Summary
基于NMR的活性测定已经开发出来,以识别和表征两种核苷糖酶的抑制剂。为500μM和250μM的初始化合物测定、确定IC50值的剂量反应测定、洗涤剂计数器屏幕测定、跳跃稀释计数器筛查测定以及大肠杆菌全细胞测定提供了协议。
Abstract
NMR光谱学通常用于药物发现中酶抑制剂的鉴定和表征,特别是在片段筛选方面。基于 NMR 的活性测定非常适合在检测这些较弱抑制剂所需的较高浓度的测试化合物下工作。NMR 实验中的动态范围和化学移位分散可以很容易地解决基材、产品和测试化合物的共振。这与分光光度测定形成对比,在分光光度测定中,读出干扰问题通常产生于具有重叠的UV-对吸收谱的化合物。此外,由于它们缺乏报告酶,单酶NMR检测不易出现耦合检测假阳性。此属性使它们作为正交测定非常有用,补充了传统的高通量筛选测定和台面分诊测定。为500μM和250μM的初始化合物测定、确定IC50值的剂量反应测定、洗涤剂计数器屏幕测定、跳跃稀释计数器筛查和大肠杆菌全细胞测定提供了详细的方案。使用两种核苷核氢酶演示了该方法。显示1 HNMR 用于纯素特异性酶,而19F NMR 用于苯丙胺特异性酶。这些协议通常适用于任何酶,其中基质和产品共振可以通过NMR光谱观察和区分。为了在药物发现方面最有用,基质的最终浓度不应超过其K m值的2-3倍。NMR 实验的选择取决于可用的酶反应和基质以及可用的 NMR 仪器。
Introduction
核磁共振(NMR)光谱是公认的特征和监测酶反应1,2。化学移变和耦合模式的差异用于区分基板和产品共振,相对共振强度用于量化反应百分比。在NMR光谱中直接观察基板的消耗和产品的产生。这与分光光度或荧光光谱不同,在光谱中,反应时间过程由由于某些化学物种被消耗或产生的吸收力变化来指示。与其他方法一样,NMR 可用于研究酶反应作为温度、pH 或其他溶液条件的函数,并可以确定抑制剂的作用。
最近,基于NMR的酶活性测定已经用于片段筛选3,4。基于 NMR 的检测非常适合检测这些较弱抑制剂所需的较高浓度的测试化合物(通常高达 1 mM)。NMR 实验中的动态范围和化学移位色散可以很容易地解决基材、产品和测试化合物的共振。这与分光光度测定相比,光谱光度测定通常产生与紫外线吸收谱重叠的化合物的读出干扰问题。此外,由于它们缺乏报告酶,单酶NMR检测不易出现耦合检测假阳性。这一优势使它们作为正交测定非常有用,补充了传统的高通量筛选测定和台面分诊测定5。
在我们的研究实验室中,基于 NMR 的活动测定用于识别和评估阴道核苷核氢酶的三氯环比抑制剂。T. 阴道寄生虫引起最普遍的非病毒性传播疾病6.增加对现有疗法7的抗药性正在推动对新型机制治疗的需求,基本核苷抢救通路酶代表主要目标8。基于NMR的活性测定已经开发用于苯丙胺和紫基苯基特异性酶、尿苷核苷核糖酸酶(UNH)9和腺苷/瓜诺辛首选核苷核氢酶(AGNH)10。这两种酶催化的反应如图1所示。NMR检测用于筛选化学起始点的片段库,确定IC50值,并清除基于聚合或共价结合抑制剂11。同样的测定也被翻译来评估整个细胞的酶活性12。
为500μM和250μM的初始化合物测定、确定IC50值的剂量反应测定、洗涤剂计数器屏幕测定、跳跃稀释计数器筛查和大肠杆菌全细胞测定提供了详细的方案。这些协议通常适用于任何酶,其中基质和产品共振可以通过NMR光谱观察和区分。为简单起见,提出了三个假设。首先,未指定基板。对于基于 NMR 的活动测定有用的,基板的最终浓度不应超过Km值4的 2-3 倍。在所展示的示例中,腺苷和5-氟鲁里丁的最终浓度分别为100μM(Km =54 μM)和50μM(Km = 15 μM)。在协议中,达到这些浓度对应于12 μL的5 mM腺苷或12μL的2.5 mM 5氟鲁里丁。
其次,选择协议中规定的酶量5μL,与在30分钟内使基质转化为产品所需的量相对应。此数量通常表示纯化酶库存的较大稀释,并且必须提前确定每种酶的稀释。纯化的AGNH和UNH酶储存溶液储存在-80°C的等分中,为数千次反应提供足够的酶。因此,稀释因子理想情况下只需要每隔几个月确定或验证一次。第三,未指定特定的 1D NMR 实验。在代表性结果中,为AGNH10显示1H NMR,为UNH9显示19FNMR,并在相应的参考中描述了NMR实验。NMR 实验的选择取决于可用的酶反应和基质以及可用的 NMR 仪器。最后,应该指出,所述的实验方法不符合定量NMR(qNMR)13、14的严格要求。在协议中,使用每个光谱中相同共振强度的相对变化,而不是通过确定绝对浓度来确定百分比反应。此方法消除了数据采集和处理修改以及 qNMR 所需的内部或外部标准的需求。
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Protocol
1. 500 μM和250 μM的初始测试化合物测定
- 准备基质和测试化合物以进行反应。
- 在水和50 mM测试化合物中制备基质(腺苷或5-氟鲁丁)的原料溶液和脱硫二甲基硫酸盐(DMSO)中的50 mM测试化合物。有关要使用的基板溶液的浓度,请参阅简介部分。
- 在四个 1.5 mL 微熔管中各加入 12 μL 的基板(腺苷或 5 氟鲁利丁),1⁄4。
- 将 6 μL 的脱化 DMSO 添加到管 1(0 分钟控制)和 4(30 分钟控制)。在管2中加入6μL的测试化合物。在管3中加入3μL的测试化合物和3μL的脱化DMSO。
- 准备足够的反应库溶液。
注:库存溶液适用于五种反应,每种反应都含有517μL的缓冲液、60μL的氧化铀和5μL的酶溶液(AGNH或UNH)。有关要使用的酶溶液浓度,请参阅导言部分。- 将2.59 mL的反应缓冲液(50mM磷酸钾,0.3M KCl,pH 6.5)加入15 mL锥形管。在锥形管中加入300 μL的氧化铀。在锥形中加入25μL的酶溶液(AGNH或UNH)。
- 轻轻反转锥形管两次以混合。
- 同时启动和淬火 0 分钟控制反应。将582 μL的反应原料溶液转移到干净的微熔管中。在此微熔管中加入 10 μL 的 1.5 M HCl。将组合的 592 μL 转移到微熔管 1。以缓慢但有意的方式吸气并分配样品两次。
- 以交错的方式启动并运行其余三个反应。在0分钟时,将582μL的反应管溶液转移到微熔管2。以缓慢但有意的方式吸气并分配样品两次。对微熔管 3 和 4 每隔 30 秒重复。等待 30 分钟。
- 克声反应。在时间 30 分钟时,将 10 μL 的 1.5 M HCl 添加到微fuge 2 中。对微熔管 3 和 4 每隔 30 秒重复。将600 μL溶液从每个微熔转移到NMR管。
- 在每个样品上获取一个1D NMR频谱。处理数据以确保正确的相位和平坦基线。
- 计算控制光谱基板的百分比转换。
- 覆盖光谱 0 分钟和 30 分钟控制。在 0 分钟控制中缩放基板信号以匹配 30 分钟控制。请注意此百分比。
- 计算百分比转换(100 = 步骤 1.7.1 中确定的百分比)。
- 计算含有测试化合物的反应基板的百分比转换。
- 覆盖光谱,用于 0 分钟控制和包含 500 μM 测试化合物的第一反应。在 0 分钟控制中缩放基板信号,使光谱与测试化合物相匹配。请注意此百分比。计算百分比转换(100 = 确定百分比)。
- 对含有250μM测试化合物的第二反应重复上述步骤。
- 计算每个测试化合物浓度的反应百分比和抑制百分比。
- 计算反应百分比为 (1.8.1/1.7.2) x 100。
- 计算抑制百分比(100 = 步骤 1.9.1 中确定的百分比)。
2. 确定 IC50值
- 准备基质和测试化合物以进行反应。
- 在水和10 mM测试化合物中制备基板(腺苷或5-氟鲁利丁)的库存溶液。有关要使用的基板溶液的浓度,请参阅简介部分。
- 准备10 mM测试化合物的连续稀释(在脱化DMSO中)。
- 将 36 μL 脱化 DMSO 添加到 5 个 1.5 mL 微熔管中,1⁄5。
- 将12μL 10 mM测试化合物加入管1,轻轻敲击混合。测试化合物现在是2.5 mM。
- 将 12 μL 从管 1 转移到管 2,轻轻敲击以混合。测试化合物现在是0.63 mM。将 12 μL 从管 2 转移到管 3,轻轻敲击以混合。测试化合物现在是0.16 mM。将 12 μL 从管 3 转移到管 4,轻轻敲击以混合。测试化合物现在为 0.04 mMM。将 12 μL 从管 4 转移到管 5,轻轻敲击以混合。测试化合物现在为 0.01 mMM。
- 准备14个1.5 mL微熔管进行反应。
- 在14个1.5 mL微熔管中加入12μL的基板(腺苷或5-氟鲁里丁),1-14。
- 将 12 μL 的脱化 DMSO 添加到管 1(0 分钟控制)和 14(30 分钟控制)。
- 将10 mM测试化合物的12 μL加入管2和3。将12 μL的2.5 mM测试化合物加入管4和5。在管6和7中加入12μL的0.63 mM测试化合物。在管 8 和 9 中加入 12 μL 的 0.16 mM 测试化合物。将12 μL的0.04 mM测试化合物加入管10和11。将12 μL的0.01 mM测试化合物加入管12和13。
- 准备足够的反应库溶液,以运行15个反应,每个反应含有511μL的缓冲液、60μL的氧化铀和5μL的酶溶液(AGNH或UNH)。有关要使用的酶溶液浓度,请参阅导言部分。
- 将7.67 mL的反应缓冲液(50 mM磷酸钾,0.3 M KCl,pH = 6.5)加入15 mL锥形管。在锥形管中加入900 μL的氧化铀。在锥形中加入75μL的酶溶液(AGNH或UNH)。
- 轻轻反转锥形管 2x 以混合。
- 按照步骤 1.3_1.9 到 (使用 576 μL 的反应库存溶液) 中概述的步骤,确定每个测试化合物浓度的反应百分比。
- 使用图形板棱镜计算 IC50值。
- 创建一个数据表,将反应测试化合物浓度的日志(200 μM、50 μM、12.5 μM、3.13 μM、0.78 μM、0.20 μM)与反应百分比(各两个值)相关联。
- 使用非线性曲线拟合来确定 IC50值和标准误差。
3. 100 μM 和 50 μM 的洗涤剂计数器筛选测定
- 准备基质和测试化合物以进行反应。
- 在水和10 mM测试化合物中制备基板(腺苷或5-氟鲁利丁)的库存溶液。有关要使用的基板溶液的浓度,请参阅简介部分。
- 在8个1.5 mL微熔管中各加入12μL的基板(腺苷或5-氟鲁里丁),1⁄8。
- 将 6 μL 的脱化 DMSO 添加到管 1 和 5(0 分钟控制)和 4 和 8(30 分钟控制)。在管2和6中加入6μL的试验化合物。在管3和7中加入3μL的测试化合物和3μL的脱化DMSO。
- 准备足够的反应库存溶液,无需洗涤剂,以运行五种反应,每个反应含有517μL的缓冲液、60μL的氧化铀和5μL的酶溶液(AGNH或UNH)。有关要使用的酶溶液浓度,请参阅导言部分。
- 将2.59 mL的反应缓冲液(50 mM磷酸钾,0.3 M KCl,pH = 6.5)加入15 mL锥形管。在锥形管中加入300 μL的氧化铀。在锥形中加入25μL的酶溶液(AGNH或UNH)。
- 轻轻反转锥形管 2x 以混合。
- 用 0.01% v/v Triton X-100 洗涤剂制备足够的反应液,以运行五种反应,每个反应包含 517 μL 的缓冲液、60 μL 的氧化铀和 5 μL 的酶溶液(AGNH 或 UNH)。
- 在20 mL的反应缓冲液(50 mM磷酸钾,0.3 M KCl,pH = 6.5)中加入2μL的Triton X-100洗涤剂。洗涤剂溶液必须在1天内使用。
- 将含有0.01%Triton X-100洗涤剂的反应缓冲液加入2.59 mL,加入15 mL锥形管。在锥形管中加入300 μL的氧化铀。在锥形中加入25μL的酶溶液(AGNH或UNH)。
- 轻轻反转锥形管 2x 以混合。
- 对于管1⁄4,使用无洗涤剂的反应库溶液,按照步骤1.3~1.9中概述的步骤确定每个测试化合物浓度的抑制百分比。
- 对于管 5⁄8,使用反应库溶液与 0.01% v/v Triton X-100 洗涤剂,按照步骤 1.3_1.9 中概述的步骤确定每个测试化合物浓度的抑制百分比。
4. 跳跃稀释计数器检测
- 准备基板和测试化合物以进行反应
- 在水和10 mM测试化合物中制备基板(腺苷或5-氟鲁利丁)的库存溶液。有关要使用的基板溶液的浓度,请参阅简介部分。
- 将53.8 μL的反应缓冲液(50 mM磷酸钾,0.3M KCl,pH = 6.5)加入两个1.5 mL微电管(每个),1和2。在管1和2中加入5μL酶(AGNH或UNH)。
- 将511 μL的反应缓冲液加入两个1.5 mL微熔管,3和4(各)。在管3和4中加入60μL的氧化铀。在管3和4中加入5μL酶(AGNH或UNH)。
- 将1.2 μL的脱化DMSO添加到管1(30分钟控制)。将1.2 μL的测试化合物加入管2。在管 3(30 分钟控制)中加入 12 μL 的脱化 DMSO。在管4中加入12μL的测试化合物。孵育30分钟。
- 用稀释溶液制备两个1.5 mL微熔管。
- 在两个1.5 mL微熔管(5和6)中各加入468μL反应缓冲液。在每个管中加入60 μL的氧化铀(5和6)。
- 为反应准备四个 1.5 mL 微熔管。
- 在四个 1.5 mL 微熔管中各加入 12 μL 的基板(腺苷或 5 氟鲁利丁),7-10。
- 执行跳跃稀释并启动反应。
- 将 528 μL 溶液从管 5 转移到管 1。以缓慢但有意的方式吸气并分配样品两次。将 528 μL 溶液从管 6 转移到管 2。以缓慢但有意的方式吸气并分配样品两次。
- 在 0 分钟时,将 588 μL 溶液从管 1 转移到管 7。以缓慢但有意的方式吸气并分配样品 2 倍。以30秒的间隔,将588μL溶液从管2转移到管8,管3转移到管9,管4转移到管10。以缓慢但有意的方式吸气并分配样品两次。等待 30 分钟。
- 对于管 7_10,按照步骤 1.5_1.9 中概述的步骤确定每个测试化合物浓度的抑制百分比。
5.大肠杆菌全细胞中的化合物测定
- 在实验前一天制备10mL大肠杆菌过夜培养。
- 为NMR实验准备大肠杆菌细胞。
- 在15,000 x g下将细胞在1mL等分中离心10分钟。
- 通过涡旋,丢弃上清液,将每个等分的细胞重新悬浮在1 mL的反应缓冲液中(50 mM磷酸钾,0.3M KCl,pH = 6.5)。
- 按照第 1 节或第 2 节进行所需的测定,并进行以下更改:
- 在反应液溶液中用280μL的再悬浮细胞替换280μL的缓冲液。
- 用5μL的缓冲液在反应液中替换5μL的酶(AGNH或UNH)。
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Representative Results
图 2显示了在第 1 节之后使用1 HNMR 对 AGNH 测试两种化合物的结果。酶反应最容易观察到和量化,分别于8.48 ppm和6.09 ppm的腺苷单次共振和双子共振的消失,以及30分钟对照中观察到的8.33 ppm腺苷单次共振的出现谱。在存在500μM化合物1的情况下,没有形成任何产物,在8.33 ppm时缺乏脱位共振就证明了这一点。在存在250μM化合物1的情况下,大约10%的基板已转化为产品。相比之下,化合物2的浓度都不能抑制酶,其基质和产品共振类似于30分钟控制光谱中的酶。该数据将化合物1识别为良好的AGNH抑制剂。请注意,还观察到化合物1(7.70-8.00和8.50-8.60 ppm)和化合物2(7.40-7.80 ppm)产生的共振。相同的基板和产品共振用于监测如图4所示的反应,图6,图8和图10。图 3显示了在第 1 节之后使用19F NMR 对 UNH 测试两种化合物的结果。酶反应很容易观察到和量化,在-165.8 ppm时5-氟鲁丁共振消失,在-169.2ppm时出现5-氟尿酸共振,在30分钟控制光谱中观察到。对于这种酶,化合物2完全抑制两种浓度的反应,而化合物1没有效果。这些数据将化合物2确定为良好的UNH抑制剂。相同的基板和产品共振用于监测如图5所示的反应,图7,图9和图11。
图4显示了剂量-响应NMR数据,以及第2节后面使用1HNMR为AGNH活性化合物获得的剂量-反应NMR数据和结果IC50曲线。仅针对其中一个重复试验显示 NMR 数据。请注意,经测试的化合物(6.90-7.40 ppm)产生的共振不会干扰基材或产品共振。IC50曲线使用两个试验的数据进行拟合,结果值为 12.3 ± 5.0 μM。此结果与 NMR 数据一致,因为直到化合物浓度降至 12.5 μM,才会观察到基板信号的显著损失。图5显示了剂量-响应NMR数据,以及第2节后面使用19FNMR为具有UNH活性的化合物获得的IC50曲线。仅针对其中一个重复试验显示 NMR 数据。IC50曲线使用两个试验的数据进行拟合,结果值为 16.7 ± 10.4 μM。此值与 NMR 数据一致,因为在化合物浓度降至 12.5 μM 之前,不会观察到基板信号的显著损失。
图6显示了在缺少和存在0.01%Triton X-100洗涤剂的情况下,使用1个H NMR在第3节下对AGNH进行两浓度的化合物测试的结果。使用这两个条件,在基质的强度和产品信号中只观察到最小差异,这表明观察到的酶抑制不是化合物聚合的伪影。请注意,经测试的化合物(7.10-7.70 ppm)和Triton X-100(6.90 和 7.40 ppm)产生的共振不会干扰基板或产品共振。图7显示了在缺少和存在0.01%Triton X-100洗涤剂的情况下,使用19F NMR对UNH进行两浓度的化合物测试的结果。第3节之后。使用这两个条件,在基质的强度和产品信号中只观察到最小差异,这表明观察到的酶抑制不是化合物聚合的伪影。
图 8显示了在第 4 节之后使用1H NMR 对 AGNH 进行跳跃稀释测定中的化合物测试的结果。与200μM反应相比,20μM反应中的基板信号强度降低,表明抑制是可逆的。经测试的化合物的IC50值为21.0μM,其共振为6.90-8.30 ppm。在此示例中,来自化合物的共振干扰腺苷产品信号的共振,使用 6.09 ppm 的腺苷共振更容易监测反应进度。图 9显示了在第 4 节之后使用19F NMR 对 UNH 的跳跃稀释测定中测试化合物的结果。与200μM反应相比,20μM反应中-169.2ppm的产品信号强度增加,表明抑制是可逆的。经测试的化合物的IC50值为16.7μM。
图10显示了第5节下用1个H NMR在全细胞中执行检测的方法的效用。腺苷基质信号在30分钟后在全细胞存在时几乎完全消失,表明基质的水解。相比之下,在细胞生长培养素存在30分钟后,基质保持不变,表明水解反应与细胞相关。请注意,上清光谱中存在许多背景信号,包括来自 NH4的强三重信号-离子在 6.90-7.15 ppm 处,这些信号在整个细胞光谱中也存在较小的程度。图11显示了第5节下第19个F NMR在全细胞中执行检测的方法的效用。5-氟鲁丁基质信号在60分钟后在全细胞存在时完全消失,表明基材的水解。相比之下,在细胞生长培养素存在60分钟后,基质保持不变,表明水解反应与细胞相关。
图1:由UNH(上)和AGNH(下图)催化的反应。请注意,UNH将催化尿氨酸和5-氟鲁里丁的水解(如图所示)。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:500时代表性初始化合物测定·M 和 250·使用1H NMR 对 AGNH的 M 。两种化合物的1H NMR反应光谱区域,每个化合物在500μM和250μM,以及0分钟和30分钟控制光谱。0 分钟控制光谱包含腺苷基质共振,在 6.09、8.38 和 8.48 ppm 时。30 分钟控制频谱包含新的阿地宁产品共振,速度为 8.33 ppm。测试光谱包含从测试化合物产生的额外的共振。1H化学移位被引用到0.0 ppm的外部三甲基丙烯酸。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:500时代表性初始化合物测定·M 和 250·M 使用19F NMR 对抗 UNH.两种化合物的19F NMR 反应光谱区域,每个化合物在 500 μM 和 250 μM 下,以及 0 分钟和 30 分钟控制光谱。0 分钟控制光谱包含 5 氟鲁丁基质共振,在 -165.8 ppm。30 分钟控制频谱包含新的 5 氟拉西尔产品共振,速度为 -169.2 ppm。19F 化学转移被引用到外部50μM三氟乙醇在-76.7 ppm。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:使用1HNMR获得AGNH活性化合物的代表性剂量-响应NMR数据和所得IC50曲线。1H NMR 反应光谱的区域,用于化合物 (200-0.20 μM) 的可变浓度以及 0 分钟和 30 分钟控制光谱。6.90-7.40 ppm 的共振来自被测试化合物。IC50曲线使用重复运行的 NMR 数据集的数据适合。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:使用19FNMR获得的具有代表性的剂量-响应NMR数据和所得的IC50曲线,用于具有UNH活性的化合物。19F NMR 反应光谱的区域,用于化合物 (200-0.20 μM) 的可变浓度以及 0 分钟和 30 分钟控制光谱。IC50曲线使用重复运行的 NMR 数据集的数据适合。请点击此处查看此图的较大版本。
图6:使用1H NMR对AGNH活性化合物的代表性洗涤剂计数器筛查。1H NMR 反应光谱的区,在 100 μM 和 50 μM 的化合物,以及 0 分钟和 30 分钟控制光谱,在存在和不存在 0.01% Triton X-100 的情况下。7.10-7.70 ppm 和 6.90 和 7.40 ppm 的共振分别来自被测试化合物和 Triton X-100。请点击此处查看此图的较大版本。
图7:使用19F NMR对具有UNH活性的化合物进行代表性洗涤剂计数器筛选测定。 19F NMR 反应光谱的区,在 100 μM 和 50 μM 的化合物,以及 0 分钟和 30 分钟控制光谱,存在和不存在 0.01% Triton X-100。请点击此处查看此图的较大版本。
图8:使用1H NMR对AGNH活性化合物的代表性跳跃稀释计数器检测。 200 μM和20 μM化合物的1HNMR反应光谱区域,以及30分钟控制光谱。在反应开始前,酶在200μM化合物下孵育30分钟,在开始反应前立即稀释20μM反应。6.90-8.30 ppm 的共振来自被测试化合物。请点击此处查看此图的较大版本。
图9:使用19F NMR对具有UNH活性的化合物进行代表性跳跃稀释计数器检测。200 μM和20 μM化合物的19F NMR反应光谱区域,以及30分钟控制光谱。在反应开始前,酶在200μM化合物下孵育30分钟,在开始反应前立即稀释20μM反应。请点击此处查看此图的较大版本。
图10:使用1个H NMR在整个细胞中进行代表性测定。含有280μL的大肠杆菌细胞在缓冲液中重新悬浮(0、15和30分钟)或细胞生长培养素上清(30分钟)的样品的1H NMR反应光谱区域。 请点击此处查看此图的较大版本。
图11:使用19F NMR在整个细胞中进行代表性测定。含有280μL的大肠杆菌细胞在缓冲液中重新悬浮(0、15、30和60分钟)或细胞生长培养素上清(60分钟)的样品的19FNMR反应光谱区域。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
所述协议通常适用于许多酶,前提是基质和/或产品在 NMR 频谱中具有可解析的信号。然而,基板的浓度必须接近其K m值,且足够高,足以在合理的时间范围内在NMR实验中检测到,这一点至关重要。基板浓度不高于K m值的2-3倍,是检测竞争、非竞争性和非竞争性抑制剂4的最佳值。如此处对 UNH 所示,基板Km值低至 15 μM 是合适的。使用带有CH3或CF 3信号的基板,加上低温探头上的NMR数据收集,可以进一步降低这一阈值15。然而,基质K m值低于1μM的酶可能难以使用这种方法进行研究,因为NMR实验固有的灵敏度较低。在这些情况下,分光光度或荧光光谱是更合适的技术。
这些方法应用的另一个限制是合适的淬火剂。此处描述的所有协议都是固定时间测定,在 30 分钟后通过添加 HCl 来淬火反应。对于AGNH和UNH,先前已经确定,HCl立即停止反应,并持续其停止一段时间,第9周,第10周。这一点很重要,因为数十种反应通常同时运行,然后在几个小时内排队等待 NMR 数据收集。还必须确定基材或产品信号的非酶降解不会在淬火之后,但在 NMR 数据收集之前发生。除HCl外,其他常见的淬火反应方式是添加一种已知的纳米摩尔抑制剂16,或者,在涉及三磷酸腺苷的反应的情况下,添加乙酰胺乙酰乙酸17。
基于NMR的活动测定在用于片段筛选或正交检测时提供附加值,以验证高通量筛选命中4。与结合测定不同,基于NMR的活性测定将化合物识别或确认为实际抑制剂。活性测定使用的目标酶也比结合测定少得多。对于两种类型的计数器屏幕,同样的方法非常可靠,用于验证可逆的、目标特定的活动并排除伪化活性18。洗涤剂和跳跃稀释测定分别用于胶体聚集19和不可逆抑制20的反屏。通过这些测试的化合物验证了药用化学和结构导向抑制剂优化的起点。随着项目向纳米摩尔抑制剂方向发展,基于 NMR 的活动测定可以继续提供复合活性数据。
最后,这些测定对监测整个细胞反应的效用是值得注意的21。将纯化酶的抑制与细胞内酶的抑制联系起来,将能为观察到的型状效应22背后的生化机制提供明确的证据。对于这里介绍的两种酶,所需的型型效应是活力丧失(抗虫活动)。纯化酶抑制、细胞内酶抑制和寄生虫细胞死亡之间的相关性将构成抑制作用机制的证明。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Dean Brown博士提供阿斯利康片段库中的化合物,感谢David Parkin博士提供AGNH和UNH酶。本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家过敏和传染病研究所的支持,奖励编号为R15AI128585至B.J.S.内容完全由作者负责,并不一定代表国家卫生研究院的官方观点。 研究还得到了霍勒斯·麦克唐纳暑期研究奖学金的支持,该奖学金授予了兰德斯伯格家族S.N.M.。奖学金授予J.A.G.,以及教师发展补助金和弗雷德里克·贝特尔海姆研究奖,从阿德菲大学授予B.J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AGNH | Purified in-house | N/A | TVAG_213720 |
| UNH | Purified in-house | N/A | TVAG_092730 |
| Adenosine | Sigma | A9251 | |
| 5-Fluorouridine | Sigma | F5130 | |
| Dimethyl sulfoxide-D6 | Cambridge Isotope Labs | DLM-10-100 | D, 99.9% |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Deuterium oxide | Cambridge Isotope Labs | DLM-4-100 | D, 99.9% |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144212 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| 3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP) | Sigma | 269913 | D, 98% |
| 2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2 | Sigma | 612197 | D, 99.5% |
| Pipette | Gilson | F123602 | PIPETMAN Classic P1000 |
| Pipette | Gilson | F123601 | PIPETMAN Classic P200 |
| Pipette | Gilson | F123600 | PIPETMAN Classic P20 |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Conical tubes | Corning | 352099 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02215365 | |
| NMR tubes | Norell | 502-7 | Or as appropriate for the NMR |
| NMR spectrometer | Bruker | N/A | AvanceIII500 |
| Prism software | GraphPad | N/A | Version 5.04 |
References
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