Summary
Heri, en protokoll for å gjennomføre Morris vann labyrint tester for å evaluere evnen til læring og minne om Alzheimers sykdom modell mus og å vurdere effekten av manuell akupunktur for behandling av dem er beskrevet.
Abstract
En Morris vann labyrint (MWM) eksperiment tvinger eksperimentelle dyr å svømme og lære å finne en plattform gjemt i vannet. Det er mye brukt i vitenskapelig forskning for å vurdere læring og minne om dyr. På grunn av utstrakt bruk av MWM test, visuelle eksperimentelle protokoller er avgjørende for forskere. Dette manuskriptet bruker de nyeste studiene til å innføre protokollen for MWM-testen. Alzheimers sykdom (AD) er preget av en progressiv tap av hukommelse og kognitiv funksjon. En alternativ og komplementær behandling som brukes for AD er manuell akupunktur (MA). For å vurdere lærings-og hukommelses mulighetene til AD-MWM-mus, ble testen utført. Det synlig plattform prøve, gjemt plattform prøve, sonde prøve, og reversering prøve av MWM var pleide vurdere romlig innlæring og hukommelse evne. I den synlige plattform prøveperioden var svømmehastigheten og flukt forsinkelsen til mus i ulike grupper ikke signifikant annerledes. I den skjulte plattformen og tilbakeførings forsøkene viste AD-gruppen en lang flukt ventetid. Flukten latency redusert betraktelig etter at MA behandling. Lav plattform crossover nummer og andelen av tiden i SW kvadrant i sonden rettssaken økte etter at MA behandling (p < 0,05 eller p < 0,01). Resultatene av MWM testene tyder på at MA effektivt kan forbedre den romlige læring og hukommelse evner av AD-modellen mus. Strenge eksperimentelle operasjoner gitt garanti for påliteligheten av resultatene.
Introduction
Foreløpig MWM eksperimentet har blitt den mest brukte og standard atferds-eksperiment for å evaluere den romlige læring og minne av dyr1. Det ble opprinnelig designet av den britiske psykologen Richard G. Morris og har stadig blitt forbedret. Mange fordeler som minimal trening, Cross-Art nytte, insensitivitet til forskjeller i kroppsvekt, og gjentatte tester evne til MWM gjør det den beste metoden for å vurdere kognitiv funksjon2. Alzheimers sykdom (AD) er et stort medisinsk problem, først og fremst preget av en nedgang i minnebehandling og kognitiv funksjon3. MWM er en uunnværlig eksperimentell måte å evaluere læring og hukommelse evne til AD-modellen dyr og effektiviteten av intervensjon metoder. MWM eksperimenter er vanligvis tidkrevende (6 – 11 dager) og involverer mange variable faktorer4. Selv om det er mange artikler om vann labyrint eksperimenter, i praksis, mangler forskerne en helhetlig protokoll. Derfor er en intuitiv og streng protokoll prosess video spesielt viktig. Ved hjelp av et tidligere eksperiment som et eksempel5, beskrives alle TRINNENE i MWM. Ved hjelp av MWM foreslo tidligere studier at akupunktur kunne lindre symptomene på annonsemodell mus5,6,7.
Heri, MWM protokollen som brukes i en fersk studie5 er beskrevet for å gi en enkel og synlig metode for forskere å vurdere romlig læring og minne om ad-modellen dyr.
Protocol
Denne protokollen ble godkjent av Animal etikk Committee of Beijing University of Chinese Medicine, og det var i samsvar med alle retningslinjer for Stell og bruk av laboratorium dyr i Kina. Det var ingen tilfeldig død situasjon under eksperimentell prosedyre, og ingen dyr som trengs for å bli euthanized i denne studien.
1. forberedelse
- Kjøp 30 mannlige SAMP8 mus og 10 mannlige SAMR1 mus (alder: 8 måneder).
- Hus musene individuelt i individuelle ventilasjons bur ved en temperatur på 24 ± 2 ° c og en 12 h mørk/lys syklus.
- Feed musene med en standard pellet diett tilgjengelig annonse lib og gir sterilt drikkevann.
- Acclimate alle musene til miljøet i 5 dager før eksperimentering.
2. gruppering av dyr
- Dividere tilfeldig 30 SAMP8-mus i tre grupper (n = 10/gruppe): AD-gruppen, manuell akupunktur (MA) gruppe og medisin (M) gruppe.
- Bruk 10 SAMR1-mus som normal kontroll (N) gruppe6.
3. administrering av donepezil hydrochloride tabletter
- Knus en donepezil hydrochloride tablett (5 mg/tablett) og løs den opp i 50 mL destillert vann.
- Lever legemidlet som er klargjort i trinn 3,1 ved doser på 1 mg/kg til musene ved bruk av en oral gavage en gang daglig8 under hele eksperimentet, inkludert DAGENE da ma-behandling og MWM-tester utføres.
4. administrering av manuell akupunktur
- Nakkens musene av MA-gruppen i muse poser.
- Bruk en gangs sterile akupunktur nåler (0,25 mm x 13 mm) og påfør flat Torn metoden for MA på Baihui (GV20) og Yintang (GV29)5 mot nesen i 20 min. Sørg for at nål dybden er 0,2 – 0,3 cm.
- Bidirectionally snurre manipulasjon innen 90 ° med en hastighet på ca 180 r/min hver 5 min for ~ 15 s hver gang under hele eksperimentet, inkludert dager når MA behandling og MWM tester utføres.
5. MWM-test
Merk: ved 24 h etter de 15 påfølgende dagene med behandling, underlagt musene i de fire gruppene til MWM testen. Gjennomføre den synlige plattformen rettssaken, skjult plattform rettssaken, sonde rettssaken, og reversering rettssaken i orden.
- Forbered deg på MWM testen.
- Plasser MWM-enheten og signal innsamlings-og prosesserings systemet i et eksperiment rom som er utformet for å opprettholde lydisolasjonen.
- Sett en sirkulær hvit tank (diameter = 90 cm, høyde = 50 cm) omgitt av en ugjennomsiktig klut i midten av MWM enheten.
- Fix et videokamera til taket av MWM enheten og koble den til en video opptaker med et automatisert sporingssystem for å samle inn data.
- Del vannet labyrint tank like inn i fire like områder ved hjelp av to gjensidig vinkelrette linjer, merket nord (N), Sør (S), øst (E), og vest (W). Del bassengområdet konseptuelt inn i fire kvadranter av samme størrelse (NE, NW, SW, og SE).
- Innenfor synet av musen, plassere visuelle pekepinner av ulike former på veggen i hver kvadrant som visuelle referanser (f. eks, firkanter, trekanter og sirkler).
Merk: ved å legge inn signaler er dyrets navigerings referansepunkter for lokalisering av plattformen. Du må derfor ikke flytte dem under testen. Posisjonen til forskeren er en potensiell, og kan påvirke MWM. Derfor bør forskeren holde seg ute av syne av mus mens du venter på dyret til å utføre testen. - Fyll den sirkulære tanken med vann til en dybde på 30 cm og oppretthold ved 22 ± 2 ° c med en elektrisk varmeovn.
- Gjengi vannet ugjennomsiktig med ca 150 g melkepulver.
- Utfør den synlige plattform prøveversjonen.
- Plasser en plast sirkulær plattform (diameter = 9,5 cm; høyde = 28 cm) 1 cm over vannflaten i en vilkårlig kvadrant.
- Sett et svart flagg på plattformen.
- Slipp hver mus forsiktig i vannet på vann-nivå fra en av de fire start steder mot tanken veggen. Ikke slipp musa ned i vannet.
- Aktiver datamaskinen sporing programmet så snart musen er sluppet ut i vannet.
- Gi hver mus 60 s for å søke etter plattformen. På slutten av hver prøve, plasserer hver mus på plattformen og la den holde på den for 10-30 s.
- Observer svømming baner av mus på datamaskinen, registrerer tiden musen tok for å finne plattformen som Escape latency, og analysere svømmehastigheten.
- Tørk hver mus med håndklær og varm den med en elektrisk varmeovn. Pass på at du bruker en passende varmekilde for å hindre at dyret blir overopphetet.
Merk: Plasser hver mus i bassenget på hver av de fire forskjellige Start kvadranter for fire forsøk, flytte plattformen til et annet sted med hver påfølgende rettssak. Intervallet mellom to forsøk ved hjelp av hver mus er 15 – 20 min.
- Utfør den skjulte plattform prøve/sted navigering test.
- Plasser den samme plattformen uten et flagg i SE kvadrant.
- Plasser musen tilfeldig i bassenget fra hver av de fire kvadranter (NE, NW, SW, N) vendt mot basseng veggen for fire forsøk. Bruk et tidsintervall på 15 – 20 min mellom to forsøk.
- Gi hver mus 60 s for å søke etter den skjulte plattformen.
- Registrer Escape latency for hver prøve etter at musen klatrer opp til plattformen for påfølgende analyse.
- Tørk hver mus med håndklær og varm den med en elektrisk varmeovn.
Merk: Gjennomfør den skjulte plattform prøveperioden fra dag 2 − 6. Hvis musen ikke finner plattformen i 60 s, lede musen til å klatre opp til plattformen og la den bli der i 10-30 s på slutten av hver prøve. Utfør fire forsøk per dag for hver mus i 5 sammenhengende dager, med plattformen og de visuelle signalene ved konstante posisjoner.
- Utføre sonde rettssaken.
Merk: Finn hver mus i bassenget på en roman startposisjon for å observere den romlige leting evne til musen.- Fjern plattformen.
- Finn hver mus som vender mot tank veggen i bassenget en gang for 60 s. Kontroller at startplasseringen er NW-kvadrant, som er kvadrant lengst borte fra SE-kvadrant.
- Ta opp svømme avstand, svømming hastighet, og plattformen crossover nummer i labyrinten.
- Tørk hver mus med håndklær og gi varme etter rettssaken.
- Utfør reversering rettssaken.
Merk: Utfør tilbakeførings forsøket fra dager 8 − 11.- Plasser plattformen i midten av NW-kvadrant (i stedet for SE-kvadrant).
- Følg trinn 5.3.2 − 5.3.5 som beskrevet i den skjulte plattform prøve delen.
6. statistisk analyse
- Bruk statistikk programvare (for eksempel SPSS 20,0) for å utføre den statistiske analysen.
Representative Results
Diagrammet for tids aksen i denne protokollen vises i figur 1.
Figur 1: diagram for tids akse for studie protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tids aksen viser at dette eksperimentet varte i totalt 21 dager. Behandlingen ble påført musen under hele eksperimentet, og MWM-testene begynte etter 15 dagers behandling. Den synlige plattformen, skjult plattform, sonde, og reversering prøvelser ble gjennomført i orden.
Tidligere publiserte resultater fra Ding et al.5 presenteres som typiske resultater av MWM figur 2.
Figur 2: typiske resultater av Morris vann labyrint test (n = 10). (A) endringer i flukt latency og svømming hastighet på rotter blant de ulike gruppene i den synlige plattformen rettssaken. (B) endringer i Escape latency av rotter blant de ulike gruppene i den skjulte plattformen og reversering prøvelser. P-verdiene er * p < 0,05 og * * p < 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen. Symbolet # # indikerer p < 0,01 sammenlignet med AD-gruppen. (C) endringer i plattformen crossover nummer og prosentandel av tiden som brukes av rotter i nordvest kvadrant blant de ulike eksperimentelle grupper i sonden rettssaken. Resultatene av den synlige plattformen, skjult plattform og tilbakeførings prøve i hver gruppe vises (n = 10, gjennomsnittlig ± SD). Dette tallet har blitt modifisert fra Ding et al5. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2a viser resultatene av den synlige plattform prøveperioden. Det ble ikke observert statistiske forskjeller i flukt ventetiden eller svømmehastigheten blant gruppene på den første dagen i MWM. Figur 2b viser resultatene av den skjulte plattformen og tilbakeførings prøven fra dager 2 − 6 og 8-11 dager. Flukt ventetiden til AD-gruppen forble på et høyt nivå på hver dag i testen. Flukt ventetiden til de tre andre gruppene ble gradvis redusert. Flukt ventetiden fra dager 3 − 6 og dager 8 − 11 var lengre i AD-gruppen enn i kontrollgruppen (p < 0,01). Flukt latencies av mus i MA og narkotika gruppene var kortere enn for mus i AD-gruppen på dag 2 − 6 og dager 8 − 11, henholdsvis (p < 0,01). Figur 2C viser resultatene av prøveperioden. Plattformen crossover antall mus i AD-gruppen var statistisk lavere enn i kontrollgruppen (p < 0,01). Plattform crossover-nummeret i MA-gruppen var høyere enn i AD-gruppen (p < 0,05). Andelen av tid brukt i SW-kvadrant av mus i AD-gruppen var betydelig lavere enn i kontrollgruppen (p < 0,01). Andelen av tid brukt i SW kvadrant i MA-gruppen var høyere enn i AD-gruppen (p < 0,01).
Discussion
Selv om mange vann labyrinter, inkludert Biel vann labyrint og Cincinnati vann labyrint, har eksistert i minst et århundre, bare MWM har vært mye brukt til å effektivt og objektivt vurdere romlig læring og hukommelse evne fordi den har mange fordeler9. Til tross for utstrakt bruk av MWM, har prosedyren ikke alltid vært brukt optimalt. MWM eksperimenter tar vanligvis lang tid og påvirkes av mange variable faktorer. Det er noen effektive og pålitelige aspekter som bidrar til å oppdage endringer i romlig læring og hukommelse evne som bør tas i betraktning.
Fire forskjellige MWM-forsøk ble utført. Den synlige plattform prøveperioden ble brukt på dag 1 av MWM. Hvis dyrene kunne svømme direkte til plattformen, indikerte det at svømming evne og visjon av dyrene var normal10. Otnass antydet at den synlige plattformen rettssaken bør gjennomføres første11. Resultatene av den synlige plattformen rettssaken i denne studien betydde at de fire gruppene startet på samme læring nivå. Derfra kan de påfølgende forsøkene startes. Den skjulte plattformen rettssaken ble brukt til å vurdere evnen til mus for å tilegne seg læring og hukommelse evne. Sonden rettssaken ble gjennomført på dag 7, 24 timer etter slutten av den skjulte plattformen rettssaken, for å vurdere arbeidshukommelsen. Endelig ble den reversering rettssaken brukes til å vurdere arbeidshukommelsen2. Endringene i de fire ulike forsøkene med MWM sammen indikerte at AD-modellen hadde lav lærings-og hukommelses evne, og at MA hadde en positiv effekt på AD5.
Det er ingen spesifikke standarder for dimensjonene av bassenget og plattform1. En 214 cm diameter basseng brukes i de fleste MWM studier. Vorhees og Williams demonstrerte at med identiske protokoller, rotter lære raskere i et 122 cm basseng enn i et 210-cm basseng; den bratte skråningen av læringskurve indikerer at 122-cm diameter bassenget er svært enkelt for rotter å navigere12. I den nåværende protokollen, tatt i betraktning den gamle alder og svake vekst av AD mus, en 90 cm diameter basseng og 9,5 cm diameter plattform ble brukt. Resultatene av foreløpige eksperimenter indikerte at mus hadde mer problemer med å finne plattformen i en større diameter basseng. Derfor, tester i større bassenger representerer ikke den virkelige forskjellen mellom gruppene. De eksperimentelle dyrene hadde vanskeligere for å finne plattformen i et større basseng med en mindre plattform4. Derfor må størrelsen på bassenget og plattformen optimaliseres i foreløpige eksperimenter i henhold til de eksperimentelle kravene og tilstanden til forsøks dyrene.
Vann ved temperatur som spenner fra 20 – 24 ° c anbefales for å utføre MWM test4. Alderen eksperimentelle dyr utført dårlig i kaldt vann13, noe som indikerer en klar alders avhengig tap av termoregulering14. I denne studien ble en termostat plassert i bunnen av bassenget for å opprettholde temperaturen i vannet ved 20 – 24 ° c. Studieresultatene viste ingen signifikant forskjell i svømme hastighetene blant de fire gruppene5.
MWM er en kraftig teknikk for å vurdere kognitiv funksjon og er mye brukt i studier i dag. Det er imidlertid ingen definert, standard, konsistent utstyr for å utføre MWM test, inkludert størrelser av bassenget og plattform15,16. Ulike laboratorier har forskjellige spesifikasjoner for MWM. Derfor forskere velge riktig eksperimentell enhet i henhold til deres individuelle eksperimentelle krav, som kan føre til forvirring blant forskere. Foreløpige eksperimenter er også nødvendig. Flere studier må gjennomføres på grunnleggende eksperimenter som MWM. For tiden ligger fleksibiliteten i MWM som et eksperimentelt verktøy bare i evnen til å velge de grunnleggende protokollene i henhold til studie purposed. Derfor kan denne testen brukes til å vurdere kognitiv funksjon i større dybde.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Huiling Tian og Ning Ding er co-første forfattere. Zhigang Li og Jing Jiang er co-tilsvarende forfattere. Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation i Kina (Grant NOS 81804178, 81473774, og 81503654). Protokollen og resultatene som er beskrevet her stammer fra artikkelen, "involvering av manuell akupunktur regulerer atferd og cerebral Blood Flow i SAMP8 Mouse modell av Alzheimers sykdom" av Dr. ning Ding et al.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acupuncture needles | Beijing Zhongyan Taihe Medical Instrument Limited Company | 511526 | |
| desktop computer | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | Lenovo T4700D | |
| Donepezil Hydrochloride Tablet | Eisai China | H20050978 | Aricept |
| mice | Zhi Shan (Beijing) Academy of Medical Science | SCXK2014-0003 | |
| Mirros water maze device | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | WMT-100S | |
| mouse bags | home-made | ||
| Signal acquisition and processing system | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | BL-420N |
References
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Value of water mazes for assessing spatial and egocentric learning and memory in rodent basic research and regulatory studies. Neurotoxicology Teratology. 45, 75-90 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocol. 1 (2), 848-858 (2006).
- The state of the art of dementia research: New frontiers; World Alzheimer Report 2018. Alzheimer's Disease International. 9, 1-46 (2018).
- Vorhees, C. V., et al. Effects of neonatal (+)-methamphetamine on path integration and spatial learning in rats: effects of dose and rearing conditions. International Journal of Developmental Neuroscience. 26 (6), 599-610 (2008).
- Ding, N., Jiang, J., Xu, A., Tang, Y., Li, Z. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 13, 37 (2019).
- Ding, N., et al. Manual acupuncture suppresses the expression of proinflammatory proteins associated with the NLRP3 inflammasome in the hippocampus of SAMP8 mice. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2017, 1-8 (2017).
- Cao, J., et al. Behavioral changes and hippocampus glucose metabolism in APP/PS1 transgenic mice via electro-acupuncture at governor vessel acupoints. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 5 (2017).
- Amy, E., et al. Effects of sub-chronic donepezil on brain Abeta and cognition in a mouse model of Alzheimer's disease. Psychopharmacology. 230, 279-289 (2013).
- Garthe, A., Kempermann, G. An old test for new neurons: refining the Morris water maze to study the functional relevance of adult hippocampal neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 7, 63 (2013).
- Schoenfeld, R., Schiffelholz, T., Beyer, C., Leplow, B., Foreman, N. Variants of the Morris water maze task to comparatively assess human and rodent place navigation. Neurobiology of Learning and Memory. 139, 117-127 (2017).
- Otnass, M. K., Brun, V. H., Moser, M., Moser, E. I. Pretraining prevents spatial learning impairment after saturation of hippocampal long-term potentiation. Journal of Neuroscience. 19 (24), 49 (1999).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. Ilar Journal. 55 (2), 310-332 (2014).
- Vorhees, C. V., Skelton, M. R., Williams, M. T. Age-dependent effects of neonatal methamphetamine exposure on spatial learning. Behavioural Pharmacology. 18 (5-6), 549-562 (2007).
- Iivonen, H., Nurminen, L., Harri, M., Tanila, H., Puoliväli, J. Hypothermia in mice tested in Morris water maze. Behaviour Brain Research. 141 (2), 207-213 (2003).
- Lin, S. Y., et al. Ozone inhibits APP/Aβ production and improves cognition in an APP/PS1 transgenic mouse model. Neuroscience. , (2019).
- Zuo, Y., et al. Preoperative vitamin-rich carbohydrate loading alleviates postoperative cognitive dysfunction in aged rats. Behavioural Brain Research. 373, 112107 (2019).
