Summary
本文介绍了一种方案，用于进行莫里斯水迷宫测试，以评估阿尔茨海默氏症模型小鼠的学习和记忆能力，并评估人工针灸治疗它们的效果。
Abstract
莫里斯水迷宫（MWM）实验迫使实验动物游泳，并学会在水中找到一个平台。它被广泛用于科学研究，以评估动物的学习和记忆。由于MWM测试的广泛使用，视觉实验协议对研究人员至关重要。本手稿使用最新的研究来介绍 MWM 测试的协议。阿尔茨海默氏病 （AD） 的特点是逐渐丧失记忆和认知功能。用于AD的替代和补充治疗是手工针灸（MA）。为了评估AD模型小鼠的学习和记忆能力，进行了MWM测试。利用MWM的可见平台试验、隐藏平台试验、探针试验和反转试验来评估空间学习和记忆能力。在可见平台试验中，不同组小鼠的游泳速度和逃生延迟没有显著差异。在隐藏平台和反转试验中，AD 组显示延迟时间很长。MA 治疗后，逃生延迟显著降低。在 MA 处理后，在探针试验中，低平台交叉次数和 SW 象限中的时间比例增加（p < 0.05 或 p < 0.01）。MWM试验结果表明，MA能有效提高AD模型小鼠的空间学习和记忆能力。严格的实验操作保证了结果的可靠性。
Introduction
目前，MWM实验已成为评价动物空间学习和记忆的最广泛应用和标准行为实验。它最初是由英国心理学家理查德·莫里斯设计的，并不断得到改进。许多优点，如最少的训练，跨物种效用，对体重差异不敏感，以及MWM的重复测试能力，使其成为评估认知功能的最佳方法2。阿尔茨海默氏病（AD）是一个主要的医学问题，主要表现为记忆处理和认知功能下降3。MWM是评价AD模型动物的学习和记忆能力以及干预方法有效性的一种不可或缺的实验手段。MWM实验通常耗时（6~11天），涉及许多可变因素4。虽然有许多关于水迷宫实验的文章，但在实践中，研究人员缺乏一个连贯的协议。因此，直观而严格的协议流程视频尤为重要。使用前面的实验作为示例5，描述了MWM的所有步骤。使用MWM，以前的研究表明，针灸可以缓解AD模型小鼠5，6，7的症状。
本文介绍了最近研究5中使用的MWM协议，为研究人员提供了一种简单而可见的方法，用于评估AD模型动物的空间学习和记忆。
Protocol
该协议经北京中医药大学动物伦理委员会批准，符合《中国实验室动物护理与使用指南》。在实验过程中没有意外死亡的情况，在这项研究中也不需要对动物进行安乐死。
1. 准备
- 购买30只雄性SAMP8小鼠和10只雄性SAMR1小鼠（年龄：8个月）。
- 以24°2°C的温度和12小时的黑暗/光循环将小鼠单独安置在单独的通风笼中。
- 用标准颗粒饮食喂养小鼠，并提供无菌饮用水。
- 在实验前，将所有小鼠适应环境5天。
2. 动物分组
- 随机将30个SAMP8小鼠分成三组（n = 10/组）：AD组、手动针灸（MA）组和医学（M）组。
- 使用10个SAMR1小鼠作为正常对照（N）组6。
3. 盐酸二甲苯片剂的管理
- 粉碎多普齐尔盐酸片剂（5毫克/片），并将其溶解在50 mL的蒸馏水中。
- 在整个实验期间，每天8次，包括进行MA治疗和MWM测试的日子，每天使用口服气肿一次，以1mg/kg的剂量向小鼠提供步骤3.1中制备的药物。
4. 人工针灸管理
- 将MA组的小鼠固定在小鼠袋中。
- 使用一次性无菌针灸针（0.25毫米 x 13毫米），在白辉（GV20）和银塘（GV29）5对鼻子上应用MA的扁平刺法20分钟。确保针深度为0.2~0.3厘米。
- 在整个实验过程中，每次每次 15 秒，包括执行 MA 治疗和 MWM 测试的天数，在 90° 范围内以大约 180 r/min 的速度双向旋转操作。
5. MWM测试
注：在连续15天治疗后24小时，对四组小鼠进行MWM测试。有序进行可见平台审判、隐藏平台审判、探究审判和逆转审判。
- 准备 MWM 测试。
- 将MWM器件和信号采集和处理系统放置在实验室中，用于保持隔音。
- 将圆形白色储罐（直径 = 90 厘米，高度 = 50 厘米）包围在 MWM 设备中间，由不透明布包围。
- 将摄像机固定在 MWM 设备的天花板上，并将其连接到带有自动跟踪系统的录像机以收集数据。
- 使用两条相互垂直的线（标为北 （N）、南 （S）、东 （E） 和西 （W），将水迷宫水箱平均划分为四个相等的区域。在概念上将池区域划分为四个大小相同的象限（NE、NW、SW 和 SE）。
- 在鼠标的视线中，将不同形状的视觉提示作为可视参考值（例如，正方形、三角形和圆形）放在每个象限的墙上。
注：远端提示是动物定位平台的导航参考点。因此，请勿在测试期间移动它们。研究者的位置是一个潜在的远端提示，可以影响MWM。因此，研究人员在等待动物进行试验时，应远离老鼠的视线。 - 用电加热器将水注到30厘米深的圆形水箱中，并保持在22~2°C。
- 用大约 150 克奶粉使水不透明。
- 执行可见平台试用。
- 将塑料圆形平台（直径 = 9.5 厘米;高度 = 28 厘米）放置在水面上方 1 厘米处随机放置任何象限。
- 在平台上放一个黑色的旗帜。
- 从面向水箱壁的四个起始位置之一，将每只鼠标轻轻地从水中放入水中。不要将鼠标放入水中。
- 一旦鼠标释放到水中，立即激活计算机跟踪程序。
- 给每只鼠标60s搜索平台。在每个试验结束时，将每只鼠标放在平台上，让它在平台上停留 10-30 s。
- 观察电脑上老鼠的游泳轨迹，记录鼠标寻找平台的时间作为逃生延迟，并分析游泳速度。
- 用毛巾擦干每只鼠标，用电加热器加热。请务必使用适当的热源，以防止动物过热。
注：将每只鼠标放入四个不同起始象限的池中，进行四次试验，并在每次后续试验时将平台移动到不同位置。使用每只鼠标进行两次试验之间的间隔为 15-20 分钟。
- 执行隐藏的平台试用/放置导航测试。
- 在 SE 象限中放置同一平台而不放置标志。
- 从面向池壁的四个象限（NE、NW、SW、N）中随机将鼠标放入池中，进行四次试验。在两次试验之间使用 15-20 分钟的时间间隔。
- 给每只鼠标60s搜索隐藏的平台。
- 在鼠标爬到平台进行后续分析后，记录每次试验的逃生延迟。
- 用毛巾擦干每只鼠标，用电加热器加热。
注：从第 2 天到 6 天开始执行隐藏平台试用。如果鼠标在 60 s 内找不到平台，请引导鼠标爬到平台，并在每次试用结束时将其停留在 10-30 s。连续5天对每只鼠标执行4次试验/天，平台和视觉提示处于恒定位置。
- 执行探测试验。
注：将池中的每一只鼠标定位在新颖的起始位置，以观察鼠标的空间探索能力。- 卸下平台。
- 找到池中面向罐壁的每个鼠标一次，为 60 s。
- 在迷宫中记录游泳距离、游泳速度和平台交叉编号。
- 用毛巾擦干每只老鼠，并在试验后提供温暖。
- 执行反转试验。
注：从第8天至11天开始执行反转试验。- 将平台放置在 NW 象限的中间（而不是 SE 象限）。
- 按照隐藏平台试用部分中详述的步骤 5.3.2 +5.3.5 进行操作。
6. 统计分析
- 使用统计软件（例如，SPSS 20.0）执行统计分析。
Representative Results
此协议的时间轴图如图1所示。
图1：研究协议的时间轴图。请点击此处查看此图的较大版本。
时间轴显示，这个实验总共持续了21天。在整个实验中，该治疗应用于小鼠，MWM测试在治疗15天后开始。对可见平台、隐藏平台、探针和反转试验进行了有序的测试。
此前公布的丁等人5年的结果，作为MWM图2的典型结果。
图2：莫里斯水迷宫测试的典型结果（n = 10）。（A） 可见平台试验中不同组别大鼠的逃生延迟和游动速度变化。（B） 隐藏平台和反转试验中不同组别大鼠的逃逸延迟变化。与控制组相比，p 值为 _p < 0.05 和 _p < 0.01。符号 # 表示与 AD 组相比 p < 0.01。（C） 在探针试验中不同实验组中，平台交叉数的变化和西北象限中大鼠所花费时间的百分比。显示每个组中的可见平台、隐藏平台和反转试验的结果（n = 10，均值 = SD）。这个数字已由丁等人5修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2A显示了可见平台试验的结果。在MWM的第一天，各组在逃生延迟或游泳速度方面没有统计差异。图 2B显示了第 2 天和第 8 天/11 天的隐藏平台和反转试验的结果。在测试的每一天，AD 组的转出延迟都保持在较高水平。其他三组的逃生延迟逐渐降低。AD 组中第 3 天和第 8 天/11 天的转出延迟比控制组（p < 0.01）长。MA和药物组小鼠的逃生延迟短于AD组小鼠在2-6天和第8-11天（p<0.01）。图 2C显示了探测试验的结果。AD 组中的小鼠平台交叉数在统计上低于对照组（p < 0.01）。在统计上低于对照组。MA 组中的平台交叉编号高于 AD 组（p < 0.05）。）。AD 组中的小鼠在 SW 象限中所花费的时间比例明显低于对照组（p < 0.01）中的时间比例。MA 组中在 SW 象限中花费的时间比例高于 AD 组中的时间（p < 0.01）。
Discussion
虽然许多水迷宫，包括比尔水迷宫和辛辛那提水迷宫，已经存在了至少一个世纪，只有MWM被广泛用于有效和客观地评估空间学习和记忆能力，因为它有许多优势9.尽管广泛使用MWM，但该程序并不总是得到最佳使用。MWM实验通常需要很长时间，并且受许多可变因素的影响。有一些有效和可靠的方面，有助于检测空间学习和记忆能力的变化，应该加以考虑。
进行了四种不同的MWM试验。可见平台试验在MWM的第1天使用。如果动物能直接游到平台，说明动物的游泳能力和视力是正常的。奥特纳斯建议，可见平台试验应先于11日进行。本研究中可见平台试验的结果意味着四组开始在同一学习水平。从那里，可以开始连续的实验。隐藏平台试验用于评估小鼠获得学习和记忆能力的能力。探针试验于7日24时结束隐藏平台试验后进行，以评估工作记忆。最后，反向试验用于评估工作记忆2。MWM的四个不同试验的变化表明，AD模型小鼠的学习和记忆能力较低，MA对AD5有积极的影响。
池和平台1的尺寸没有具体标准。在大多数 MWM 研究中，使用直径为 214 厘米的池。Vorhees和Williams证明，在相同的协议下，老鼠在122厘米的池里比在210厘米的池里学习得更快;学习曲线的陡坡表明，直径122厘米的池子非常容易为大鼠导航12。在目前的协议中，考虑到AD小鼠的年老和身材虚弱，使用了一个直径为90厘米的池和9.5厘米直径的平台。初步实验结果表明，老鼠在直径较大的池里寻找平台的难度更大。因此，较大池中的测试并不表示组之间的实际差异。实验动物很难在一个更大的池子中找到平台，有一个较小的平台4。因此，在初步实验中，必须根据实验动物的实验要求和条件，优化池和平台的大小。
在20~24°C的温度下，建议水用于执行MWM测试4。老年实验动物在冷水中表现不佳，表明14岁的体温明显下降。在这项研究中，在池底放置了一个恒温器，使水的温度保持在20~24°C。研究结果显示，四组5组的游泳速度没有显著差异。
MWM是一种评估认知功能的强大技术，目前在研究中被广泛使用。但是，没有定义、标准、一致的设备来执行 MWM 测试，包括池和平台15、16的大小。不同的实验室对MWM有不同的规格。因此，研究人员根据各自的实验要求选择合适的实验装置，这会引起研究者的困惑。初步实验也是必要的。需要对MWM等基本实验进行更多的研究。目前，MWM作为实验工具的灵活性，仅在于根据研究目的选择基本方案的能力。因此，此测试可以应用于更深入地评估认知功能。
Disclosures
作者声明没有潜在的利益冲突。
Acknowledgments
田慧玲和丁宁是共同的第一作者。李志刚和蒋静是共同作者。这项研究得到了国家自然科学基金（第81804178号、81473774号、81503654号）的资助。本文所描述的方案与结果源于宁丁博士等人撰写的文章《人工针灸在阿尔茨海默病SAMP8小鼠模型中规范行为和脑血流》。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acupuncture needles | Beijing Zhongyan Taihe Medical Instrument Limited Company | 511526 | |
| desktop computer | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | Lenovo T4700D | |
| Donepezil Hydrochloride Tablet | Eisai China | H20050978 | Aricept |
| mice | Zhi Shan (Beijing) Academy of Medical Science | SCXK2014-0003 | |
| Mirros water maze device | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | WMT-100S | |
| mouse bags | home-made | ||
| Signal acquisition and processing system | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | BL-420N |
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