Summary

Высокоэффективная трансфекция первичных макрофагов с помощью In Vitro транскрибированная мРНК

Published: November 09, 2019
doi:

Summary

Макрофаги, особенно первичные макрофаги, являются сложными для трансфекта, поскольку они специализируются на обнаружении молекул несобственного происхождения. Мы описываем протокол, который позволяет высокоэффективную трансфекцию первичных макрофагов с мРНК, генерируемых из шаблонов ДНК, таких как плазмиды.

Abstract

Макрофаги являются фагоцитическими клетками, специализирующимися на обнаружении молекул несобственного происхождения. С этой целью они оснащены большим массивом рецепторов распознавания образов (PRRs). К сожалению, это также делает макрофаги особенно сложными для трансфекта, как трансфекционный реагент и транс-инфицированных нуклеиевых кислот часто признаются PRRs как не-самостоятельно. Поэтому трансфекция часто приводит к активации макрофагов и деградации трансинфицированных нуклеиновых кислот или даже к самоубийству макрофагов. Здесь мы описываем протокол, который позволяет высокоэффективную трансфекцию основных макрофагов, таких как перитонеальные макрофаги (ТЧ) и макрофаги костного мозга (BMDM) с мРНК в пробирке, транскрибированной из шаблонов ДНК, таких как плазмиды. С помощью этого простого протокола, трансфекционная скорость около 50-65% для ТЧ и около 85% для BMDM достигаются без цитотоксичности или иммуногенности наблюдается. Мы подробно описываем генерацию мРНК для трансфекции из конструкций ДНК, таких как плазмиды и процедура трансфекции.

Introduction

Макрофаги являются фагоцитическими клетками, которые специализируются на обнаружении, глотании и деградации микробов, апоптотарных клеток и клеточного мусора. Кроме того, они помогают организовать иммунную реакцию, выделяя цитокины и хемокины и представляя антигены Т-клеток и В-клеток. Макрофаги также играют важную роль во многих других процессах, таких как заживление ран, атеросклероз, опухолевие и ожирение.

Чтобы быть в состоянии обнаружить не-самостоятельно молекул, таких как патогенные молекулярные модели (PAMPs) и вне места молекул, таких как повреждения связанных молекулярных моделей (DAMPs), макрофаги оснащены большим массивом рецепторов распознавания образов (PRR)1. К сожалению, это также делает макрофаги особенно сложными для трансфекта2 как трансфекционный реагент3 и трансинфицированных нуклеиновых кислот4,5,6,7часто признаются PRRs как не-самостоятельно. По этой причине трансфекция макрофагов с использованием химических или физических методов8 обычно приводит к активации макрофагов и деградации транс-инфицированных нуклеиных кислот или даже в самоубийстве макрофагов с помощью пироптоза, формы запрограммированной гибели литикических клеток, вызванной после распознавания цитосолильных PAMPs/DAMPs, таких как ДНК или чужая РНК9. Биологическая трансфекция макрофагов с использованием вирусов, таких как аденовирусы или лентивирусы в качестве переносчиков часто более эффективна, но строительство таких вирусных векторов занимает много времени и требует биобезопасности уровня 2 оборудования10,11.

Таким образом, хотя макрофаги являются предметом интенсивных исследований, анализ их функций на молекулярном уровне затруднен, поскольку один из важнейших инструментов молекулярной биологии, трансфекция нуклеиновой кислоты строит для экзогенного выражения белки, вряд ли применимы. Это часто заставляет исследователей использовать макрофаговые клеточные линии, а не добросовестные макрофаги. Приложения для трансфекции конструкции нуклеиновой кислоты включают экспрессию мутировавших или помеченных белковых версий, переэкспрессию конкретного белка, повторное выражение белка в соответствующем фоне нокаута и экспрессию белков других видов (например. , Крем рекомбиназы или руководство РНК и Cas9 для целевого нокаута гена).

Здесь мы описываем протокол, который позволяет высокоэффективную трансфекцию (обычно трудно трансфектные) первичные макрофаги, то есть мурин перитонеальных макрофагов (PM) и макрофагов костного мозга (BMDM) с мРНК, генерируемых из шаблонов ДНК, таких как плазмиды. Важно отметить, что в пробирке транскрибируется мРНК, генерируемых с помощью этого протокола содержит естественные модифицированные нуклеозиды 5-метил-CTP и псевдо-UTP, которые снижают иммуногенность и повышают стабильность4,6,7,12,13. Кроме того, 5′-концы в пробирке транскрибируется мРНК дефосфорилированы антарктической фосфатазы, чтобы предотвратить признание RIG-I комплекс14,15. Это сводит к минимуму врожденное иммунное распознавание в пробирке транскрибированной мРНК. С нашим простым в выполнении протокола, скорость трансфекции между 50-65% (перитонеальные макрофаги (PM)) и 85% (BMDM) достигаются в то время как, что важно, нет цитотоксичности или иммуногенности наблюдается. Мы подробно описываем (i) как иммунологически заглушенная мРНК для трансфекции может быть получена из конструкций ДНК, таких как плазмиды и (ii) сама процедура трансфекции.

Protocol

Макрофаг изоляция от мышей была проведена в соответствии с Законом германии о защите животных в соответствии с Комитетом по этике Кельнского университета. ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняй все ступени в перчатках. Выполняй все этапы трансфекции под ламинарным капотом для п…

Representative Results

Мы успешно использовали этот протокол для создания кодирования мРНК для вариантов NEMO и IKK, отмеченных FLAG, для трансфекции первичных макрофагов16. Плазмиды, кодирующие для FLAG-tagged дикого типа (NEMOWT)и C54/347A мутант NEMO (NEMOC54/374A) (см. Таблица материало…

Discussion

Здесь мы представляем протокол для высокоэффективного трансфекции обычно труднопередаваемых первичных макрофагов с транскрибированной мРНК in vitro. Важно отметить, что трансфекция макрофагов с помощью этого протокола не вызывает гибель клеток и не активирует провоспалительные сигнал…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Materials

5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10X) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10X) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

References

  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
  3. Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
  4. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
  5. Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
  6. Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
  7. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  8. Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
  9. Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
  10. Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  13. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  14. Hornung, V., et al. 5′-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  15. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5′-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  16. Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
  17. Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
  18. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  19. Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, 29-43 (2018).

Play Video

Cite This Article
Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA. J. Vis. Exp. (153), e60143, doi:10.3791/60143 (2019).

View Video