Summary
本明細書では、アルツハイマー病モデルマウスの学習能力および記憶能力を評価し、それらを治療するための手動鍼治療の効果を評価するためのモリス水迷路試験を実施するプロトコルについて説明する。
Abstract
モリス水迷路(MWM)実験は、実験動物に泳ぐ力を与え、水中に隠されたプラットフォームを見つけることを学びます。これは、動物の学習と記憶を評価するために科学的研究で広く使用されています。MWMテストの広範な使用のために、視覚的な実験プロトコルは、研究者のために不可欠です。この原稿は、MWMテストのプロトコルを紹介するために、最新の研究を使用しています。アルツハイマー病 (AD) 記憶と認知機能の進行性の損失によって特徴付されます。.ADに使用される代替および補完的な処置は手動鍼治療(MA)である。ADモデルマウスの学習能力および記憶能を評価するために、MWM試験を実施した。MWMの可視プラットフォームトライアル、隠しプラットフォームトライアル、プローブトライアル、および逆転トライアルを使用して、空間学習とメモリ能力を評価しました。目に見えるプラットフォームの試験では、異なるグループのマウスの水泳速度と脱出遅延は有意に異なっていなかった。隠しプラットフォームと反転の試行では、AD グループは長いエスケープ待機時間を示しました。脱出待ち時間はMA治療後に有意に減少した。低いプラットフォームのクロスオーバー数とプローブ試験におけるSW象限の時間の割合は、MA治療後に増加した(p< 0.05またはp < 0.01)。MWM試験の結果は、MAがADモデルマウスの空間学習および記憶能力を効果的に改善できることを示唆している。厳格な実験操作は、結果の信頼性を保証しました。
Introduction
現在、MWM実験は、動物1の空間学習と記憶を評価するための最も広く使用され、標準的な行動実験となっています。当初は英国の心理学者リチャード・G・モリスによって設計され、常に改善されています。最小トレーニング、種間ユーティリティ、体重の違いに対する感受性の低さ、MWMの繰り返し試験能力などの多くの利点は、認知機能2を評価するための最良の方法です。アルツハイマー病(AD)は、主に記憶処理および認知機能3の低下を特徴とする主要な医学的問題である。MWMは、ADモデル動物の学習能力と記憶能力および介入方法の有効性を評価するために不可欠な実験手段である。MWM実験は一般的に時間がかかり(6~11日)、多くの可変因子4を含みます。水迷路の実験に関する多くの記事がありますが、実際には、研究者は一貫したプロトコルを欠いています。したがって、直感的で厳格なプロトコルプロセスビデオは特に重要です。前の実験を例5として用いて、MWMのすべてのステップについて説明する。MWMを使用して、以前の研究は、鍼治療がADモデルマウス5、6、7の症状を緩和できることを示唆した。
本明細書では、最近の研究5で使用されるMWMプロトコルは、研究者がADモデル動物の空間学習および記憶を評価するための簡可能で目に見える方法を提供するために記載されている。
Protocol
このプロトコルは、北京中国医学大学動物倫理委員会によって承認され、中国の実験動物のケアと使用のためのすべてのガイドラインに従っていました。実験手順中に偶発的な死亡状況はなく、この研究で安楽死させる動物は必要ない。
1. 準備
- 30個の雄SAMP8マウスと10匹の雄SAMR1マウスを購入する(年齢:8ヶ月)。
- マウスを24 ±2 °Cの温度と12時間の暗い/光サイクルで個々の換気ケージに個別に収納します。
- 標準的なペレットダイエット利用可能なアドリビタムでマウスに餌を与え、無菌飲料水を提供します。
- 実験前に5日間、すべてのマウスを環境に順応させる。
2. 動物のグループ化
- ランダムに30匹のSAMP8マウスを3つのグループ(n=10/グループ):AD群、手動鍼治療(MA)群、および医学(M)群に分ける。
- 通常対照(N)群6として10匹のSAMR1マウスを使用する。
3. 塩酸ドネペジル錠剤の投与
- ドネペジル塩酸塩錠剤(5mg/タブレット)を粉砕し、蒸留水の50 mLに溶解します。
- MA治療およびMWM検査が行われる日を含む実験全体の間に1日1回経口切外行為を使用してマウスに1mg/kgの用量でステップ3.1で調製した薬を送出する。
4. 手動鍼治療の管理
- MA群のマウスをマウスバッグに固定する。
- 使い捨ての無菌鍼針(0.25mm x 13mm)を使用し、20分間、バイホイ(GV20)とインタン(GV29)5にMAの平らないばらの方法を適用します。
- MA治療とMWM試験が行われる日を含め、実験全体の間に約15分間、約180r/minの速度で90°以内に操作を双方向に旋回します。
5. MWMテスト
注:15日間連続治療後24時間で、4群のマウスをMWM試験に供する。目に見えるプラットフォームのトライアル、隠れたプラットフォームのトライアル、プローブトライアル、逆転トライアルを順番に実施します。
- MWM テストの準備をします。
- MWM装置と信号集録処理システムを、遮音性を維持するように設計された実験室に配置する。
- MWM装置の中央に不透明な布で囲まれた円形の白いタンク(直径= 90cm、高さ=50cm)を置きます。
- ビデオカメラをMWMデバイスの天井に固定し、自動追跡システムを備えたビデオレコーダーに接続してデータを収集します。
- 水迷路タンクを、北(N)、南(S)、東(E)、西(W)というラベルの付いた2本の相互垂直線を使用して、4つの等しい領域に均等に分割します。プール領域を概念的に同じサイズ (NE、NW、SW、および SE) の 4 つの象限に分割します。
- マウスの見えない場所で、各象限の壁に異なる図形の視覚的な手掛かりを視覚的な参照として配置します (正方形、三角形、円など)。
注:遠位キューは、プラットフォームを見つけるための動物のナビゲーション基準点です。したがって、テスト中に移動しないでください。研究者の位置は、潜在的な遠位の手掛かりであり、MWMに影響を与えることができます.したがって、研究者は、動物がテストを実行するのを待っている間、マウスの視界から離れるべきです。 - 円形タンクに水を30cmまで充填し、電気ヒーターで22±2°Cに保ちます。
- 約150gの粉ミルクで水を不透明にします。
- 可視プラットフォームのトライアルを実行します。
- プラスチック製の円形プラットフォーム(直径= 9.5 cm、高さ28cm)を水面より1cm上の任意の象限にランダムに配置します。
- プラットフォームに黒いフラグを付けます。
- タンクの壁に面した4つの開始位置のいずれかから、水位で各マウスを穏やかに放します。マウスを水に落とさないで下します。
- マウスが水中に放されるとすぐにコンピュータ追跡プログラムを有効にします。
- プラットフォームを検索するために、各マウス60 sを与えます。各トライアルの最後に、各マウスをプラットフォームに置き、10~30個の場所に置きます。
- コンピュータ上のマウスの水泳軌道を観察し、マウスがプラットフォームを見つけるのにかかった時間をエスケープ遅延として記録し、泳ぐ速度を分析します。
- 各マウスをタオルで乾かし、電気ヒーターで温めます。動物が過熱するのを防ぐために、適切な熱源を使用してください。
注: 4 回の試行で 4 つの異なる開始作業領域のそれぞれで各マウスをプールに配置し、その後の試行ごとにプラットフォームを別の場所に移動します。各マウスを使用した 2 つの試行の間隔は 15 ~ 20 分です。
- 隠しプラットフォームのトライアル/プレース ナビゲーション テストを実行します。
- SE 作業領域にフラグを付けずに同じプラットフォームを配置します。
- 4 つの作業領域 (NE、NW、SW、N) のそれぞれからランダムにマウスをプールに配置し、4 回の試行を行います。2 回の試行の間に 15 ~ 20 分の時間間隔を使用します。
- 隠されたプラットフォームを検索するために、各マウス60 sを与えます。
- マウスがプラットフォームに上がった後の各試行のエスケープ遅延を記録して、後続の分析を行います。
- 各マウスをタオルで乾かし、電気ヒーターで温めます。
注: 2~6 日から隠しプラットフォームのトライアルを実施します。マウスが 60 s でプラットフォームを見つけられない場合は、マウスを動かしてプラットフォームに上がり、各トライアルの最後に 10 ~ 30 s の時間を許可します。プラットフォームと視覚的な手掛かりを一定の位置に配置して、マウスごとに 4 回の試行/日を 5 日間連続して実行します。
- プローブトライアルを実行します。
注: プール内の各マウスを新しい開始位置で見つけて、マウスの空間探索能力を観察します。- プラットフォームを削除します。
- プール内のタンク壁に面した各マウスを 60 s に対して 1 回見つけます。
- 迷路の水泳距離、水泳速度、プラットフォームのクロスオーバー番号を記録します。
- 各マウスをタオルで乾燥させ、試用後に暖かさを提供します。
- 取消トライアルを実行します。
注: 8 ~11 日から取消トライアルを実行します。- プラットフォームを NW 象限の中央に配置します (SE 作業領域の代わりに)。
- 隠しプラットフォームの試用版のセクションで説明されているように、手順 5.3.2 −5.3.5 に従います。
6. 統計分析
- 統計ソフトウェア(SPSS 20.0など)を使用して統計分析を実行します。
Representative Results
このプロトコルの時間軸図を図 1に示します。
図1:スタディプロトコルの時間軸図この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
時間軸は、この実験が合計21日間続いたことを示しています。治療は実験全体でマウスに適用され、MWM検査は15日間の治療の後に始まった。目に見えるプラットフォーム、隠れたプラットフォーム、プローブ、反転の試験が順番に行われました。
以前に公開されたDing et al.5から発表された結果は、MWM図2の典型的な結果として提示される。
図2:モリス水迷路試験の典型的な結果(n=10)。(A) 目に見えるプラットフォームトライアルにおけるラットの脱出遅延と遊泳速度の変化(B) 隠しプラットフォーム内の異なるグループ間のラットの脱出遅延の変化と逆転試験p値は、コントロールグループと比較して*p < 0.05および**p < 0.01です。記号 ## は、AD グループと比較して p < 0.01 を示します。(C) プラットフォームのクロスオーバー数の変化と、プローブ試験における異なる実験群の間で北西象限におけるラットが費やした時間の割合。各グループの可視プラットフォーム、隠しプラットフォーム、および反転試行の結果が表示されます (n = 10、平均 ± SD)。この図は Ding et al5から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2Aは、可視プラットフォーム試行の結果を示しています。MWMの初日にグループ間の脱出遅延または水泳速度に統計的な差は認められなかった。図 2Bは、2-6 日と 8-11 日の隠しプラットフォームと反転試行の結果を示しています。AD グループのエスケープ待機時間は、テストの各日に高いレベルのままでした。他の 3 つのグループのエスケープ遅延は徐々に減少しました。3-6 日と 8-11 日からのエスケープ遅延は、コントロール グループ (p < 0.01) よりも AD グループ内で長くなります。MAおよび薬物群におけるマウスの脱出遅延は、それぞれ2−6日および8−11日のAD群のマウスよりも短かった(p< 0.01)。図2Cは、プローブ試験の結果を示す。AD群におけるマウスのプラットフォームクロスオーバー数は、対照群のそれよりも統計的に低かった(p< 0.01)。MA グループのプラットフォームクロスオーバー番号が AD グループのクロスオーバー番号よりも高くなっています (p < 0.05)。AD群におけるマウスによるSW象限に費やされた時間の割合は、対照群のそれよりも有意に低かった(p< 0.01)。MA グループの SW 象限に費やされた時間の割合は、AD グループのそれよりも高かった (p < 0.01)。
Discussion
ビール水迷路やシンシナティ水迷路を含む多くの水迷路は、少なくとも1世紀前からありましたが、空間学習と記憶力を効果的かつ客観的に評価するためにMWMのみが広く使用されています。利点9.MWMを広範に使用しているにもかかわらず、この手順は常に最適に使用されているわけではありません。MWM実験は一般に時間がかかり、多くの可変因子の影響を受けます。空間学習と記憶力の変化を検出するのに役立つ効果的で信頼性の高い側面がいくつかあります。
4つの異なるMWM試験が行われた。可視プラットフォームトライアルはMWMの1日目に使用されました。動物がプラットフォームに直接泳ぐことができる場合、それは動物の水泳能力と視力が正常な10であることを示しました。Otnassは、目に見えるプラットフォームの試験を最初の11で行うべきであることを示唆しました。この研究における目に見えるプラットフォーム試験の結果は、4つのグループが同じ学習レベルで始まったことを意味しました。そこから、連続した実験を開始することができます。隠しプラットフォームの試験は、学習と記憶能力を獲得するマウスの能力を評価するために使用されました。プローブ試験は、隠しプラットフォームトライアルの終了後7日目、24時間に行われ、ワーキングメモリを評価しました。最後に、逆転トライアルは、ワーキングメモリ2を評価するために使用されました。MWMの4つの異なる試験の変化は、ADモデルマウスが低い学習と記憶能力を有し、MAがAD5にプラスの効果を有することを示した。
プールとプラットフォーム1のディメンションに関する特定の標準はありません。直径214cmのプールは、ほとんどのMWM研究で使用されています。Vorheesとウィリアムズは、同一のプロトコルを使用して、ラットが210cmプールよりも122cmプールでより速く学習することを実証しました。学習曲線の急な傾きは、122 cmの直径のプールがラットが12をナビゲートすることが非常に簡単であることを示しています。現在のプロトコルでは、ADマウスの老齢と弱い身長を考慮して、直径90cmのプールと直径9.5cmのプラットフォームを用いた。予備実験の結果、マウスはより大きな直径のプールでプラットフォームを見つけるのがより困難であることを示しました。したがって、大規模なプールでのテストは、グループ間の実際の違いを表すものではありません。実験動物は、より小さなプラットフォーム4を持つ大きなプールでプラットフォームを見つけるのに難しい時間を持っていました.したがって、プールとプラットフォームのサイズは、実験動物の実験要件と状態に応じて予備実験で最適化する必要があります。
MWM試験4を行う場合は、20~24°Cの温度の水を推奨します。高齢の実験動物は、冷水13において不十分に行われ、体温調節14の明確な年齢依存的損失を示す。本研究では、水温を20~24°Cに保つために、プールの底部にサーモスタットを配置した。研究結果は、4つのグループ5の間で水泳速度に有意な差を示さなかった。
MWMは認知機能を評価する強力な技術であり、現在の研究で広く使用されています。しかし、プールおよびプラットフォーム15、16のサイズを含むMWMテストを実行するための定義された、標準的な、一貫した機器はありません。異なる実験室はMWMのための異なった指定を有する。したがって、研究者は個々の実験要件に応じて適切な実験装置を選択し、研究者間の混乱を引き起こす可能性があります。予備実験も必要です。MWMのような基本的な実験に関しては、より多くの研究を行う必要があります。現在、実験ツールとしてのMWMの柔軟性は、目的の研究に従って基本的なプロトコルを選択する能力に過ぎない。したがって、このテストは、より深く認知機能を評価するために適用することができます。
Disclosures
著者らは、潜在的な利益相反を宣言しない。
Acknowledgments
恵陵天と寧明は共著者です。志剛李と景江は共に対応する著者である。この研究は、中国国立自然科学財団(Grant Nos. 81804178、81473774、および81503654)からの助成金によって支援されました。本明細書に記載されるプロトコルおよび結果は、寧ディン博士らの記事「アルツハイマー病のSAMP8マウスモデルにおける行動と脳血流の調節」に由来する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acupuncture needles | Beijing Zhongyan Taihe Medical Instrument Limited Company | 511526 | |
| desktop computer | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | Lenovo T4700D | |
| Donepezil Hydrochloride Tablet | Eisai China | H20050978 | Aricept |
| mice | Zhi Shan (Beijing) Academy of Medical Science | SCXK2014-0003 | |
| Mirros water maze device | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | WMT-100S | |
| mouse bags | home-made | ||
| Signal acquisition and processing system | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | BL-420N |
References
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Value of water mazes for assessing spatial and egocentric learning and memory in rodent basic research and regulatory studies. Neurotoxicology Teratology. 45, 75-90 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocol. 1 (2), 848-858 (2006).
- The state of the art of dementia research: New frontiers; World Alzheimer Report 2018. Alzheimer's Disease International. 9, 1-46 (2018).
- Vorhees, C. V., et al. Effects of neonatal (+)-methamphetamine on path integration and spatial learning in rats: effects of dose and rearing conditions. International Journal of Developmental Neuroscience. 26 (6), 599-610 (2008).
- Ding, N., Jiang, J., Xu, A., Tang, Y., Li, Z. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 13, 37 (2019).
- Ding, N., et al. Manual acupuncture suppresses the expression of proinflammatory proteins associated with the NLRP3 inflammasome in the hippocampus of SAMP8 mice. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2017, 1-8 (2017).
- Cao, J., et al. Behavioral changes and hippocampus glucose metabolism in APP/PS1 transgenic mice via electro-acupuncture at governor vessel acupoints. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 5 (2017).
- Amy, E., et al. Effects of sub-chronic donepezil on brain Abeta and cognition in a mouse model of Alzheimer's disease. Psychopharmacology. 230, 279-289 (2013).
- Garthe, A., Kempermann, G. An old test for new neurons: refining the Morris water maze to study the functional relevance of adult hippocampal neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 7, 63 (2013).
- Schoenfeld, R., Schiffelholz, T., Beyer, C., Leplow, B., Foreman, N. Variants of the Morris water maze task to comparatively assess human and rodent place navigation. Neurobiology of Learning and Memory. 139, 117-127 (2017).
- Otnass, M. K., Brun, V. H., Moser, M., Moser, E. I. Pretraining prevents spatial learning impairment after saturation of hippocampal long-term potentiation. Journal of Neuroscience. 19 (24), 49 (1999).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. Ilar Journal. 55 (2), 310-332 (2014).
- Vorhees, C. V., Skelton, M. R., Williams, M. T. Age-dependent effects of neonatal methamphetamine exposure on spatial learning. Behavioural Pharmacology. 18 (5-6), 549-562 (2007).
- Iivonen, H., Nurminen, L., Harri, M., Tanila, H., Puoliväli, J. Hypothermia in mice tested in Morris water maze. Behaviour Brain Research. 141 (2), 207-213 (2003).
- Lin, S. Y., et al. Ozone inhibits APP/Aβ production and improves cognition in an APP/PS1 transgenic mouse model. Neuroscience. , (2019).
- Zuo, Y., et al. Preoperative vitamin-rich carbohydrate loading alleviates postoperative cognitive dysfunction in aged rats. Behavioural Brain Research. 373, 112107 (2019).
