Summary

النقل عاليه الكفاءة من الضامة الابتدائية مع في المختبر كتب mRNA

Published: November 09, 2019
doi:

Summary

الضامة ، وخاصه الضامة الاوليه ، هي تحديا لtransfect لأنها تتخصص في الكشف عن جزيئات من أصل غير الذات. ونحن نقدم وصفا للبروتوكول الذي يسمح بالنقل عاليه الكفاءة من الضامة الاوليه مع mRNA المتولدة من قوالب الحمض النووي مثل البلازميدات.

Abstract

الضامة هي خلايا الخلية المتخصصة في الكشف عن جزيئات من أصل غير الذات. ولهذه الغاية ، فهي مجهزه بمجموعه كبيره من مستقبلات التعرف علي النمط (PRRs). لسوء الحظ ، وهذا أيضا يجعل الضامة تحديا خاصا لtransfect كما الكاشف ترانسفيكشن والأحماض النووية المحولة غالبا ما يتم التعرف عليها من قبل PRRs كما غير الذاتي. ولذلك ، غالبا ما يؤدي التحويل في الضامة التنشيط وتدهور الأحماض النووية المقسمة أو حتى في الانتحار من الضامة. هنا ، ونحن وصف البروتوكول الذي يسمح النقل عاليه الكفاءة من الضامة murine الابتدائية مثل الضامة البريتوني (PM) والضامة نخاع العظم المشتقة (BMDM) مع mRNA في المختبر المنقولة من قوالب الحمض النووي مثل البلازميدات. مع هذا البروتوكول البسيط ، يتم تحقيق معدلات التحويل من حوالي 50-65 ٪ لل PM وحوالي 85 ٪ لشركه BMDM دون السمية الخلوية أو والاستمناع لاحظ. ونحن نوضح بالتفصيل جيل mRNA للتحويل من ثوابت الحمض النووي مثل البلازميدات واجراء التحويل.

Introduction

الضامة هي الخلايا البالعة التي تتخصص في الكشف ، وتناول والميكروبات المهينة ، والخلايا ابوتوتيك والحطام الخلوي. وعلاوة علي ذلك ، فانها تساعد علي تنسق الاستجابات المناعية عن طريق إفراز السايتوكينات والكيميائية وعن طريق تقديم المستضدات إلى خلايا T و B الخلايا. الضامة تلعب أيضا أدوارا هامه في العديد من العمليات الأخرى, مثل التئام الجروح, تصلب الشرايين, التورم والسمنة.

لتكون قادره علي الكشف عن جزيئات غير الذاتي مثل الأنماط الجزيئية المرتبطة بالممرض (PAMPs) والجزيئات خارج المكان مثل الأنماط الجزيئية المرتبطة الضرر (DAMPs) ، وقد تم تجهيز الضامة مع مجموعه كبيره من مستقبلات التعرف علي النمط (PRR)1. لسوء الحظ, هذا أيضا يجعل الضامة تحديا خاصا ل transfect2 كما الكاشف ترانسفيكشن3 والأحماض النووية المتحولة4,5,6,7 غالبا ما يتم التعرف عليها من قبل prrs كما غير الذاتي. لهذا السبب ، نقل الضامة باستخدام الأساليب الكيميائية أو الفيزيائية8 عاده ما يؤدي إلى تنشيط الضامة وتدهور الأحماض النووية المقسمة أو حتى في الانتحار الضام عن طريق الحمم البركانية ، وهو شكل من اشكال الموت المبرمجة الخلية التيتسببت بعد الاعتراف بالأمبير الخلوي النقل البيولوجي للبلاعم باستخدام الفيروسات مثل الفيروسات اللحمية أو لينتيفيروسيس كمتجات غالبا ما يكون أكثر كفاءه ، ولكن بناء هذه النواقل الفيروسيةيستغرق وقتا طويلا ويتطلب السلامة البيولوجية مستوي 2المعدات 10 ،11.

وهكذا ، علي الرغم من ان الضامة هي موضوع البحوث المكثفة ، ويعوق تحليل وظائفها علي المستوي الجزيئي لان واحده من أهم الاداات من البيولوجيا الجزيئية ، والتحول من الحمض النووي يبني للتعبير الخارجية لل البروتينات ، لا ينطبق بالبالكاد. وهذا غالبا ما يجبر الباحثين علي استخدام الضامة مثل خطوط الخلايا بدلا من الضامة حسن النية. وتشمل تطبيقات الحقن بالأحماض النووية التعبير عن الصيغ البروتينية المتحولة أو الموسومة ، والتعبير المفرط عن بروتين معين ، وأعاده التعبير عن البروتين في خلفيه الضربة القاضية والتعبير عن البروتينات من الأنواع الأخرى (مثل , [كري] للالطبيعيه أو مرشده [رنا] و كاس 9 ل يستهدف مورثه ضربه قاضيه).

هنا ، ونحن وصف البروتوكول الذي يسمح الانتقال كفاءه عاليه من (عاده من الصعب ترنسفكايشن) الضامة الاوليه ، وهذا هو murine الضامة البريتوني (PM) والضامة نخاع العظم المشتقة (bmdm) مع mrna المتولدة من قوالب الحمض النووي مثل البلازميدات. الأهم من ذلك ، في المختبر كتبت mrna التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول يحتوي علي النيونوسيدس المعدلة التي تحدث بشكل طبيعي 5-ميثيل-CTP والزائفة UTP التي تقلل من والاستمناع وتعزيز الاستقرار4،6،7،12،13. فضلا عن ذلك, ال 5 ‘-نهايات من ال في مختبره [مرنا] [دفوسفورلتد] بالفوسفاتيز قطبيه ان يمنع اعتراف ب ال [تلاعب-ي] مركبه14,15. هذا يقلل من الاعتراف المناعي الفطري لل في المختبر كتبت mRNA. مع شركائنا سهله لتنفيذ البروتوكول ، ومعدلات التحويل بين 50-65 ٪ (الضامة البريتوني (PM)) و 85 ٪ (BMDM) ويتم التوصل إلى حين ، الأهم من ذلك ، لا يوجد اي السمية الخلوية أو والاستمناع لاحظ. ونحن نوضح بالتفصيل ‘ 1 ‘ كيف يمكن ان تتولد من الحمض النووي الذي يسكت من الناحية المناعية لنقل العدوى من ثوابت الدنا مثل البلازميدات و (2) اجراء التحويل نفسه.

Protocol

تم تنفيذ عزل الضامة من الفئران وفقا لقانون حماية الماشية في ألمانيا وفقا للجنة الأخلاق في جامعه كولونيا. ملاحظه: تنفيذ جميع الخطوات ارتداء القفازات. تنفيذ جميع الخطوات ترانسكشن تحت غطاء للتدفق الرقائقي لمنع تلوث الخلايا. قبل العمل مع mRNA ، تنظيف جميع الصكوك مثل الم?…

Representative Results

لقد استخدمنا بنجاح هذا البروتوكول لتوليد mRNA الترميز للعلم الموسومة نيمو والمتغيرات IKKβ لتحويل الضامة الاساسيه16. الترميز البلازميدات للعلم–الموسومة من نوع البرية (نيموWT) و C54/347a متحولة نيمو (نيموC54/374a) (انظر جدول المواد) تحتوي بالفعل علي T7…

Discussion

هنا نقدم بروتوكول لنقل كفاءه عاليه من الضامة الاساسيه عاده من الصعب إلى ترنسفكايشن مع في المختبر كتبت mrna. والاهم من ذلك ، فان انتقال الضامة باستخدام هذا البروتوكول لا يحفز موت الخلايا أو ينشط الإشارات التهابيه التي تشير إلى انه لا يتم التعرف علي الكاشف العابر ولا علي مركبات mRNA غير الذاتية….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ساندت هذا عمل كان ب ال [دوتش] [فورسسكهنغجيميندسكهفت] ([سالفيس] 670).

Materials

5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10X) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10X) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

References

  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
  3. Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
  4. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
  5. Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
  6. Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
  7. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  8. Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
  9. Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
  10. Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  13. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  14. Hornung, V., et al. 5′-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  15. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5′-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  16. Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
  17. Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
  18. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  19. Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, 29-43 (2018).

Play Video

Cite This Article
Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA. J. Vis. Exp. (153), e60143, doi:10.3791/60143 (2019).

View Video