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Chemistry

NMR-आधारित क्रियाकलाप परख संमिश्र निषेध, आईसी50 मान, कृत्रिम गतिविधि, और न्यूक्लिओसाइड रिबोहाइड्रोलेस की संपूर्ण-कोशिका गतिविधि का निर्धारण करने के लिए

Published: June 30, 2019 doi: 10.3791/59928
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

Summary

एनएमआर-आधारित गतिविधि परख दो न्यूक्लिओसाइड राइबोहाइड्रोलेस एंजाइमों के अवरोधकों की पहचान करने और उनकी विशेषता के लिए विकसित की गई है। प्रोटोकॉल 500 डिग्री और 250 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक यौगिक assays के लिए प्रदान की जाती हैं, आईसी50 मूल्यों का निर्धारण करने के लिए खुराक प्रतिक्रिया assays, डिटर्जेंट काउंटर स्क्रीन परख, कूद-डिल्यूशन काउंटर स्क्रीन परख, और ई. कोलाई पूरे कोशिकाओं में परख.

Abstract

एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी अक्सर पहचान और दवा की खोज में एंजाइम inhibitors की विशेषता के लिए प्रयोग किया जाता है, विशेष रूप से टुकड़ा स्क्रीनिंग के संदर्भ में. एनएमआर-आधारित गतिविधि परख आदर्श इन कमजोर अवरोधकों का पता लगाने के लिए आवश्यक परीक्षण यौगिकों की उच्च सांद्रता पर काम करने के लिए उपयुक्त हैं। एक NMR प्रयोग में गतिशील रेंज और रासायनिक बदलाव फैलाव आसानी से सब्सट्रेट, उत्पाद, और परीक्षण यौगिकों से अनुनादों को हल कर सकते हैं. स्पेक्ट्रोफोटोमिट्रिक परख के साथ यह विरोधाभास, जिसमें पढ़ने के बाहर हस्तक्षेप समस्याओं अक्सर ओवरलैपिंग यूवी-विस अवशोषण प्रोफाइल के साथ यौगिकों से उत्पन्न होते हैं। इसके अलावा, के बाद से वे रिपोर्टर एंजाइमों की कमी, एकल एंजाइम NMR assays युग्मित-आश्चर्य झूठी सकारात्मक करने के लिए प्रवण नहीं हैं. यह विशेषता उन्हें लंबकोणीय परख के रूप में उपयोगी बनाता है, पारंपरिक उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग परख और बेंचटॉप triage assays पूरक. विस्तृत प्रोटोकॉल 500 डिग्री और 250 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक यौगिक assays के लिए प्रदान की जाती हैं, आईसी50 मूल्यों का निर्धारण करने के लिए खुराक प्रतिक्रिया assays, डिटर्जेंट काउंटर स्क्रीन परख, कूद-डिओशन काउंटर स्क्रीन परख, और ई. कोलाई पूरे कोशिकाओं में परख. तरीकों दो न्यूक्लिओसाइड राइबोहाइड्रोलेस एंजाइमों का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं। 1एच एनएमआर का उपयोग प्यूरीन-विशिष्ट एंजाइम के लिए दिखाया गया है, जबकि 19एफ एनएमआर को पाइरिमिडीन-विशिष्ट एंजाइम के लिए दिखाया गया है। प्रोटोकॉल आम तौर पर किसी भी एंजाइम जहां सब्सट्रेट और उत्पाद अनुनादों मनाया जा सकता है और NMR स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्रतिष्ठित करने के लिए लागू होते हैं. दवा की खोज के संदर्भ में सबसे उपयोगी होने के लिए, सब्सट्रेट के अंतिम एकाग्रता से अधिक नहीं होना चाहिए 2-3x इसके Km मूल्य. एनएमआर प्रयोग का चुनाव एंजाइम अभिक्रिया और उपलब्ध उपसंहरणों के साथ-साथ उपलब्ध एनएमआर इंस्ट्रूमेंटेशन पर निर्भर करता है।

Introduction

नाभिकीय चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी एंजाइम अभिक्रियाओं की विशेषता और निगरानी के लिए अच्छी तरह से स्थापित है1,2. रासायनिक बदलाव और युग्मन पैटर्न में अंतर सब्सट्रेट और उत्पाद अनुनादों भेद करने के लिए उपयोग किया जाता है, और रिश्तेदार अनुनाद तीव्रता प्रतिक्रिया के प्रतिशत मात्रा में उपयोग किया जाता है। सब्सट्रेट की खपत और उत्पाद के निर्माण दोनों सीधे एनएमआर स्पेक्ट्रम में मनाया जाता है। स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री या फ्लोरोसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ यह विरोधाभास, जिसमें प्रतिक्रिया समय पाठ्यक्रम कुछ रासायनिक प्रजातियों का सेवन किया जा रहा है या बनाया जा रहा है के कारण अवशोषण में परिवर्तन द्वारा संकेत दिया है. बस के रूप में अन्य तरीकों के साथ, NMR तापमान, पीएच, या अन्य समाधान की स्थिति के एक समारोह के रूप में एंजाइम प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और inhibitors के प्रभाव निर्धारित किया जा सकता है.

हाल ही में, NMR आधारित एंजाइम गतिविधि परख टुकड़ा स्क्रीनिंग3,4के लिए प्रदर्शन किया गया है. NMR आधारित परख आदर्श परीक्षण यौगिकों के उच्च सांद्रता पर काम करने के लिए उपयुक्त हैं (अक्सर के रूप में उच्च के रूप में 1 एमएम) इन कमजोर inhibitors का पता लगाने के लिए आवश्यक. NMR प्रयोग में गतिशील रेंज और रासायनिक बदलाव फैलाव आसानी से सब्सट्रेट, उत्पाद, और परीक्षण यौगिकों से अनुनादों को हल कर सकते हैं। यह स्पेक्ट्रोफोटोमिट्रिक परख के लिए अनुकूल तुलना करता है जहां पठन-आउट हस्तक्षेप समस्याएं अक्सर यूवी-विस अवशोषण प्रोफाइल के साथ यौगिकों से उत्पन्न होती हैं। इसके अलावा, के बाद से वे रिपोर्टर एंजाइमों की कमी, एकल एंजाइम NMR assays युग्मित-आश्चर्य झूठी सकारात्मक करने के लिए प्रवण नहीं हैं. यह लाभ उन्हें लंबकोणीय परख के रूप में उपयोगी बनाता है, पारंपरिक उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग परख और बेंचटॉप triage assays5पूरक.

हमारे अनुसंधान प्रयोगशाला में, NMR आधारित गतिविधि परख की पहचान करने और Trichomonas योनि न्यूक्लिओसाइड राइबोहाइड्रोलेस के inhibitors का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है. टी योनि परजीवी सबसे प्रचलित गैर वायरल यौन संचारित रोग6का कारण बनता है. मौजूदा चिकित्सा7 के लिए बढ़ती प्रतिरोध उपन्यास के लिए की जरूरत ड्राइविंग है, तंत्र आधारित उपचार, आवश्यक न्यूक्लिओसाइड बचाव मार्ग एंजाइमों के साथ प्रमुख लक्ष्य8का प्रतिनिधित्व . एनएमआर-आधारित गतिविधि परख दोनों पायरिमिडीन- और प्यूरीन-विशिष्ट एंजाइमों के लिए विकसित की गई है, यूरिडीन न्यूक्लिओसाइड राइबोहाइड्रोलेस (यूएनएच)9, और एडेनोसाइन/गुआनोसाइन पसंद न्यूक्लिओसाइड राइबोहाइड्रोलेस (एजीएनएच)10. इन दोनों एंजाइमों द्वारा उत्प्रेरित अभिक्रियाएँ चित्र 1में दर्शायी गई हैं। एनएमआर परख रासायनिक प्रारंभिक बिंदुओं के लिए टुकड़ा पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, आईसी50 मूल्यों का निर्धारण, और एकत्रीकरण आधारित या सहसंयोजक बंधन inhibitors11बाहर निराना. संपूर्ण कोशिकाओं में एंजाइम की गतिविधि का आकलन करने के लिए भी इसी परखों का अनुवाद किया जा रहाहै.

विस्तृत प्रोटोकॉल 500 डिग्री और 250 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक यौगिक assays के लिए प्रदान की जाती हैं, आईसी50 मूल्यों का निर्धारण करने के लिए खुराक प्रतिक्रिया assays, डिटर्जेंट काउंटर स्क्रीन परख, कूद-डिओशन काउंटर स्क्रीन परख, और ई. कोलाई पूरे कोशिकाओं में परख. प्रोटोकॉल आम तौर पर किसी भी एंजाइम है जिसमें सब्सट्रेट और उत्पाद अनुनादों मनाया जा सकता है और एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्रतिष्ठित करने के लिए लागू होते हैं। सादगी के लिए तीन अनुमान लगाए गए हैं। सबसे पहले, सब्सट्रेट निर्दिष्ट नहीं है। NMR आधारित गतिविधि assays के लिए उपयोगी होने के लिए, सब्सट्रेट के अंतिम एकाग्रता से अधिक नहीं होना चाहिए 2-3x Km मान4. दिखाए गए उदाहरणों में एडेनोसाइन तथा 5-फ्लोरोरिडीन की अंतिम सांद्रताक्रमशः 100 उ (कउ र् 54 उ) तथा 50 उ (काउ ] 15 उ) होती है। प्रोटोकॉल में, इन सांद्रता को प्राप्त करने के लिए मेल खाती है 12 $L के 5 M एडेनोसिन या 2.5 m 5-fluororidine के 12 डिग्री एल.

दूसरा, प्रोटोकॉल में के लिए प्रदान की एंजाइम की मात्रा, 5 $L, 30 मिनट में उत्पाद के लिए सब्सट्रेट के लगभग 75% रूपांतरण में परिणाम के लिए आवश्यक राशि के अनुरूप करने के लिए चुना गया था. यह मात्रा आम तौर पर एक शुद्ध एंजाइम स्टॉक से एक बड़ी कमजोर पड़ने का प्रतिनिधित्व करता है, और कमजोर पड़ने प्रत्येक एंजाइम के लिए अग्रिम में निर्धारित किया जाना चाहिए. शुद्ध AGNH और UNH एंजाइम स्टॉक समाधान alicots में -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है कि कई हजार प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त एंजाइम प्रदान करते हैं. इस प्रकार, कमजोर पड़ने कारक आदर्श केवल निर्धारित या हर कुछ महीनों में मान्य करने की जरूरत है. तीसरा, विशिष्ट 1D NMR प्रयोग निर्दिष्ट नहीं है. प्रतिनिधि परिणामों में, 1एच एनएमआर AGNH10 के लिए दिखाया गया है और 19एफ एनएमआर UNH9के लिए दिखाया गया है, एनएमआर प्रयोग के साथ इसी संदर्भ में वर्णित है. एनएमआर प्रयोग का चुनाव एंजाइम अभिक्रिया और उपलब्ध उपसंहरणों के साथ-साथ उपलब्ध एनएमआर इंस्ट्रूमेंटेशन पर निर्भर करता है। अंत में, यह बताया जाना चाहिए कि वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण मात्रात्मक एनएमआर (क्यूएनएमआर)13,14की सख्त आवश्यकताओं का पालन नहीं करता है। प्रोटोकॉल में, एक प्रतिशत प्रतिक्रिया प्रत्येक स्पेक्ट्रम में एक ही अनुनाद की तीव्रता में सापेक्ष परिवर्तन का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है, बजाय पूर्ण सांद्रता का निर्धारण करके. इस दृष्टिकोण डेटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण संशोधनों के साथ ही आंतरिक या बाहरी मानकों, जो QNMR के लिए आवश्यक हैं के लिए की आवश्यकता समाप्त.

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Protocol

1. प्रारंभिक परीक्षण यौगिक 500 डिग्री सेल्सियस और 250 डिग्री मीटर पर परख

  1. प्रतिक्रियाओं के लिए सब्सट्रेट और परीक्षण यौगिक तैयार करें।
    1. पानी में सब्सट्रेट (एडेनोसाइन या 5-फ्लोरोरिडीन) के स्टॉक समाधान तैयार करें और 50 एमएम परीक्षण परिसर में ड्यूरेटेड डाइमेथिल सल्फोक्सेक्साइड (डीएमएसओ)। उपयोग करने के लिए सब्सट्रेट समाधान की सांद्रता के लिए परिचय अनुभाग को देखें।
    2. चार 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में से प्रत्येक में उपस्तर (एडेनोसाइन या 5-फ्लोरोरिडीन) का 12 डिग्री एल जोड़ें, 1-4।
    3. ट्यूब 1 (0 मिनट नियंत्रण) और 4 (30 मिनट नियंत्रण) के लिए deuterated DMSO के 6 $L जोड़ें. 2 ट्यूब में परीक्षण यौगिक के 6 डिग्री एल जोड़ें। परीक्षण यौगिक के 3 डिग्री एल और ट्यूब 3 के लिए deuterated DMSO के 3 डिग्री एल जोड़ें।
  2. पर्याप्त प्रतिक्रिया स्टॉक समाधान तैयार करें।
    नोट: स्टॉक समाधान पांच प्रतिक्रियाओं के लिए है जिसमें प्रत्येक में बफर के 517 डिग्री एल, ड्यूटेरियम ऑक्साइड का 60 डिग्री एल, और एंजाइम समाधान (एजीएनएच या यूएनएच) का 5 डिग्री एल होता है। का उपयोग करने के लिए एंजाइम समाधान की सांद्रता के लिए परिचय अनुभाग को देखें.
    1. 15 एमएल शंकु नली में 2ण्59 एमएल प्रतिक्रिया बफर (50 उम पोटैशियम फॉस्फेट, 0ण्3 उ.ल., च.एच. 6.5) जोड़ें। शंकुन नलिका में ड्यूटेरियम ऑक्साइड का 300 डिग्री सेल्सियस जोड़ना। शंकु में एंजाइम समाधान (AGNH या UNH) का 25 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    2. मिश्रण करने के लिए शंकु नली को दो बार धीरे से उलटें।
  3. इसके साथ ही आरंभ करने और 0 मिनट नियंत्रण प्रतिक्रिया बुझाने. एक साफ माइक्रोफ्यूज ट्यूब के लिए प्रतिक्रिया स्टॉक समाधान के 582 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण। इस माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 1ण्5 उब्क्क् की 10 डिग्री सेल्सियस डालें। संयुक्त 592 जेडएल को माइक्रोफ्यूज ट्यूब 1 में स्थानांतरित करें। Aspirate और एक धीमी लेकिन जानबूझकर फैशन में दो बार नमूना वितरित.
  4. शुरू करने और विषम फैशन में शेष तीन प्रतिक्रियाओं को चलाने के लिए। 0 मिनट पर, माइक्रोफ्यूज ट्यूब 2 के लिए प्रतिक्रिया स्टॉक समाधान के 582 डिग्री सेल्सियस हस्तांतरण। Aspirate और एक धीमी लेकिन जानबूझकर फैशन में दो बार नमूना वितरित. माइक्रोफ्यूज ट्यूबों 3 और 4 के लिए 30 s अंतराल पर दोहराएँ. 30 मिनट रुको.
  5. प्रतिक्रियाओं को बुझाएं। समय 30 मिनट पर, माइक्रोफ्यूज 2 के लिए 1.5 एम एचसीएल के 10 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। माइक्रोफ्यूज ट्यूबों 3 और 4 के लिए 30 s अंतराल पर दोहराएँ. प्रत्येक माइक्रोफ्यूज से 600 डिग्री सेल्सियस विलयन को एनएमआर ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  6. प्रत्येक नमूने पर एक 1D NMR स्पेक्ट्रम प्राप्त करें. सही चरणबद्ध और फ्लैट आधार रेखा सुनिश्चित करने के लिए डेटा को संसाधित करें।
  7. नियंत्रण स्पेक्ट्रम के लिए सब्सट्रेट के प्रतिशत रूपांतरण की गणना.
    1. 0 मिनट और 30 मिनट नियंत्रण के लिए स्पेक्ट्रम ओवरले. 30 मिनट नियंत्रण मैच के लिए 0 मिनट नियंत्रण में सब्सट्रेट संकेत स्केल. इस प्रतिशत को नोट करें.
    2. प्रतिशत रूपांतरण की गणना चरण 1.7.1 में निर्धारित (100 - प्रतिशत) के रूप में करें.
  8. परीक्षण यौगिक युक्त प्रतिक्रियाओं के लिए सब्सट्रेट के प्रतिशत रूपांतरण की गणना करें।
    1. 0 मिनट नियंत्रण और 500 डिग्री एम परीक्षण परिसर युक्त पहली प्रतिक्रिया के लिए ओवरले स्पेक्ट्रम. परीक्षण यौगिक के साथ स्पेक्ट्रम मैच के लिए 0 मिनट नियंत्रण में सब्सट्रेट संकेत स्केल. इस प्रतिशत को नोट करें. प्रतिशत रूपांतरण की गणना इस रूप में करें (100 - प्रतिशत निर्धारित).
    2. 250 डिग्री सेल्सियस परीक्षण यौगिक युक्त दूसरी प्रतिक्रिया के लिए दोहराएँ.
  9. प्रत्येक परीक्षण यौगिक एकाग्रता के लिए प्रतिशत प्रतिक्रिया और प्रतिशत अवरोध की गणना.
    1. (1.8.1.1.7.2) x 100 के रूप में प्रतिशत अभिक्रिया की गणना करें।
    2. प्रतिशत निषेध की गणना के रूप में (100 - प्रतिशत चरण 1.9.1 में निर्धारित).

2. आईसी50 मूल्यों का निर्धारण

  1. प्रतिक्रियाओं के लिए सब्सट्रेट और परीक्षण यौगिक तैयार करें।
    1. पानी में सब्सट्रेट (एडेनोसाइन या 5-फ्लोरोरिडीन) और 10 एमएम परीक्षण परिसर के स्टॉक समाधान तैयार करें। उपयोग करने के लिए सब्सट्रेट समाधान की सांद्रता के लिए परिचय अनुभाग को देखें।
  2. 10 एमएम परीक्षण परिसर के धारावाहिक कमजोर पड़ने की तैयारी करें (डयूटी में DMSO में).
    1. पांच 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में 36 डिग्री एल ड्यूरेटेड डी एम एस ओ जोड़ें, 1-5।
    2. ट्यूब 1 के लिए 12 $L 10 एमएल परीक्षण यौगिक जोड़ें और मिश्रण करने के लिए हल्के से नल। टेस्ट परिसर अब 2.5 मीटर है।
    3. ट्यूब 1 से ट्यूब 2 के लिए 12 जेडएल स्थानांतरण और मिश्रण करने के लिए हल्के से नल। टेस्ट यौगिक अब 0.63 मीटर है. ट्यूब 2 से ट्यूब 3 के लिए 12 जेडएल स्थानांतरण और मिश्रण करने के लिए हल्के से नल। टेस्ट परिसर अब 0.16 मीटर है। ट्यूब 3 से ट्यूब 4 के लिए 12 डिग्री एल स्थानांतरण और मिश्रण करने के लिए हल्के से नल। टेस्ट यौगिक अब 0.04 मीटर है. ट्यूब 4 से ट्यूब 5 के लिए 12 जेडएल स्थानांतरण और मिश्रण करने के लिए हल्के से नल। टेस्ट यौगिक अब 0.01 मीटर है.
  3. अभिक्रियाओं के लिए 14 1ण्5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब तैयार कीजिए।
    1. 14 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में से प्रत्येक में सब्सट्रेट (एडेनोसाइन या 5-फ्लोरोरिडीन) के 12 डिग्री एल जोड़ें, 1-14।
    2. ट्यूब 1 (0 मिनट नियंत्रण) और 14 (30 मिनट नियंत्रण) के लिए deuterated DMSO के 12 $L जोड़ें.
    3. ट्यूब 2 और 3 के लिए 10 मीटर परीक्षण यौगिक के 12 डिग्री एल जोड़ें। ट्यूब 4 और 5 के लिए 2.5 मीटर परीक्षण यौगिक के 12 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। नलों में 0ण्63 उम पराक यौगिक का 12 $ल मिलाकर 6 तथा 7। नलों में 0ण्16 उम पराTest यौगिक का 12 $ल मिलाइए। नलों 10 और 11 में 0ण्004 उम पराक यौगिक का 12 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। नलों 12 और 13 में 0ण्001 उम पराक यौगिक का 12 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
  4. 15 अभिक्रियाओं को चलाने के लिए पर्याप्त अभिक्रिया स्टॉक समाधान तैयार की, जिनमें 511 र्ल बफर, 60 डिग्री सेल्सियस ड्यूटेरियम ऑक्साइड तथा 5 डिग्री एल एंजाइम विलयन (एजीएनएच या यूएनएच) प्रत्येक होते हैं। का उपयोग करने के लिए एंजाइम समाधान की सांद्रता के लिए परिचय अनुभाग को देखें.
    1. 7ण्67 एमएल अभिक्रिया बफर (50 उम पोटैशियम फॉस्फेट, 0ण्3 उम्क्ल, चह र् 6ण्5) को 15 उ.ल. शंकु-नली में जोड़ें। शंकुन नलिका में ड्यूटेरियम ऑक्साइड का 900 डिग्री सेल्सियस जोड़ना। शंकु में एंजाइम समाधान (AGNH या UNH) का 75 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    2. मिश्रण करने के लिए शंकु ट्यूब 2x को धीरे से उलटें।
  5. प्रत्येक परीक्षण यौगिक सांद्रता के लिए प्रतिशत अभिक्रिया निर्धारित करने के लिए चरण 1.3-1.9 में दिए गए चरणों का पालन करें (प्रतिक्रिया स्टॉक समाधान के 576 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करके)।
  6. GraphPad Prism का उपयोग कर IC50 मान की गणना करें।
    1. एक डेटा तालिका बनाएँ प्रतिक्रिया परीक्षण यौगिक सांद्रता के लॉग संबंधित (200 $M, 50 $M, 12.5 $M, 3.13 $M, 0.78 $M, 0.20 $M) प्रतिशत प्रतिक्रिया के साथ (दो मान प्रत्येक).
    2. IC50 मान और मानक त्रुटि निर्धारित करने के लिए एक nonlinear वक्र फ़िट का उपयोग करें।

3. डिटर्जेंट काउंटर स्क्रीन पर 100 डिग्री सेल्सियस और 50 डिग्री एम पर पर परख

  1. प्रतिक्रियाओं के लिए सब्सट्रेट और परीक्षण यौगिक तैयार करें।
    1. पानी में सब्सट्रेट (एडेनोसाइन या 5-फ्लोरोरिडीन) और 10 एमएम परीक्षण परिसर के स्टॉक समाधान तैयार करें। उपयोग करने के लिए सब्सट्रेट समाधान की सांद्रता के लिए परिचय अनुभाग को देखें।
    2. आठ 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में से प्रत्येक में उपस्तर (एडेनोसाइन या 5-फ्लोरोरिडीन) का 12 डिग्री एल जोड़ें, 1-8।
    3. ट्यूब 1 और 5 (0 मिनट नियंत्रण) और 4 और 8 (30 मिनट नियंत्रण) के लिए deuterated DMSO के 6 $L जोड़ें. नलों 2 और 6 में परीक्षण यौगिक के 6 डिग्री एल जोड़ें। परीक्षण यौगिक के 3 डिग्री एल और ट्यूब 3 और 7 के लिए deuterated DMSO के 3 डिग्री एल जोड़ें।
  2. अपमार्जक के बिना पर्याप्त प्रतिक्रिया स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए पांच प्रतिक्रियाओं कि बफर के 517 डिग्री एल, deuterium ऑक्साइड के 60 डिग्री एल, और एंजाइम समाधान के 5 डिग्री एल (AGNH या यूएनएच) प्रत्येक होते हैं. का उपयोग करने के लिए एंजाइम समाधान की सांद्रता के लिए परिचय अनुभाग को देखें.
    1. 15 एमएल शंकु नली में 2ण्59 एमएल अभिक्रिया बफर (50 उउ पोटैशियम फॉस्फेट, 0ण्3 उम् कुक्ल, चह र् 6ण्5) जोड़ें। शंकुन नलिका में ड्यूटेरियम ऑक्साइड का 300 डिग्री सेल्सियस जोड़ना। शंकु में एंजाइम समाधान (AGNH या UNH) का 25 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    2. मिश्रण करने के लिए शंकु ट्यूब 2x को धीरे से उलटें।
  3. 0ण्01% v/v Triton X-100 डिटर्जेंट के साथ पर्याप्त प्रतिक्रिया स्टॉक समाधान तैयार करें, जिसमें 517 डिग्री सेल्सियस बफर, 60 डिग्री सेल्सियस ड्यूटेरियम ऑक्साइड का एल, और 5 एंजाइम समाधान (AGNH या UNH) प्रत्येक शामिल हैं।
    1. 20 एमएल प्रतिक्रिया बफर (50 एमएम पोटेशियम फॉस्फेट, 0ण्3 एम केसीएल, पीएच जेड 6.5) में ट्राइटन एक्स-100 डिटर्जेंट का 2 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। डिटर्जेंट समाधान 1 दिन के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
    2. एक 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए 0.01% Triton X-100 डिटर्जेंट युक्त प्रतिक्रिया बफर के 2.59 एमएल जोड़ें। शंकुन नलिका में ड्यूटेरियम ऑक्साइड का 300 डिग्री सेल्सियस जोड़ना। शंकु में एंजाइम समाधान (AGNH या UNH) का 25 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    3. मिश्रण करने के लिए शंकु ट्यूब 2x को धीरे से उलटें।
  4. ट्यूबों के लिए 1-4, डिटर्जेंट के बिना प्रतिक्रिया स्टॉक समाधान का उपयोग कर, प्रत्येक परीक्षण यौगिक एकाग्रता के लिए प्रतिशत अवरोध निर्धारित करने के लिए चरणों में उल्लिखित चरणों का पालन करें 1.3-1.9.
  5. ट्यूबों के लिए 5-8, प्रतिक्रिया स्टॉक समाधान का उपयोग कर 0.01% v/v Triton X-100 डिटर्जेंट, प्रत्येक परीक्षण यौगिक एकाग्रता के लिए प्रतिशत अवरोध निर्धारित करने के लिए चरणों में उल्लिखित चरणों का पालन करें 1.3-1.9.

4. कूद-डिल्यूशन काउंटर स्क्रीन परख

  1. प्रतिक्रियाओं के लिए सब्सट्रेट और परीक्षण यौगिकों तैयार
    1. पानी में सब्सट्रेट (एडेनोसाइन या 5-फ्लोरोरिडीन) और 10 एमएम परीक्षण परिसर के स्टॉक समाधान तैयार करें। उपयोग करने के लिए सब्सट्रेट समाधान की सांद्रता के लिए परिचय अनुभाग को देखें।
    2. प्रतिक्रिया बफर (50 लाख पोटैल फॉस्फेट, 0ण्3 एम केसीएल, चह र् 6.5) को दो 1ण्5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब (प्रत्येक), 1 और 2 जोड़ें। ट्यूब 1 और 2 में एंजाइम (AGNH या UNH) का 5 डिग्री एल जोड़ें।
    3. दो 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों, 3 और 4 (प्रत्येक) में प्रतिक्रिया बफर के 511 $एल जोड़ें। ट्यूब 3 और 4 में ड्यूटेरियम ऑक्साइड का 60 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। ट्यूब ों के लिए एंजाइम (AGNH या UNH) के 5 डिग्री एल जोड़ें 3 और 4.
    4. ट्यूब 1 (30 मिनट नियंत्रण) के लिए deuterated DMSO के 1.2 $L जोड़ें. 2 ट्यूब में परीक्षण यौगिक का 1ण्2 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। ट्यूब 3 (30 मिनट नियंत्रण) के लिए deuterated DMSO के 12 $L जोड़ें. परीक्षण यौगिक के 12 डिग्री सेल्सियस को ट्यूब 4 में जोड़ें। 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  2. दो 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों को कमजोर पड़ने के घोल के साथ तैयार कीजिए।
    1. दो 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों, 5 और 6 में से प्रत्येक के लिए प्रतिक्रिया बफर के 468 $L जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब (5 और 6) में ड्यूटेरियम ऑक्साइड का 60 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
  3. अभिक्रियाओं के लिए चार 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब तैयार कीजिए।
    1. चार 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में से प्रत्येक में उपस्तर (एडेनोसाइन या 5-फ्लोरोरिडीन) के 12 डिग्री एल जोड़ें, 7-10।
  4. कूद-dilutions प्रदर्शन और प्रतिक्रियाओं आरंभ.
    1. 5 ट्यूब 1 से विलयन का अंतरण 528 डिग्री सेल्सियस करना। Aspirate और एक धीमी लेकिन जानबूझकर फैशन में दो बार नमूना वितरित. नल 6 से ट्यूब 2 तक विलयन का 528 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण करें। Aspirate और एक धीमी लेकिन जानबूझकर फैशन में दो बार नमूना वितरित.
    2. समय 0 मिनट पर, ट्यूब 1 से 7 ट्यूब के लिए समाधान के 588 $L हस्तांतरण। Aspirate और एक धीमी लेकिन जानबूझकर फैशन में नमूना 2x वितरित. 30 के अंतराल पर, ट्यूब 2 से ट्यूब 2 से ट्यूब 8, ट्यूब 3 से ट्यूब 9, और ट्यूब 4 से ट्यूब 10 तक 588 डिग्री सेल्सियस विलयन स्थानांतरित करें। Aspirate और एक धीमी लेकिन जानबूझकर फैशन में दो बार नमूना वितरित. 30 मिनट रुको.
  5. ट्यूब ों के लिए 7-10, प्रत्येक परीक्षण यौगिक एकाग्रता के लिए प्रतिशत अवरोध निर्धारित करने के लिए चरणों में उल्लिखित चरणों का पालन करें 1.5-1.9.

5. यौगिक परख ई. कोलाई पूरी कोशिकाओं में

  1. पूर्व प्रयोगों के दिन ई. कोलाई की 10 एमएल रात भर की संस्कृति तैयार करें।
  2. एनएमआर प्रयोगों के लिए ई. कोलाई कोशिकाओं को तैयार करें।
    1. 1 एमएल एलिकोट्स में कोशिकाओं को 15000 x gपर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें .
    2. सुपरनेंट को त्याग दें और 1 एमएल प्रतिक्रिया बफर (50 एमएम पोटेशियम फॉस्फेट, 0ण्3 एम केसीएल, पीएच जेड 6-5) में कोशिकाओं के प्रत्येक एलिकोट को भ्रमिल करके पुनः पेश करें।
  3. निम्न परिवर्तनों के साथ वांछित परख के लिए अनुभाग 1 या 2 का पालन करें:
    1. प्रतिक्रिया स्टॉक समाधान में बफर के 280 $L को पुनः निलंबित कोशिकाओं के 280 डिग्री एल के साथ प्रतिस्थापित करें।
    2. बफर के 5 डिग्री सेल्सियस के साथ प्रतिक्रिया स्टॉक समाधान में एंजाइम (AGNH या यूएनएच) के विकल्प 5 डिग्री एल।

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Representative Results

चित्र 2 1एच एनएमआर निम्नलिखित अनुभाग 1 का उपयोग करके AGNH के विरुद्ध दो यौगिकों के परीक्षण के लिए परिणाम दिखाता है। एंजाइम अभिक्रिया को सबसे आसानी से देखा जाता है और एडेनोसाइन एकल और डबलेट अनुनादों के 8.48 पीपीएम और 6.09 पीपीएम पर क्रमशः गायब होने से मात्रा निर्धारित की जाती है, और 30 मिनट नियंत्रण में 8.33 पीपीएम पर एक ऐडेनीन एकल अनुनाद की उपस्थिति। स्पेक्ट्रम. 500 डिग्री सेल्सियस यौगिक 1 की उपस्थिति में, 8ण्33 पीपीएम पर एक ऐडेनीन अनुनाद की कमी के कारण कोई उत्पाद नहीं बनता है। 250 डिग्री सेल्सियस यौगिक 1 की उपस्थिति में, सब्सट्रेट के बारे में 10% उत्पाद के लिए परिवर्तित कर दिया गया है. इसके विपरीत, यौगिक 2 की न तो एकाग्रता एंजाइम को रोकता है के रूप में सब्सट्रेट और उत्पाद अनुनादों द्वारा सबूत के रूप में 30 मिनट नियंत्रण स्पेक्ट्रम में उन लोगों के समान. यह डेटा एक अच्छा AGNH अवरोध करनेवाला के रूप में यौगिक 1 की पहचान करता है. ध्यान दें कि यौगिक 1 (7.70-8.00 और 8.50-8.60 पीपीएम) और यौगिक 2 (7.40-7.80 पीपीएम) से उत्पन्न अनुनादों को भी देखा जाता है। वही सब्सट्रेट और उत्पाद अनुनादों का उपयोग चित्र 4, चित्र 6, चित्र 8और चित्र 10में दर्शाए गए अभिक्रियाओं की निगरानी करने के लिए किया जाता है . चित्र 3 19एफ एनएमआर निम्नलिखित अनुभाग 1 का उपयोग कर UNH के खिलाफ दो यौगिकों के परीक्षण के लिए परिणाम से पता चलता है। एंजाइम प्रतिक्रिया को आसानी से मनाया जाता है और -165.8 पीपीएम पर 5-फ्लोरोरिडीन अनुनाद के गायब होने और 30 मिनट नियंत्रण स्पेक्ट्रम में देखे गए अनुसार -169.2 पीपीएम पर 5-फ्लोरोरोएसिल अनुनाद की उपस्थिति द्वारा मात्रा निर्धारित की जाती है। इस एंजाइम के लिए यौगिक 2 पूरी तरह से दोनों सांद्रता पर प्रतिक्रिया को रोकता है जबकि यौगिक 1 का कोई प्रभाव नहीं होता है। यह डेटा एक अच्छा UNH अवरोध करनेवाला के रूप में यौगिक 2 की पहचान करता है. वही सब्सट्रेट और उत्पाद अनुनादों का उपयोग चित्र 5, चित्र 7 , चित्र 9और चित्र 11में दर्शाए गए अभिक्रियाओं की निगरानी करने के लिए किया जाता है .

चित्र 4 खुराक-प्रतिक्रिया एनएमआर डेटा को दर्शाता है और परिणामस्वरूप आईसी50 वक्र AGNH गतिविधि के साथ एक यौगिक के लिए प्राप्त 1एच एनएमआर निम्नलिखित अनुभाग 2 का उपयोग करते हुए। NMR डेटा डुप्लिकेट परीक्षणों में से केवल एक के लिए दिखाया गया है। ध्यान दें कि परीक्षण यौगिक से उत्पन्न अनुनादों (6.90-7.40 पीपीएम) सब्सट्रेट या उत्पाद अनुनादों के साथ हस्तक्षेप नहीं करते। आईसी50 वक्र दोनों परीक्षणों के आंकड़ों का उपयोग करके उपयुक्त था और इसके परिणामस्वरूप 12ण्3 र् 5ण्0 उ का मान हुआ। यह परिणाम NMR डेटा के साथ संगत है कि सब्सट्रेट संकेत के महत्वपूर्ण नुकसान नहीं मनाया जाता है जब तक यौगिक एकाग्रता 12.5 डिग्री सेल्सियस तक कम है. चित्र 5 खुराक-प्रतिक्रिया एनएमआर डेटा को दर्शाता है और परिणामस्वरूप आईसी50 वक्र 19एफ एनएमआर निम्नलिखित अनुभाग 2 का उपयोग करके यूएनएच गतिविधि के साथ एक यौगिक के लिए प्राप्त किया गया है। NMR डेटा डुप्लिकेट परीक्षणों में से केवल एक के लिए दिखाया गया है। आईसी50 वक्र दोनों परीक्षणों के आंकड़ों का उपयोग करके उपयुक्त था और इसके परिणामस्वरूप 16ण्7 का मूल्य 10ण्4 उ था। यह मान NMR डेटा के साथ संगत है कि सब्सट्रेट संकेत के महत्वपूर्ण नुकसान नहीं मनाया जाता है जब तक यौगिक एकाग्रता 12.5 डिग्री सेल्सियस तक कम है.

चित्र 6 की अनुपस्थिति और उपस्थिति में AGNH के खिलाफ दो सांद्रता पर एक यौगिक परीक्षण के लिए परिणाम से पता चलता है 0.01% Triton X-100 डिटर्जेंट 1एच NMR निम्नलिखित अनुभाग 3 का उपयोग कर. केवल न्यूनतम अंतर दो शर्तों का उपयोग कर सब्सट्रेट और उत्पाद संकेतों की तीव्रता में मनाया जाता है, यह दर्शाता है कि मनाया एंजाइम अवरोध यौगिक एकत्रीकरण की एक कलाकृति नहीं है. ध्यान दें कि परीक्षण यौगिक (7.10-7.70 पीपीएम) और Triton X-100 (6.90 और 7.40 पीपीएम) से उत्पन्न अनुनादों सब्सट्रेट या उत्पाद अनुनादों के साथ हस्तक्षेप नहीं करते। चित्रा 7 की अनुपस्थिति और उपस्थिति में यूएनएच के खिलाफ दो सांद्रता में एक यौगिक परीक्षण के लिए परिणाम से पता चलता है 0.01% Triton एक्स-100 डिटर्जेंट का उपयोग कर 19एफ NMR निम्नलिखित अनुभाग 3. केवल न्यूनतम अंतर दो शर्तों का उपयोग कर सब्सट्रेट और उत्पाद संकेतों की तीव्रता में मनाया जाता है, यह दर्शाता है कि मनाया एंजाइम अवरोध यौगिक एकत्रीकरण की एक कलाकृति नहीं है.

चित्र 8 1 एच एनएमआर निम्नलिखित अनुभाग 4 का उपयोग कर AGNH के खिलाफ कूद-dilution परख में एक यौगिक परीक्षण के लिए परिणाम से पता चलता है। 200 उउ प्रतिक्रिया की तुलना में 20 उप्र अभिक्रिया में सब्सट्रेट संकेत की कम तीव्रता यह इंगित करती है कि अवरोध उत्क्रमणीय है। परीक्षित यौगिक का एक IC50 मान 21ण्0 उ है, और इसके अनुनाद ों को 6ण्90-8.30 पीपीएम पर देखा गया है। इस उदाहरण में, यौगिक से अनुनादों एडेनिन उत्पाद संकेत के उन लोगों के साथ हस्तक्षेप, और प्रतिक्रिया प्रगति 6.09 पीपीएम पर एडेनोसाइन अनुनाद का उपयोग कर की निगरानी करने के लिए आसान है। चित्र 9 धारा 4 के बाद 19एफ एनएमआर का उपयोग कर यूएनएच के खिलाफ कूद-डिल्यूशन परख में एक यौगिक के परीक्षण के लिए परिणाम दिखाता है। 200 उउ प्रतिक्रिया की तुलना में 20 डिग्री सेल्सियस अभिक्रिया में -169.2 पीड पर उत्पाद संकेत की बढ़ी हुई तीव्रता यह इंगित करती है कि अवरोध उत्क्रमणीय है। परीक्षित यौगिक का एक IC50 मान 16ण्7$उ है।

चित्र 10 में 1एच एनएमआर निम्नलिखित अनुभाग 5 का उपयोग करके संपूर्ण कोशिकाओं में परख करने के लिए विधि की उपयोगिता को दर्शाता है। एडेनोसाइन सब्सट्रेट संकेतल पूरी कोशिकाओं की उपस्थिति में 30 मिनट के बाद लगभग पूरी तरह से चले गए हैं, जो सब्सट्रेट के हाइड्रोलिसिस का संकेत देते हैं। इसके विपरीत, सब्सट्रेट सेल विकास मीडिया supernatant की उपस्थिति में 30 मिनट के बाद अपरिवर्तित रहता है, यह दर्शाता है कि hydrolysis प्रतिक्रिया सेल निर्भर है. सुपरनेटेंट स्पेक्ट्रम में कई पृष्ठभूमि संकेतों की उपस्थिति को नोट करें, जिसमें एनएच4से तीव्र ट्रिपल संकेत शामिल हैं, + आयन 6.90-7.15 पीपीएम पर जो पूरे सेल स्पेक्ट्रम में एक छोटी डिग्री तक मौजूद हैं। चित्र 11 अनुभाग 5 के बाद 19एफ एनएमआर का उपयोग करके संपूर्ण कोशिकाओं में परख करने के लिए विधि की उपयोगिता को दर्शाता है। 5-fluorouridine सब्सट्रेट संकेत पूरी कोशिकाओं की उपस्थिति में 60 मिनट के बाद पूरी तरह से चला गया है, सब्सट्रेट के hydrolysis का संकेत. इसके विपरीत, सब्सट्रेट सेल विकास मीडिया supernatant की उपस्थिति में 60 मिनट के बाद अपरिवर्तित रहता है, यह दर्शाता है कि hydrolysis प्रतिक्रिया सेल निर्भर है.

Figure 1
चित्र 1: प्रतिक्रियाओं यूएनएच (ऊपर) और AGNH (नीचे) द्वारा उत्प्रेरित। ध्यान दें कि यूएनएच यूरिन और 5-फ्लोरोरिडीन (शो) दोनों के हाइड्रोलिसिस को उत्प्रेरित करेगा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रतिनिधि प्रारंभिक यौगिक 500 पर assays ] एम और 250 ] 1 एच एनएमआर का उपयोग कर के खिलाफ एमAGNH के खिलाफ | दो यौगिकों के लिए 1एच एनएमआर प्रतिक्रिया स्पेक्ट्रम के क्षेत्र, प्रत्येक पर 500 डिग्री सेल्सियस और 250 डिग्री सेल्सियस, 0 मिनट और 30 मिनट नियंत्रण स्पेक्ट्रम के साथ. 0 मिनट नियंत्रण स्पेक्ट्रम 6.09, 8.38, और 8.48 पीपीएम पर एडेनोसाइन सब्सट्रेट अनुनादों शामिल हैं। 30 मिनट नियंत्रण स्पेक्ट्रम 8.33 पीपीएम पर एक नया adenine उत्पाद गूंज शामिल हैं. परीक्षण स्पेक्ट्रम में परीक्षण किए गए यौगिक से उत्पन्न होने वाले अतिरिक्त अनुनाद होते हैं। 1 एच रासायनिक बदलाव बाहरी trimethylsilylpropionic एसिड के लिए संदर्भित किया गया 0.0 पीपीएम पर. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: प्रतिनिधि प्रारंभिक यौगिक 500 पर assays ] एम और 250 ] 19 एफ एनएमआर का उपयोग कर के खिलाफ एम. दो यौगिकों के लिए 19एफ एनएमआर प्रतिक्रिया स्पेक्ट्रम के क्षेत्र, प्रत्येक पर 500 डिग्री सेल्सियस और 250 डिग्री सेल्सियस, 0 मिनट और 30 मिनट नियंत्रण स्पेक्ट्रम के साथ. 0 मिनट नियंत्रण स्पेक्ट्रम -165.8 पीपीएम पर एक 5-fluorouridine सब्सट्रेट गूंज होता है। 30 मिनट नियंत्रण स्पेक्ट्रम -169.2 पीपीएम पर एक नया 5-fluorouracil उत्पाद गूंज शामिल हैं। 19 एफ रासायनिक बदलाव बाहरी 50 डिग्री सेल्सियस trifluoroethanol पर -76.7 पीपीएम के लिए संदर्भित किया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: प्रतिनिधि खुराक-प्रतिक्रिया एनएमआर डेटा और परिणामस्वरूप आईसी50 वक्र 1एच एनएमआर का उपयोग करके एजीएनएच गतिविधि के साथ एक यौगिकके लिए प्राप्त किया गया। एक यौगिक के चर सांद्रता के लिए 1एच एनएमआर प्रतिक्रिया स्पेक्ट्रम के क्षेत्र (200-0.20 डिग्री सेल्सियस) 0 मिनट और 30 मिनट नियंत्रण स्पेक्ट्रम के साथ। 6.90-7.40 पीपीएम से अनुनाद परीक्षण यौगिक से उत्पन्न होते हैं। IC50 वक्र NMR डेटा सेट डुप्लिकेट में चलाने से डेटा का उपयोग कर फिट था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: प्रतिनिधि खुराक-प्रतिक्रिया एनएमआर डेटा और परिणामस्वरूप आईसी50 वक्र 19एफ एनएमआर का उपयोग कर के साथ यूएनएच गतिविधि के साथ एक यौगिकके लिए प्राप्त की। 0 मिनट और 30 मिनट नियंत्रण स्पेक्ट्रम के साथ एक यौगिक (200-0.20 डिग्री सेल्सियस) के चर सांद्रता के लिए 19एफ एनएमआर प्रतिक्रिया स्पेक्ट्रम के क्षेत्र। IC50 वक्र NMR डेटा सेट डुप्लिकेट में चलाने से डेटा का उपयोग कर फिट था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: प्रतिनिधि डिटर्जेंट काउंटर स्क्रीन AGNH गतिविधि के साथ एक यौगिक के लिए assays 1एच NMR का उपयोग कर. 1 एच एनएमआर प्रतिक्रिया स्पेक्ट्रम के क्षेत्र 100 डिग्री सेल्सियस और 50 डिग्री सेल्सियस पर एक यौगिक के लिए, 0 मिनट और 30 मिनट नियंत्रण स्पेक्ट्रम के साथ, उपस्थिति और 0.01% Triton X-100 की अनुपस्थिति में. 7.10-7.70 पीपीएम और 6.90 और 7.40 पीपीएम पर अनुनाद क्रमशः परीक्षण यौगिक और Triton X-100 से उत्पन्न होते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: प्रतिनिधि डिटर्जेंट काउंटर स्क्रीन 19एफ NMR का उपयोग कर UNH गतिविधि के साथ एक यौगिक के लिए assays. 19एफ एनएमआर प्रतिक्रिया स्पेक्ट्रम के क्षेत्र ों के लिए एक यौगिक के लिए 100 $M और 50 $M, 0 मिनट और 30 मिनट नियंत्रण स्पेक्ट्रम के साथ, उपस्थिति और 0.01% Triton X-100 की अनुपस्थिति में. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: प्रतिनिधि कूद-Dilution काउंटर स्क्रीन AGNH गतिविधि के साथ एक यौगिक के लिए assays 1एच NMR का उपयोग कर. 200 डिग्री सेल्सियस और 20 डिग्री सेल्सियस पर एक यौगिक के लिए 1एच एनएमआर प्रतिक्रिया स्पेक्ट्रम के क्षेत्र, 30 मिनट नियंत्रण स्पेक्ट्रम के साथ। एंजाइम प्रतिक्रियाओं के प्रारंभ होने से पहले 200 डिग्री सेल्सियस यौगिक पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था, प्रतिक्रिया शुरू करने से पहले 20 डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रिया को पतला किया गया था। 6.90-8.30 पीपीएम पर अनुनाद परीक्षण यौगिक से उत्पन्न होते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9: प्रतिनिधि कूद-dilution काउंटर स्क्रीन 19एफ NMR का उपयोग कर UNH गतिविधि के साथ एक यौगिक के लिए assays. 200 डिग्री सेल्सियस और 20 डिग्री सेल्सियस पर एक यौगिक के लिए 19एफ एनएमआर प्रतिक्रिया स्पेक्ट्रम के क्षेत्र, 30 मिनट नियंत्रण स्पेक्ट्रम के साथ। एंजाइम प्रतिक्रियाओं के प्रारंभ होने से पहले 200 डिग्री सेल्सियस यौगिक पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था, प्रतिक्रिया शुरू करने से पहले 20 डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रिया को पतला किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्र 10: प्रतिनिधि 1एच एनएमआर का उपयोग कर पूरे कोशिकाओं में assays. ई. कोलाई कोशिकाओं के 280 डिग्री सेल्सियस या बफर (0, 15, और 30 मिनट) या सेल विकास मीडिया supernatant (30 मिनट) में resuspended युक्त नमूनों के लिए 1एच एनएमआर प्रतिक्रिया स्पेक्ट्रम के क्षेत्रों। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्र 11: प्रतिनिधि 19एफ एनएमआर का उपयोग कर पूरे कोशिकाओं में assays. ई. कोलाई कोशिकाओं के 280 डिग्री सेल्सियस या तो युक्त नमूनों के लिए 19एफ एनएमआर प्रतिक्रिया स्पेक्ट्रम के क्षेत्र बफर (0, 15, 30, और 60 मिनट) या सेल विकास मीडिया supernatant (60 मिनट) में resuspended. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल आम तौर पर कई एंजाइमों के लिए लागू होते हैं, बशर्ते कि substrates और / तथापि, यह महत्वपूर्ण है कि सब्सट्रेट की सांद्रता इसके केएम मूल्य के करीब है और एक उचित समय सीमा के भीतर एनएमआर प्रयोग में पता लगाने के लिए पर्याप्त उच्च है। एक सब्सट्रेट एकाग्रता 2-3x से अधिक नहीं Km मूल्य प्रतिस्पर्धी, गैर प्रतिस्पर्धी, और uncompetitive inhibitors4का पता लगाने के लिए इष्टतम है. जैसा कि यूएच, सब्सट्रेट, Km मान के रूप में कम के रूप में 15 डिग्री सेल्सियस के लिए यहाँ प्रदर्शन उपयुक्त हैं. सीएच3 या CF3 संकेतों के साथ substrates का उपयोग, क्रायोजेनिक जांच पर एनएमआर डेटा संग्रह के साथ मिलकर, इस सीमा को और भी कम कर सकते हैं15. एंजाइम जो 1 डिग्री सेल्सियस से नीचे के मानों को उपस्तर करते हैं, तथापि, एनएमआर प्रयोग के अंतर्निहित निम्न संवेदनशीलता के कारण इस विधि का उपयोग करके अध्ययन करना कठिन होता है। इन स्थितियों में, स्पेक्ट्रोफोटोमिति या फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रोस्कोपी अधिक उपयुक्त तकनीक हैं.

इन विधियों के अनुप्रयोग के लिए एक और सीमा एक उपयुक्त शमन एजेंट है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल के सभी निश्चित समय परख रहे हैं, एचसीएल के अलावा द्वारा 30 मिनट के बाद बुझा प्रतिक्रिया के साथ. AGNH और UNH दोनों के लिए, यह पहले से निर्धारित किया गया था कि एचसीएल तुरंत प्रतिक्रिया बंद कर दिया, और रखा यह9सप्ताह कीअवधि के लिए बंद कर दिया ,10. यह महत्वपूर्ण है क्योंकि प्रतिक्रियाओं के दर्जनों अक्सर एक साथ चला रहे हैं और फिर कई घंटे की अवधि में NMR डेटा संग्रह के लिए पंक्तिबद्ध. यह भी स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि सब्सट्रेट या उत्पाद संकेतों के गैर एंजाइमी गिरावट शमन करने के बाद लेकिन NMR डेटा संग्रह से पहले नहीं होता है. एचसीएल के अलावा, प्रतिक्रियाओं को बुझाने के अन्य सामान्य तरीके एक ज्ञात नैनोमोलर अवरोधक16 के अलावा होते हैं या, एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट से संबंधित प्रतिक्रियाओं के मामले में, चेलेटिंग एजेंट एथिलीनडिएमिनेटेरेटिक एसिड17के अलावा।

NMR आधारित गतिविधि परख जोड़ा मूल्य प्रदान करते हैं जब टुकड़ा स्क्रीनिंग या orthogonal परख के लिए उच्च throughput स्क्रीनिंग हिट4मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया. बाध्यकारी परख के विपरीत, NMR आधारित गतिविधि परख की पहचान या वास्तविक inhibitors के रूप में यौगिकों की पुष्टि. गतिविधि परख भी बाध्यकारी परख से अब तक कम लक्ष्य एंजाइम का उपयोग करें. एक ही तरीके प्रतिवर्ती, लक्ष्य विशेष गतिविधि को मान्य करने के लिए बाहर किए गए काउंटर स्क्रीन के दो प्रकार के लिए अविश्वसनीय रूप से मजबूत कर रहे हैं और artifactual परख गतिविधि18बाहर शासन. डिटर्जेंट और कूद-डिल्यूशन परख कोलाइडयन एकत्रीकरण के लिए काउंटर स्क्रीन कर रहे हैं19 और अपरिवर्तनीय निषेध20, क्रमशः. यौगिकों कि इन परीक्षणों के पास औषधीय रसायन विज्ञान और संरचना निर्देशित अवरोध करनेवाला अनुकूलन के लिए प्रारंभिक अंक मान्य कर रहे हैं. NMR आधारित गतिविधि परख के रूप में परियोजना नैनोमोलर अवरोधकरनेियों की ओर प्रगति यौगिक गतिविधि डेटा प्रदान करने के लिए जारी रख सकते हैं.

अंत में, पूरी कोशिकाओं में प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए इन assays की उपयोगिता उल्लेखनीयहै 21. इन-सेल एंजाइम के निषेध के साथ शुद्ध एंजाइम के सहसंबंधित अवरोध से मनाया गया फेनोटाइपिक प्रभाव22के अंतर्निहित जैव रासायनिक तंत्र का निश्चित प्रमाण प्रदान किया जाएगा। यहाँ प्रस्तुत दो एंजाइमों के लिए, वांछित phenotypic प्रभाव व्यवहार्यता की हानि है (एंटीट्राइकोमोनल गतिविधि). शुद्ध एंजाइम अवरोध के बीच एक संबंध, इन-सेल एंजाइम अवरोध, और परजीवी सेल मौत कार्रवाई के अवरोधक तंत्र का सबूत का गठन होगा.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम AgNH और UNH एंजाइमों प्रदान करने के लिए Astraeca टुकड़ा पुस्तकालय और डॉ डेविड Parkin से यौगिकों प्रदान करने के लिए डॉ डीन ब्राउन धन्यवाद. इस प्रकाशन में रिपोर्ट अनुसंधान पुरस्कार संख्या R15AI128585 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था बी जे एस. सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.अनुसंधान भी एक Horace जी McDonell ग्रीष्मकालीन अनुसंधान फैलोशिप एस एन एम, एक Landesberg परिवार को सम्मानित द्वारा समर्थित किया गया था जे.ए.जी., और संकाय विकास अनुदान और फ्रेडरिक Bettelheim अनुसंधान पुरस्कार Adelphi विश्वविद्यालय से बी.जे.एस.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AGNH Purified in-house N/A TVAG_213720
UNH Purified in-house N/A TVAG_092730
Adenosine Sigma A9251
5-Fluorouridine Sigma F5130
Dimethyl sulfoxide-D6 Cambridge Isotope Labs DLM-10-100 D, 99.9%
Potassium phosphate monobasic Sigma P0662
Potassium phosphate dibasic Sigma P3786
Potassium chloride Sigma P9541
Deuterium oxide Cambridge Isotope Labs DLM-4-100 D, 99.9%
Hydrochloric acid Fisher Chemical A144212
Triton X-100 Sigma X100
3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP) Sigma 269913 D, 98%
2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2 Sigma 612197 D, 99.5%
Pipette Gilson F123602 PIPETMAN Classic P1000
Pipette Gilson F123601 PIPETMAN Classic P200
Pipette Gilson F123600 PIPETMAN Classic P20
Microfuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
Conical tubes Corning 352099
Microcentrifuge Eppendorf 5418
Vortex mixer Fisher Scientific 02215365
NMR tubes Norell 502-7 Or as appropriate for the NMR
NMR spectrometer Bruker N/A AvanceIII500
Prism software GraphPad N/A Version 5.04

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References

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रसायन विज्ञान अंक 148 डिटर्जेंट काउंटर स्क्रीन एंजाइम गतिविधि परख आईसी50 मूल्य कूद-डिल्यूशन 1एच एनएमआर 19एफ एनएमआर पूरे सेल एनएमआर न्यूक्लिओसाइड राइबोहाइड्रोलेस
NMR-आधारित क्रियाकलाप परख संमिश्र निषेध, आईसी<sub>50</sub> मान, कृत्रिम गतिविधि, और न्यूक्लिओसाइड रिबोहाइड्रोलेस की संपूर्ण-कोशिका गतिविधि का निर्धारण करने के लिए
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Stockman, B. J., Kaur, A., Persaud,… More

Stockman, B. J., Kaur, A., Persaud, J. K., Mahmood, M., Thuilot, S. F., Emilcar, M. B., Canestrari, M., Gonzalez, J. A., Auletta, S., Sapojnikov, V., Caravan, W., Muellers, S. N. NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases. J. Vis. Exp. (148), e59928, doi:10.3791/59928 (2019).

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