge צינורות לתגובות.
    1. הוסף 12 μL של מצע (אדנוזין או 5-פלואורולדין) לכל אחד 14 1.5 mL microfuge צינורות, 1-14.
    2. הוסף 12 μL של DMSO הדאוטים לצינורות 1 (0 דקות בקרה) ו -14 (30 דקות בקרה).
    3. הוסף 12 μL של 10 מ"מ מתחם בדיקה לצינורות 2 ו 3. הוסף 12 μL של 2.5 מ"מ מתחם מבחן כדי צינורות 4 ו 5. הוסף 12 μL של 0.63 מ"מ מתחם מבחן כדי צינורות 6 ו 7. הוסף 12 μL של 0.16 מ"מ מתחם מבחן לצינורות 8 ו -9. הוסף 12 μL של 0.04 מ"מ מתחם מבחן לצינורות 10 ו -11. הוסף 12 μL של 0.01 מ"מ מתחם מבחן לצינורות 12 ו -13.
  4. הכנת פתרון מלאי תגובה מספקת כדי להפעיל 15 תגובות המכילות 511 μL של מאגר, 60 μL של תחמוצת דאונטיום, ו-5 μL של פתרון אנזים (AGNH או לא) כל אחד. עיין בסעיף המבוא לריכוזים של פתרון אנזים לשימוש.
    1. הוסף 7.67 mL של מאגר התגובה (50 mM אשלגן פוספט, 0.3 M KCl, pH = 6.5) ל 15 מ"ל צינור חרוט. הוסף 900 μL של תחמוצת דאונטיום לצינור החרוט. הוסף 75 μL של פתרון אנזים (AGNH או הארה ב) אל החרוט.
    2. היפוך עדין של שפופרת החרוט 2x כדי לערבב.
  5. בצע את השלבים המתוארים בשלבים 1.3 – 1.9 (באמצעות 576 μL של פתרון מלאי התגובה) כדי לקבוע את התגובה האחוז עבור כל ריכוז מתחם מבחן.
  6. חישוב ערך IC50 באמצעות מנסרה.
    1. צור טבלת נתונים הקשורים יומן של בדיקת התגובה ריכוזי מורכבים (200 μM, 50 μM, 12.5 μM, 3.13 μM, 0.78 μM, 0.20 μM) עם תגובת אחוז (שני ערכים כל אחד).
    2. השתמש בעקומה לא לינארית כדי לקבוע את ערך ה-IC50 ושגיאת התקן.

3. אבקת מונה מסך המונה Assays ב 100 μM ו 50 μM

  1. הכינו מצע ומתחם בדיקה לתגובות.
    1. הכנת פתרונות מניות של מצע (אדנוזין או 5-פלואורוורידיין) במים ו 10 מ"מ בדיקה במתחם DMSO. עיין בסעיף המבוא לריכוזים של פתרון מצע לשימוש.
    2. הוסף 12 μL של מצע (אדנוזין או 5-פלואורולדין) על כל אחד שמונה 1.5 mL microfuge צינורות, 1 – 8.
    3. הוסף 6 μL של DMSO הדאוטים לצינורות 1 ו-5 (0 דקות בקרה) ו-4 ו-8 (30 דקות שליטה). הוסף 6 μL של תרכובת הבדיקה לצינורות 2 ו-6. הוסף 3 μL של תרכובת הבדיקה 3 μL של DMSO הדאוטים לצינורות 3 ו -7.
  2. הכנת פתרון מלאי תגובה מספקת ללא ניקוי כדי להפעיל חמש תגובות המכילות 517 μL של מאגר, 60 μL של תחמוצת דאונטיום, ו-5 μL של פתרון אנזים (AGNH או לא) כל אחד. עיין בסעיף המבוא לריכוזים של פתרון אנזים לשימוש.
    1. הוסף 2.59 mL של מאגר התגובה (50 mM אשלגן פוספט, 0.3 M KCl, pH = 6.5) ל 15 מ"ל צינור חרוט. הוסף 300 μL של תחמוצת דאונטיום לצינור החרוט. הוסף 25 μL של פתרון אנזים (AGNH או הארה ב) אל החרוט.
    2. היפוך עדין של שפופרת החרוט 2x כדי לערבב.
  3. הכנת פתרון מלאי תגובה מספקת עם 0.01% v/v טריטון X-100 אבקת להפעיל חמש תגובות המכילות 517 μL של מאגר, 60 μL של תחמוצת דאונטיום, ו-5 μL של פתרון אנזים (AGNH או לא) כל אחד.
    1. הוסף 2 μL של טריטון X-100 אבקת כביסה ל 20 מ מ של מאגר התגובה (50 mM אשלגן פוספט, 0.3 M KCl, pH = 6.5). יש להשתמש בפתרונות חומרי ניקוי תוך יום אחד.
    2. הוסף 2.59 mL של מאגר התגובה המכיל 0.01% טריטון X-100 אבקת כביסה ל 15 מ"ל צינור חרוט. הוסף 300 μL של תחמוצת דאונטיום לצינור החרוט. הוסף 25 μL של פתרון אנזים (AGNH או הארה ב) אל החרוט.
    3. היפוך עדין של שפופרת החרוט 2x כדי לערבב.
  4. עבור צינורות 1 – 4, באמצעות פתרון מניות התגובה ללא ניקוי, בצע את השלבים המתוארים בשלבים 1.3 – 1.9 כדי לקבוע את אחוז העיכוב עבור כל ריכוז במבחן מורכב.
  5. עבור צינורות 5 – 8, באמצעות פתרון מלאי התגובה עם 0.01% v/v הטריטון X-100 כביסה, בצע את השלבים המתוארים בשלבים 1.3 – 1.9 כדי לקבוע את אחוז העיכוב עבור כל ריכוז מתחם בדיקה.

4. קפיצה-דילול מונה המסך מאמר

  1. הכן את המצע ואת תרכובות הבדיקה לתגובות
    1. הכנת פתרונות מניות של מצע (אדנוזין או 5-פלואורוורידיין) במים ו 10 מ"מ בדיקה במתחם DMSO. עיין בסעיף המבוא לריכוזים של פתרון מצע לשימוש.
    2. הוסף 53.8 μL של מאגר התגובה (50 mM אשלגן פוספט, 0.3 M KCl, pH = 6.5) לשני 1.5 mL microfuge צינורות (כל אחד), 1 ו 2. הוסף 5 μL של אנזים (AGNH או לא) לצינורות 1 ו-2.
    3. הוסף 511 μL של מאגר התגובות שני 1.5 mL microfuge צינורות, 3 ו-4 (כל). הוסף 60 μL של תחמוצת דאומוניום לצינורות 3 ו-4. הוסף 5 μL של אנזים (AGNH או לא) לצינורות 3 ו-4.
    4. הוסף 1.2 μL של DMSO הדאומנטי לצינור 1 (30 דקות בקרה). הוסף 1.2 μL של מתחם הבדיקה לצינור 2. הוסף 12 μL של DMSO שניוני לצינור 3 (30 דקות בקרה). הוסף 12 μL של מתחם בדיקה לשפופרת 4. . מודקון למשך 30 דקות
  2. הכן 2 1.5 mL microfuge צינורות עם תמיסת דילול.
    1. הוסף 468 μL של מאגר התגובה לכל אחד 2 1.5 mL microfuge צינורות, 5 ו 6. הוסף 60 μL של תחמוצת דאומיום לכל צינור (5 ו-6).
  3. הכן ארבעה 1.5 mL microfuge צינורות עבור התגובות.
    1. הוסף 12 μL של מצע (אדנוזין או 5-פלואורולדין) לכל אחד מ-4 1.5 mL microfuge צינורות, 7 – 10.
  4. לבצע מדלל לקפוץ וליזום את התגובות.
    1. העבר 528 μL של הפתרון מצינור 5 לצינור 1. מנושף ומוותר על הדגימה פעמיים בצורה איטית אך מכוונת. העבר 528 μL של הפתרון מצינור 6 לצינור 2. מנושף ומוותר על הדגימה פעמיים בצורה איטית אך מכוונת.
    2. בזמן 0 דקות, העברת 588 μL של הפתרון מצינור 1 לצינור 7. מנושף ומוותר על הדגם 2x בצורה איטית אך מכוונת. במרווחי זמן של 30, העבר 588 μL של הפתרון מצינור 2 לצינור 8, צינור 3 לצינור 9, ו צינור 4 לצינור 10. מנושף ומוותר על הדגימה פעמיים בצורה איטית אך מכוונת. . חכה 30 דקות
  5. עבור צינורות 7 – 10, בצע את השלבים המתוארים בשלבים 1.5 – 1.9 כדי לקבוע את אחוז העכבות עבור כל ריכוז מתחם בדיקה.

5. כתוב בתרכובת E. coli שלמות התאים

  1. הכינו 10 מ ל תרבות לילה של E. coli ביום לפני ניסויים.
  2. הכינו תאי אי-קולי . לניסויי nmr
    1. צנטריפוגה את התאים ב 1 mL במשך 10 דקות ב 15,000 x g.
    2. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש כל סדרת מחלקים של תאים 1 מ ל של מאגר התגובה (50 mM אשלגן פוספט, 0.3 M kcl, pH = 6.5) על ידי vortexing.
  3. בצע את סעיפים 1 או 2 עבור הערך הרצוי עם השינויים הבאים:
    1. תחליף 280 μL של מאגר בפתרון מלאי התגובה עם 280 μL של תאים מושעה מחדש.
    2. תחליף 5 μL של אנזים (AGNH או הארה ב) בפתרון מניות התגובה עם 5 μL של מאגר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 2 מציג את התוצאות עבור בדיקת שתי תרכובות נגד agnh באמצעות 1H nmr לאחר סעיף 1. תגובת האנזים הוא נצפתה ביותר בקלות וכימות על ידי העלמות של אדנוזין סינגקל ובלתי מאפשרים מהדהד ב 8.48 ppm ו 6.09 ppm, בהתאמה, ואת המראה של אדנוטין סינגקל תהודה ב 8.33 לדפים לדקה כפי שנצפתה 30 דקות בקרת ספקטרום. בנוכחות של 500 μM מתחם 1, אין מוצר נוצר כפי שמעידים על ידי חוסר תהודה אדנין ב 8.33 ppm. בנוכחות של 250 μM תרכובת 1, כ -10% מהמצע הומר למוצר. לעומת זאת, הריכוז של מתחם 2 מעכב את האנזים כפי שמעידים המצע ומוצרי המוצר הדומים לאלה בספקטרום 30 דקות של שליטה. נתונים אלה מזוהים מתחם 1 כמעכב AGNH טוב. שימו לב כי התהודה הנובעת מתרכובת 1 (7.70-8:00 ו-8.50-8.60 ppm) ותרכובת 2 (7.40-7.80 ppm) גם הן נצפו. אותה מצע ומוצרי מוצר משמשים לניטור התגובות המוצגות באיור 4, איור 6, איור 8, ואיור 10. איור 3 מראה את התוצאות עבור בדיקת שתי תרכובות נגד לא באמצעות 19F nmr לאחר סעיף 1. תגובת האנזים הוא נצפתה בקלות, כימות על ידי העלמות של התהודה 5-fluorאוריאל ב-165.8 ppm ואת המראה של 5-fluorouracil תהודה ב-169.2 לדפים לדקה כפי שנצפתה בספקטרום 30 דקות הבקרה. עבור אנזים זה, מתחם 2 מעכב לחלוטין את התגובה בשני ריכוזי ואילו מתחם 1 אין השפעה. מידע זה מזהה מתחם 2 כחומר מעכבי טוב. אותה מצע ומוצרי מוצר משמשים לניטור התגובות המוצגות באיור 5, איור 7, איור 9 ואיור 11.

איור 4 מראה את הנתונים מינון-תגובה nmr וכתוצאה מכך IC50 עקומת המתקבל עבור תרכובת עם פעילות agnh באמצעות 1H nmr לאחר סעיף 2. נתוני NMR מוצגים רק עבור אחד מהנסיונות הכפולים. שימו לב כי התהודה הנובעת מהתרכובת הנבדקת (6.90-7.40 ppm) אינן מפריעות למצע או לתהודה של המוצר. The IC50 העקומה היה מתאים באמצעות נתונים משני הניסויים והביא ערך של 12.3 ± 5.0 μm. תוצאה זו היא עקבית עם נתוני NMR באובדן משמעותי של אות המצע לא נצפתה עד הריכוז המורכב מופחת ל 12.5 μM. איור 5 מראה את נתוני המינון-תגובה nmr וכתוצאה מכך50 IC העיקול המתקבל עבור תרכובת עם פעילות באמצעות 19F nmr לאחר סעיף 2. נתוני NMR מוצגים רק עבור אחד מהנסיונות הכפולים. The IC50 העקומה היה מתאים באמצעות נתונים משני הניסויים והביא ערך של 16.7 ± 10.4 μm. ערך זה תואם את נתוני NMR באובדן משמעותי של אות המצע לא נצפתה עד הריכוז המורכב מופחת ל 12.5 μM.

איור 6 מראה את התוצאות לבדיקת תרכובת בשני ריכוזים נגד agnh בהעדר ובנוכחות של 0.01% טריטון X-100 אבקת הניקוי באמצעות 1H nmr לאחר סעיף 3. רק הבדלים מינימליים הם נצפו בעוצמות של המצע ואותות המוצר באמצעות שני התנאים, המציין כי עיכוב האנזים נצפתה אינו חפץ של צבירה מורכבת. שימו לב כי התהודה הנובעת מהמתחם הנבדק (7.10-7.70 ppm) וטריטון X-100 (6.90 ו-7.40 ppm) אינם מפריעים למצע או מוצר. איור 7 מראה את התוצאות לבדיקת תרכובת בשני ריכוזים נגד היעדרות ונוכחות של 0.01% טריטון X-100 אבקת הניקוי באמצעות 19F nmr לאחר סעיף 3. רק הבדלים מינימליים הם נצפו בעוצמות של המצע ואותות המוצר באמצעות שני התנאים, המציין כי עיכוב האנזים נצפתה אינו חפץ של צבירה מורכבת.

איור 8 מראה את התוצאות לבדיקת תרכובת בשיטת הקפיצה-דילול נגד agnh באמצעות 1H nmr אחרי סעיף 4. העוצמה מופחתת של האות המצע ב 20 μM התגובה לעומת התגובה μM 200 מציין כי העיכוב הוא הפיך. התרכובת נבדק יש50 IC ערך של 21.0 μm, והתהודה שלה נצפו ב 6.90-20:30 לדקה. בדוגמה זו, מהדהד מן המתחם להפריע לאלה של האות מוצר אדנין, ואת התקדמות התגובה קל יותר לפקח באמצעות התהודה אדנוזין ב 6.09 ppm. איור 9 מראה את התוצאות לבדיקת תרכובת בשיטת הקפיצה לדילול נגד המשתמש 19F nmr אחרי סעיף 4. העוצמה המוגברת של האות מוצר ב-169.2 ppm בתגובה 20 μM בהשוואה לתגובת μM 200 מציין כי העיכוב הוא הפיך. התרכובת נבדק יש ערך IC50 של 16.7 μm.

איור 10 מראה את כלי השירות של השיטה לביצוע בחני ספר בתאים שלמים באמצעות 1H nmr אחרי סעיף 5. אותות המצע אדנוזין הם כמעט לחלוטין נעלם לאחר 30 דקות בנוכחות של תאים שלמים, המציין הידרוליזה של המצע. לעומת זאת, המצע נשאר ללא שינוי לאחר 30 דקות בנוכחות של מדיה צמיחת התאים supernatant, המציין כי תגובת הידרוליזה הוא תלוי בתאים. שימו לב לנוכחות של אותות רקע רבים בספקטרום הסופרנטאנט, כולל אותות עזים מ-NH4+ יונים ב-6.90-7.15 דפים לדקה, המצויים גם בדרגה קטנה יותר בספקטרום התאים כולו. איור 11 מראה את כלי השירות של השיטה לביצוע בחני ספר בתאים שלמים באמצעות 19F nmr לאחר סעיף 5. האות המצע 5-fluor, הוא נעלם לחלוטין לאחר 60 דקות בנוכחות של תאים שלמים, המציין הידרוליזה של המצע. לעומת זאת, המצע נשאר ללא שינוי לאחר 60 דקות בנוכחות של מדיה צמיחת התאים supernatant, המציינת כי תגובת ההידרוליזה היא תלויה בתאים.

Figure 1
איור 1: התגובות מזרז על ידי מו (למעלה) ו-AGNH (למטה). שימו לב כי אין לזרז את ההידרוליזה של שני אורידיין ו -5-פלואורואודין (מוצג). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הנציג הראשוני של המתחם ב500 μ M ו-250 μ M נגד AGNH באמצעות 1H nmr. מחוזות 1H nmr ספקטרום התגובה עבור שני תרכובות, כל אחד ב 500 μm ו 250 μm, יחד עם 0 דקות ו 30 דקות ספקטרום הבקרה. טווח הבקרה 0 דקות מכיל מהדהדת המצע אדנוזין ב 6.09, 8.38, ו 8.48 ppm. הספקטרום 30 דקות הבקרה מכיל תהודה חדשה של מוצר אדנין ב 8.33 ppm. ספקטרום הבדיקה מכיל מהדהד נוספים הנובעים מהמתחם שנבדק. מיכל בן H משמרות כימיות הצלבתי חומצה trimethylsilylpropionic חיצוני ב 0.0 ppm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הנציג הראשוני של המתחם ב500 μ M ו-250 μ M נגד השימוש ב- 19בבוקר אזורים של 19F nmr ספקטרום התגובה עבור שני תרכובות, כל אחד ב 500 μm ו 250 μm, יחד עם 0 דקות ו 30 דקות ספקטרום הבקרה. ספקטרום הבקרה של 0 דקות מכיל תהודה מצע 5-פלואורולדין ב-165.8 ppm. טווח 30 דקות הבקרה מכיל תהודה מוצר 5-fluorouracil חדש ב-169.2 ppm. מיכל בן 19 שינויים כימיים F הופנה חיצוני 50 μM trifluoroethanol ב-76.7 ppm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מינון התגובה הנציג נתונים NMR וכתוצאה מכך50 IC עקומת המתקבל עבור תרכובת עם פעילות agnh באמצעות 1H nmr. מחוזות 1H nmr ספקטרום התגובה עבור ריכוזי משתנים של תרכובת (200-0.20 μm) יחד עם 0 דקות ו 30 דקות ספקטרום הבקרה. מהדהד מ6.90-7.40 דפים לדקה נובעים מהמתחם נבדק. העקומה IC50 התאים באמצעות נתונים מ nmr ערכות נתונים להפעיל בשכפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מינון התגובה הנציג נתונים NMR וכתוצאה מכך IC50 מקבל עקומת המתקבל עבור תרכובת עם פעילות באמצעות 19F nmr. אזורים של 19F nmr ספקטרום התגובה עבור ריכוזי משתנים של תרכובת (200-0.20 μm) יחד עם 0 דקות ו 30 דקות ספקטרום הבקרה. העקומה IC50 התאים באמצעות נתונים מ nmr ערכות נתונים להפעיל בשכפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: כביסה הנציג מונה מסך המונה בחני עבור תרכובת עם פעילות agnh באמצעות 1H nmr. מחוזות 1H nmr ספקטרום התגובה עבור תרכובת ב 100 μm ו 50 μm, יחד עם 0 דקות ו 30 דקות ספקטרום הבקרה, בנוכחות והיעדרות של 0.01% טריטון X-100. התהודה ב-7.10-7.70 ppm ו 6.90 ו 7.40 דפים לדקה נובעים מהמתחם נבדק, טריטון X-100, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: כביסה הנציג מונה מסך המונה בחני אומר עבור תרכובת עם פעילות באמצעות 19F nmr. אזורים של 19F nmr ספקטרום התגובה עבור תרכובת ב 100 μm ו 50 μm, יחד עם 0 דקות ו 30 דקות ספקטרום הבקרה, בנוכחות והיעדרות של 0.01% טריטון X-100. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: לקפוץ הנציגה-דילול מונה המסך מאמר עבור תרכובת עם פעילות AGNH באמצעות 1H nmr. מחוזות 1H nmr ספקטרום התגובה עבור תרכובת ב 200 μM ו 20 μm, יחד עם 30 דקות ספקטרום שליטה. אנזים היה מודל 30 דקות ב 200 μM מתחם לפני תחילת התגובות, עם 20 μM התגובה מדולל מיד לפני התחלת התגובה. מהדהד ב6.90-20:30 עמודים לדקה נובעים מהמתחם נבדק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: לקפוץ הנציגה-דילול מונה המסך מאמר עבור תרכובת עם פעילות באמצעות 19F nmr. אזורים של 19F nmr ספקטרום התגובה עבור תרכובת ב 200 μM ו 20 μm, יחד עם 30 דקות ספקטרום שליטה. אנזים היה מודל 30 דקות ב 200 μM מתחם לפני תחילת התגובות, עם 20 μM התגובה מדולל מיד לפני התחלת התגובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 10
איור 10: מאמר הנציגים בתאים שלמים באמצעות 1H nmr. מחוזות 1H nmr ספקטרום התגובה עבור דגימות המכילות או 280 μl של E. coli תאים מחדש מושעה במאגר (0, 15, ו 30 דקות) או מדיה צמיחת התאים supernatant (30 דקות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 11
איור 11: מאמר הנציג בתאים שלמים באמצעות 19F nmr. אזורים של 19F nmr ספקטרום התגובה עבור דגימות המכילות או 280 Μl של E. coli תאים מחדש מושעה במאגר (0, 15, 30, ו 60 דקות) או מדיה צמיחת תאים supernatant (60 דקות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקולים המתוארים הם חלים בדרך כלל על אנזימים רבים, בתנאי כי מצעים ו/או מוצרים יש אותות הניתנים לפתירה בספקטרום NMR. עם זאת, חשוב כי ריכוז המצע קרוב לערך Km שלה מספיק גבוה כדי להתגלות בניסוי nmr בתוך פרק זמן סביר. המצע ריכוז לא גבוה יותר 2-3x ערך Km הוא אופטימלי לגילוי תחרותי, לא תחרותי, מעכבי בלתי תחרותיים4. כפי שמוצג כאן עבור ה, המצע, ערכי Km נמוך כמו 15 μm מתאימים. השימוש של מצעים עם CH3 או CF3 אותות, ביחד עם אוסף נתונים nmr על בדיקה קריוגניים, יכול להוריד את הסף עוד יותר15. אנזימים בעלי ערכי המצע Km מתחת 1 μm, עם זאת, סביר להניח שקשה ללמוד באמצעות שיטה זו בשל הרגישות הנמוכה הטבועה של ניסוי nmr. במצבים אלה, ספקטרופוטומטר או ספקטרוסקופיית הקרינה הם טכניקות מתאימות יותר.

מגבלה נוספת ליישום של שיטות אלה הוא סוכן מתאים מקוצ'ינג. כל הפרוטוקולים המתוארים כאן הם קבוע בזמן, כאשר התגובה היתה לאחר 30 דקות על ידי תוספת של HCl. לשני הצדדים, זה נקבע בעבר כי HCl עצרה מיד את התגובה, ושמרה על כך לתקופות של שבועות9,10. זה חשוב מאז עשרות תגובות מופעל לעתים קרובות במקביל ולאחר מכן בתור עבור איסוף נתונים NMR על פני תקופה של מספר שעות. חשוב גם לקבוע כי השפלה שאינה אנזימטית של המצע או אותות המוצר לא מתרחשים בעקבות לקוצ'ינג אבל לפני איסוף נתונים NMR. בנוסף HCl, דרכים נפוצות אחרות כדי להרוות את התגובות הן על-ידי תוספת של מעכב nanomolar ידוע16 או, במקרה של תגובות מעורבים אדנוזין triphosphate, תוספת של הסוכן הכל-התרופה המכונה חומצה אצטית17.

Nmr-מבוסס על פעילות מבוססת לספק ערך מוסף כאשר נעשה שימוש עבור הקרנת קטע או אורתוגונלית בחני לאמת התפוקה גבוהה ההקרנה להיטים4. בניגוד מחייב המחייב, nmr מבוססי פעילות בחני לזהות או לאשר תרכובות כמו מעכבי בפועל. בנוסף, הפעילות משתמשת באנזים המטרה הרבה פחות מאשר הכריכה מחייבת. אותן שיטות מאוד חזקות לשני סוגים של מסכי מונה שבוצעו כדי לאמת פעילות הפיכה, ספציפית למטרה ולשלול פעילות שיטה מסוימת18. חומרי ניקוי ולקפוץ-דילול הם מסכי-נגד עבור צבירה הקולאידית19 ו עיכוב בלתי הפיך20, בהתאמה. תרכובות העוברות בדיקות אלה מאומתים נקודות מתחילות עבור כימיה מרפא ומבנה-אופטימיזציה מונחית המעכב. הפעילות NMR מבוסס מאמר יכול להמשיך לספק נתוני פעילות מורכבת כאשר הפרויקט מתקדם לכיוון מעכבי nanomolar.

בסופו של דבר, כלי השירות של בחני עבור תגובות ניטור בתאים שלמים הוא ראוי לציון21. בניגוד לעיכוב של אנזים מטוהר עם עיכוב של אנזים בתוך התא יספק הוכחה מוחלטת של המנגנון הביוכימי בבסיס האפקט פנוטימית שנצפתה22. עבור שני האנזימים המוצגים כאן, ההשפעה הרצויה הפנוטימית היא אובדן של יכולת הקיום (פעילות antitrichomonal). מתאם בין עיכוב אנזים מטוהר, עיכוב אנזים בתוך התא, ומוות של תאים טפיל מהווה הוכחה למנגנון המדכא של הפעולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים לד ר הדיקן בראון על מתן תרכובות מספריית החלקים של אסטרזמקה וד ר דוד פרקין למתן אנזימים בעלי הדין והאנזים. המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת הפרס מספר R15AI128585 ל B. J. S. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. המחקר נתמך גם על ידי מלגת מחקר הקיץ של הוראס ג'י מק הוענק ל-S. N. M, משפחת לנדסברג המענק הוענק לג א., ולמענקים לפיתוח הפקולטה ולפרס פרדריק בטלהיים מאוניברסיטת אדלפי, לשנת B. J.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AGNH Purified in-house N/A TVAG_213720
UNH Purified in-house N/A TVAG_092730
Adenosine Sigma A9251
5-Fluorouridine Sigma F5130
Dimethyl sulfoxide-D6 Cambridge Isotope Labs DLM-10-100 D, 99.9%
Potassium phosphate monobasic Sigma P0662
Potassium phosphate dibasic Sigma P3786
Potassium chloride Sigma P9541
Deuterium oxide Cambridge Isotope Labs DLM-4-100 D, 99.9%
Hydrochloric acid Fisher Chemical A144212
Triton X-100 Sigma X100
3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP) Sigma 269913 D, 98%
2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2 Sigma 612197 D, 99.5%
Pipette Gilson F123602 PIPETMAN Classic P1000
Pipette Gilson F123601 PIPETMAN Classic P200
Pipette Gilson F123600 PIPETMAN Classic P20
Microfuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
Conical tubes Corning 352099
Microcentrifuge Eppendorf 5418
Vortex mixer Fisher Scientific 02215365
NMR tubes Norell 502-7 Or as appropriate for the NMR
NMR spectrometer Bruker N/A AvanceIII500
Prism software GraphPad N/A Version 5.04

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. NMR in Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1981).
  2. Evans, J. N. S. Biomolecular NMR spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1995).
  3. Dalvit, C., et al. A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening. Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).
  4. Dalvit, C. Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery. Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).
  5. Stockman, B. J., et al. Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments. Chemical Biology & Drug Design. 73, 179-188 (2009).
  6. Hirt, R. P., Sherrard, J. Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations. Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).
  7. Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world. Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).
  8. Versées, W., Steyaert, J. Catalysis by nucleoside hydrolases. Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).
  9. Shea, T. A., et al. Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).
  10. Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).
  11. Muellers, S. N., et al. Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase. ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).
  12. Veronesi, M., et al. Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells. Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).
  13. Holzgrabe, U. Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications. Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).
  14. Bharti, S. K., Roy, R. Quantitative 1H NMR spectroscopy. Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).
  15. Dalvit, C., et al. Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications. Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).
  16. Lambruschini, C., et al. Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH. ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).
  17. Stockman, B. J. 2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening. Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).
  18. Aldrich, C., et al. The ecstasy and agony of assay interference compounds. ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).
  19. Feng, B. Y., Shoichet, B. K. A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors. Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).
  20. Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis. Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).
  21. Griveta, J. -P., Delort, A. -M. NMR for microbiology: In vivo and in situ applications. Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).
  22. Nijman, S. M. B. Functional genomics to uncover drug mechanism of action. Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).

Tags

כימיה סוגיה 148 מונה ניקוי מסך שיטת פעילות אנזים IC50 ערך לקפוץ-דילול 1H nmr 19F NMR כל תא nmr נוקלאוטיו הריבוקלז
NMR-מבוסס על פעילות מבוססת על קביעת עיכוב מורכבים, IC<sub>50</sub> ערכים, פעילות פרועובדתית, ואת הפעילות התא כולו של נוקלאוטילסייד הריבוליטיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stockman, B. J., Kaur, A., Persaud,… More

Stockman, B. J., Kaur, A., Persaud, J. K., Mahmood, M., Thuilot, S. F., Emilcar, M. B., Canestrari, M., Gonzalez, J. A., Auletta, S., Sapojnikov, V., Caravan, W., Muellers, S. N. NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases. J. Vis. Exp. (148), e59928, doi:10.3791/59928 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter