Summary

העברה יעילה במיוחד של מקרופאגים ראשוניים עם מחוץ לגופית

Published: November 09, 2019
doi:

Summary

מקרופאגים, במיוחד מקרופאגים ראשוניים, מאתגרים transfect כפי שהם מתמחים בזיהוי מולקולות של מוצא לא עצמי. אנו מתארים פרוטוקול המאפשר העברה יעילה מאוד של מקרופאגים הראשי עם mRNA שנוצר מתבניות DNA כגון פלמידים.

Abstract

מקרופאגים הם תאים phagocytic מתמחה בזיהוי מולקולות של מוצא לא עצמי. למטרה זו, הם מצוידים במערך גדול של קולטני זיהוי תבנית (PRRs). למרבה הצער, זה גם עושה מקרופאגים מאתגרת במיוחד כדי transfect כמו מגיב החצייה ואת חומצות גרעין מנוכר מוכרים לעתים קרובות על ידי PRRs כמו לא עצמי. לכן, העברה החוצה גורמת לעתים קרובות מקרופאג הפעלה והשפלה של חומצות גרעין מנוכר או אפילו בהתאבדות של מקרופאגים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר העברה יעילה מאוד של מקרופאגים ראשוניים מורטין כגון מקרופאגים הצפק (PM) ו מח עצם הנגזר מקרופאגים (BMDM) עם mRNA בתוך מבחנה מתוך תבניות DNA כגון פלמידים. עם הפרוטוקול הפשוט הזה, שיעורי ההעברה של כ 50-65% עבור PM ו-85% עבור BMDM מושגת ללא רעילות ציטוזה או החיסוני נצפתה. אנו מתארים בפרוטרוט את הדור של mRNA עבור העברה של מבנים DNA כגון פלמידים והליך החצייה.

Introduction

מקרופאגים הם תאים phagocytic המתמחים זיהוי, בליעת חיידקים משפיל, תאים אפוטוטיים ופסולת הסלולר. יתר על כן, הם עוזרים לארגן את התגובות החיסונית על ידי הפרשה ציטוקינים ו נוגדנים ועל ידי הצגת אנטיגנים לתאי T ו-B תאים. המקרופאגים גם לשחק תפקידים חשובים בתהליכים אחרים רבים, כגון ריפוי הפצע, טרשת עורקים, tuמוריגנזה והשמנה.

כדי להיות מסוגל לזהות מולקולות שאינן עצמיות כגון דפוסי מולקולרי הקשורים לפתוגן (PAMPs) ומולקולות מחוץ למקום כגון דפוסי נזק מולקולריים (DAMPs), מקרופאגים מצוידים במערך גדול של קולטני זיהוי תבנית (PRR)1. למרבה הצער, זה גם עושה מקרופאגים מאתגרת במיוחד כדי transfect2 כמו מגיב החצייה3 ואת חומצות גרעין מנוכר4,5,6,7 לעתים קרובות מוכרים על ידי prrs כמו לא עצמי. מסיבה זו, העברה של מקרופאגים באמצעות שיטות כימיות או פיזיות8 בדרך כלל גורמת הפעלה מקרופאג והשפלה של חומצות גרעין מזוהמים או אפילו ב מקרופאג התאבדות דרך פירופציטוזה, צורה של מוות תאים מתוכנת lytic המופעל לאחר הכרה של pמגברים ציטופולימרים/damps כגון DNA או זרים RNA9. העברה ביולוגית של מקרופאגים באמצעות וירוסים כגון אדנוירוסים או וירוסים כמו וקטורים הוא לעתים קרובות יעיל יותר, אך הבנייה של וקטורים ויראליות כגון הוא זמן רב ודורש ברמה אבטחה טיחות 2 ציוד10,11.

כך, למרות מקרופאגים הם הנושא של מחקר אינטנסיבי, ניתוח התפקודים שלהם על הרמה המולקולרית היא הכשלה כי אחד הכלים החשובים ביותר של ביולוגיה מולקולרית, הגלגול של חומצות גרעין בנייה לביטוי אקסוגני של חלבונים, בקושי ישימה. זה לעתים קרובות כוחות חוקרים להשתמש קווי תאים מקרופאג כמו במקום מקרופאגים בתום הכוח. יישומים עבור חומצות גרעין בניית המבנה כוללים ביטוי של גירסאות חלבון מוטציה או מתויג, הבעות יתר של חלבון מסוים, חלבון מחדש ביטוי ברקע נוקאאוט בהתאמה וביטוי של חלבונים ממינים אחרים (g. , היצור recombinase או מדריך RNA ו Cas9 עבור הסתרה המוקד הגן).

כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר העברה יעילה מאוד של (בדרך כלל קשה transfection) מקרופאגים ראשוניים, כי הוא murine הצפק מקרופאגים (PM) ו מח עצם נגזר מקרופאגים (BMDM) עם mRNA שנוצר מ-DNA תבניות כגון פלמידים. חשוב לעשות זאת, בתוך מבחנה מחוץ לגופית mrna שנוצר באמצעות פרוטוקול זה מכיל את נוקלאוטידים באופן טבעי משתנה 5-מתיל-ctp ו פסאודו-utp כי להפחית את האימונוגלוגניות ולשפר את יציבות4,6,7,12,13. יתר על כן, 5 ‘-הקצוות של ה-mrna המועתק מחוץ לחומרים מלאכותית הם deזרחנות על ידי פוספספטאז אנטארקטיקה כדי למנוע הכרה על ידי המתקן-I מורכב14,15. זה ממזער את ההכרה החיסונית הטבועה ב-mRNA מתורבת. עם שלנו קל לבצע את הפרוטוקול, שיעורי החצייה בין 50-65% (מקרופאגים הצפק (PM)) ו 85% (BMDM) הגיעו בזמן, וחשוב, אין הרעלת ציטוזה או החיסוני נצפתה. אנו מתארים בפרוטרוט (i) כיצד מושתקים החיסוני mRNA עבור החצייה ניתן להפיק מתוך מבנים DNA כגון פלמידים ו (ii) את ההליך החוצה עצמו.

Protocol

בידוד מקרופאג מעכברים התבצע בהתאם לחוק הגנת בעלי חיים בגרמניה בציות לוועדת האתיקה באוניברסיטת קלן. הערה: לבצע את כל השלבים ללבוש כפפות. בצע את כל צעדי החצייה תחת מכסה זרימה למינארי כדי למנוע זיהום של התאים. לפני העבודה עם mRNA, לנקות את כל המכשירים כגון פיפטות ומכל מש?…

Representative Results

השתמשנו בהצלחה פרוטוקול זה כדי ליצור קידוד mRNA עבור הדגל-מתויג נמו ו IKKβ משתנים עבור העברה של מקרופאגים הראשי16. קידוד הפלמידים עבור דגל-מתויג פראי (נמוWT) ו C54/347a וטציה נמו (נמוC54/374a) (לראות את הטבלה של חומרים) כבר מכיל מקדם מקדם T7 בכיוון הנכון …

Discussion

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור העברה יעילה מאוד של מקרופאגים הראשי בדרך כלל קשה ל-transfection עם העתק מחוץ לגופית mRNA. חשוב לציין, העברה של מקרופאגים באמצעות פרוטוקול זה לא לגרום למוות התאים או להפעיל איתות proinflammatory המציין כי לא מגיב החצייה או mRNA מנוכר מזוהים כמו לא עצמי.

איכות ה-mRNA ה…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

העבודה הזאת נתמכת על ידי הגרמני בפורשיגומיייסמייססביסי (SFB 670).

Materials

5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10X) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10X) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

References

  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
  3. Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
  4. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
  5. Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
  6. Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
  7. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  8. Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
  9. Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
  10. Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  13. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  14. Hornung, V., et al. 5′-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  15. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5′-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  16. Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
  17. Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
  18. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  19. Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, 29-43 (2018).

Play Video

Cite This Article
Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA. J. Vis. Exp. (153), e60143, doi:10.3791/60143 (2019).

View Video