כמותית מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI) משתמשת cy, לנסות לגילוי רגיש של הבדלים בשפע של אינטראקציות חלבונים בחלבון ממוקדות בין שתי דגימות. QMI ניתן לבצע באמצעות כמות קטנה של ביומטריה, אינו דורש תגים מהונדסים גנטית, והוא יכול להיות מותאם עבור כל רשת בעבר הגדרת חלבון אינטראקציה.
אינטראקציות חלבון חלבונים דינאמיות שולטות בהתנהגות התאית, מתנועתיות ועד לשכפול דנ א לסימני התמרה. עם זאת, מעקב אחר אינטראקציות דינמיות בין מספר חלבונים ברשת אינטראקציה חלבון היא קשה מבחינה טכנית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור כמותיים מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI), המאפשר הערכה כמותית של שינויי מקפלים באינטראקציות חלבונים המבוססות על מדידות זריחה יחסית של חלבונים במערכות משותפות שזוהו על ידי חשופים אפיסקופים מפני השטח (דגים). ב QMI, מכלולי חלבון מ-lysates תא הם immunoprecipitated על מיקרוספירות, ולאחר מכן נחקר עם נוגדן בתווית עבור חלבון שונה כדי לכמת את השפע של דגים. נוגדנים Immunoprecipitation מובחנות אזורים ספקטרליים שונים, אשר מאפשר cytometer זרם להבדיל immunoprecipitations מקבילים מרובים ובמקביל לכמת את כמות נוגדן בדיקה הקשורים לכל. QMI אינו דורש תיוג גנטי ניתן לבצע באמצעות ביומטריה מינימלית לעומת שיטות immunoprecipitation אחרות. QMI יכול להיות מותאם עבור כל קבוצה מוגדרת של שימוש בחלבונים, ולכן יש עד כה שימש לאפיון רשתות איתות בתאי T ו-הסינפסות העצבית גלוטמט. התוצאות הובילו ליצירת השערה חדשה עם יישומים פוטנציאליים אבחון וטיפולי. פרוטוקול זה כולל הוראות לבצע qmi, מן הבחירה הראשונית הפאנל הנוגדן דרך להפעיל בחני וניתוח נתונים. ההרכבה הראשונית של שיטת QMI כרוכה בסינון נוגדנים ליצירת פאנל, וקביעת מאגר פירוק מתאים. ההכנה הכימית הבאה כוללת מצמד מimmunoprecipitation נוגדנים לחרוזי מאגי, ונוגדנים ביולוגיים מבוססי ביוטילוטינג כך שהם יכולים להיות מסומנים על-ידי fluorophore streptavidin. כדי להפעיל את הבדיקה, ליפוסט מעורבב עם מאגחרוזים בן לילה, ולאחר מכן חרוזים מחולקים מודבטים עם נוגדנים בדיקה שונים, ולאחר מכן תווית fluorophore ולקרוא על-ידי cy, הזרמת לנסות. שני בדיקות סטטיסטיות מתבצעות כדי לזהות את הדגים שונים באופן משמעותי בין התנאים הניסיוניים, והתוצאות מתדמיינו באמצעות מפות חום או דיאגרמות קצה הצומת.
אינטראקציות חלבונים בחלבון חלבון מהוות מבני איתות מולקולריים ומבנים מורצפת המהווים את הבסיס התפקודי של רוב הפיזיולוגיה התאית1. תהליכים אלה מתוארים לעתים קרובות כמסלולים איתות ליניארי העוברים בין מצבים יציבים המבוססים על תשומות יחיד, אבל נתונים ניסיוניים ומידול מראים בבירור שהם מתפקדים כרשתות משולבות2,3, 4. במקרה של G חלבונים, קולטנים שונים לעתים קרובות יש את היכולת להפעיל את אותו חלבון G, ו קולטן יחיד יכול גם להפעיל יותר מסוג אחד של g חלבון5,6. על מנת מספר קטן יחסית של שיעורי חלבון G לווסת במיוחד מגוון רחב של פונקציות סלולריות כגון שידור סינפטית, רגולציה הורמונלי, ואת הגירה התא, תאים חייבים להשתלב ולהבחין אותות אלה4 , 5. ראיות הראו כי האות הזה ספציפיות, עבור החלבונים של G, כמו גם אחרים, נגזר בעיקר על בסיס של אינטראקציות חלבון חלבונים מכוונים דק ודינמיקה הטמפורלית שלהם1,3, ד , מיכל 5 , מיכל בן 6 , 7. מכיוון רשתות איתות מורכבות של מכלולי חלבון דינאמי עם מספר תשומות, תפוקות, ולולאות משוב, הזדמנות בודדת יש את ההזדמנות לשנות את המאזן הכולל הומסטטי של הפיזיולוגיה של התא4 ,7. כעת מוסכם באופן נרחב כי האיתות צריך להיבדק מנקודת מבט של רשת כדי להבין טוב יותר כיצד השילוב של תשומות מרובות שולט בפונקציות הסלולר הדיסקרטית בבריאות ובמחלות7,8, . תשע,עשר,11,12,13 לאור זה, כמותית מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI) פותחה כדי לאסוף תפוקה בינונית, נתונים כמותיים על שינויים לקפל ברשתות מגע דינמי של חלבון.
QMI הוא שיטת נוגדן מבוססת שבו ליפוסט התא הוא מודבטים עם פאנל של נוגדנים immunoprecipitation כי הם מצמידים מגנטי חרוזים מגנטיים המכילים יחסי צבע שונים של צבעי פלורסנט. לאחר נוגדנים ספציפיים מצמידים לכיתות שונות חרוז מגנטי מאפשר בו co-immunoprecipitation של מספר חלבונים מטרה מתוך ליפוסט זהה. לאחר immunoprecipitation (IP), חרוזים מגנטיים הם מודבטים עם שנייה, fluorophore מעלה באוב נוגדן בדיקה (או נוגדן biotinylated בשילוב עם fluorophore מצועם streptavidin). שיתוף אסוציאציות בין החלבונים המוכרים על ידי כל נוגדן IP בדיקה הצמד, או דגים (חלבונים במערכות משותפות שזוהו על ידי אפיסקופים חשופים משטח), מזוהים אז על ידי הזרמת cy, וניתן לכמת בהשוואה בין שונות תנאים לדוגמה14. איורים באיור 1 להראות את השלבים המעורבים בהפעלת שיטת qmi, כולל דיאגרמה של חרוזים מגנטיים עם immunoprecipitated מתחמי חלבון המסומנים על ידי פלואור בדיקה בדיקת נוגדנים (איור 1ג).
הרגישות של QMI תלוי בריכוז החלבון של ליפוסט ביחס למספר חרוזים מגנטיים המשמשים לimmunoprecipitation, והשגת החלטה לזהות 10% מקפלים שינויים דורש רק כמות קטנה של חומר התחלתי לעומת אחרים שיתוף IP שיטות14,15. לדוגמה, כמות חומר ההתחלה שנעשה בו שימוש QMI דומה לזה הנדרש עבור כריך חיסוני מקושר אנזים (אליסה), אבל אינטראקציות מרובות מזוהים בתוך שיטת QMI אחת. Qmi בחני באמצעות 20 IPs ו 20 מטרות המחקר בוצעו באמצעות 1-5 x 105 הראשי T תאים מבודדים מתוך 4 ביופסיה העור, P2 synaptosomal ההכנות מ 3 מ”מ בסעיף ילתית של קליפת העכבר הקדם, או 3 x 106 העכבר הראשי העיקרי , נוירונים, מ,מאוד. רגישות זו גורמת QMI שימושי ניתוח של תאים או רקמה עם זמינות מוגבלת, כגון דגימות קליניות.
QMI יכול להיות מותאם עבור כל רשת האינטראקציה הקודמת שהוגדרו חלבון (בתנאי שנוגדנים זמינים), ועד היום פותחה כדי לנתח את קולטן האנטיגן של תא T (TCR) מערכת המשנה של חלבונים ב glutamatergic הסינפסות בנוירונים מיכל בן 17 , 18. במחקרים של האיתות קולטן תא T, qmi השתמשו לראשונה לזהות שינויים גירוי המושרה בדגים, ולאחר מכן כדי להבחין חולים אוטואימוניות מקבוצת שליטה, לזהות מאותת אוטואימוניות אנדוסוגני, ולבסוף כדי ליצור השערה מעורבים רשת משנה לא מאוזנת הקשורה למחלה של אינטראקציות14. לאחרונה, את אותו פאנל QMI שימש כדי לקבוע כי thymocyte הבחירה נקבעת על ידי כמותית ולא הבדלים איכותניים ב-TCR-המשויך חלבון איתות19. בנוירונים, QMI שימש לתאר הסדר מחדש הקלט של רשת אינטראקציה חלבון עבור סוגים שונים של אותות קלט באופן התומך מודלים חדשים המתעוררים של הפלסטיות הסינפטית17. בנוסף, זה הפאנל QMI סינפטית שימש כדי לזהות הבדלים שבעה מודלים של העכבר אוטיזם, אשכול את המודלים לקבוצות משנה על בסיס הביוחתימות שלהם דגים, ובמדויק ההשערה גרעון מולקולרי משותף כי היה בעבר לא מוכר באחד מדגמי16. גישה דומה יכולה לשמש לצורך המסך עבור קבוצות מסחר אחרות שעלולות להגיב לטיפולי סמים שונים, או להקצות תרופות לקבוצות מסוימות המגיבים לתגובה. QMI יש יישומים פוטנציאליים באבחון, משנה הקלדה החולה, פיתוח סמים, בנוסף למדע בסיסי.
כדי להרכיב פאנל נוגדן QMI, הקרנת נוגדנים ראשונית ופרוטוקולי בחירה מתוארים בסעיף 1, להלן. לאחר לוחות נוגדנים מזוהים, פרוטוקולים עבור בניינים של נוגדנים שנבחרו לחרוזים מגנטיים עבור IP, ו עבור biotinylation של נוגדנים בדיקה שנבחרו, מתוארים בסעיף 2. הפרוטוקול להפעלת הערך QMI בתאים או ברקמות מתואר בסעיף 3. לבסוף, מאחר שניסוי בודד יכול להפיק ~ 5 x 105 נקודות נתונים בודדות, הוראות וקודי מחשב כדי לסייע בעיבוד נתונים, ניתוח והדמיה מסופקים בסעיף 4. מבט כולל על זרימת העבודה המתוארת בסעיפים 2-4 מוצג באיור 1.
השקאת QMI דורש השקעה ניכרת בפיתוח פאנל הנוגדן, ציוד ריאגנטים, אבל ברגע שהנתון נקבע, ניתן לאסוף נתונים בעלי ממדים גבוהים התבוננות ברשתות אינטראקציה חלבון כפי שהם מגיבים ניסויים בשליטת גירויים. מבחינה טכנית, QMI דורש ליטוף זהיר ומעקב של דגימת ומיקומים היטב נוגדן. תיוג בזהירות של לוחיות הנתונים…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להכיר את טסה דיוויס לתרומות חשובות לפיתוח שיטת QMI, וחברים נוכחיים ולשעבר של מעבדות סמית ‘ ו-Schrum להדרכה טכנית ולקלט אינטלקטואלי. עבודה זו ממומנת על ידי NIMH מענקים R01 MH113545 ו R00 MH 102244.
96-well flat bottomed plates | Bio Rad | 171025001 | |
96-well PCR plates | VWR | 82006-704 | |
Bioplex 200 System with HTF | Bio Rad | 171000205 | modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details |
Bio-Plex Pro Wash Station | Bio Rad | 30034376 | |
BSA | Sigma | ||
CML beads | Invitrogen | C37481 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39256 | |
MagPlex Microspheres | Luminex | MC12xxx-01 | xxx is the 3 digit bead region |
Melon Gel IgG Spin Purification Kit | Thermo Scientific | 45206 | used for antibody purification |
MES | Sigma | M3671 | |
Microplate film, non-sterile | USA Scientific | 2920-0000 | |
Phosphotase inhibitor cocktail #2 | Sigma | P5726 | |
Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
Sandwich Prep Refrigerator | Norlake | SMP 36 15 | for custom refrigeration of Bioplex 200 |
Sodium fluoride | Sigma | 201154 | |
Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
Streptavidin-PE | BioLegend | 405204 | |
Sulfo NHS | Thermo Scientific | A39269 | |
Tris | Fisher Scientific | BP152 |