مقايسة علي أساس الفلورية لتوصيف وتحديد كميات الدهون التجميعية في تشكيل الأمعاء البشرية
Summary
يصف هذا البروتوكول فحصا لتوصيف المكونات الحبريه الدهنية (LD) في الغدد المعوية البشرية عند التحفيز مع الأحماض الدهنية. نحن نناقش كيفيه استخدام هذا الفحص للقياس الكمي لتشكيل LD ، وكيف يمكن استخدامه لفحص الانتاجيه العالية للادويه التي تؤثر علي تكوين LD.
Abstract
يتم تناول الدهون الغذائية كالاحماض الدهنية الحرة (FAs) بواسطة ظهاره الأمعاء. يتم تحويل هذه FAs اينتراسيلولارلي إلى جزيئات الدهون الثلاثية (TG) ، قبل ان يتم تعبئتها في تشيلوميكرونس لنقل إلى الليمفاوية أو إلى قطرات الدهون عصاري خلوي (LDs) للتخزين داخل الخلايا. خطوه حاسمه لتشكيل LDs هو النشاط الحفاز من التركيب الجلسرين (DGAT) في الخطوة الاخيره من التوليف TG. LDs مهمة لتخزين أنواع الدهون السامة وتنظيم الأيض الخلوي في أنواع مختلفه من الخلايا. منذ يتم مواجهه ظهاره الأمعاء البشرية بانتظام مع تركيزات عاليه من الدهون ، وتشكيل LD من اهميه كبيره لتنظيم التوازن. هنا نحن وصف فحص بسيط لتوصيف والكمية من تكوين LD (DF) عند التحفيز مع الأكثر شيوعا الأحماض الدهنية غير المشبعة ، حمض الاوليك ، في الأمعاء المعوية البشرية. ويستند الفحص DF علي صبغ الفلورسنت LD محدده LD540, الذي يسمح للقياس الكمي من LDs عن طريق المجهر البؤري, قارئ لوحه الفلورسنت, أو تدفق الخلوية. ويمكن استخدام فحص DF لتوصيف تكوين LD في الخلايا الظهاريه المعوية البشرية ، أو لدراسة الاضطرابات البشرية (الوراثية) التي تؤثر علي الأيض LD ، مثل نقص DGAT1. وعلاوة علي ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذا الفحص في خط أنابيب عاليه الانتاجيه لاختبار المركبات العلاجية الجديدة ، والتي تستعيد العيوب في تشكيل LD في الأمعاء أو أنواع أخرى من العضوية.
Introduction
الدهون هي عنصر حاسم في النظام الغذائي البشري وتلعب دورا هاما في تخزين الطاقة الجهازية والأيض. عند بلعها ، يتم تدهور الدهون الغذائية إلى الأحماض الدهنية الحرة (FFAs) و مونوليسريدس (MGs) بواسطة lipases البنكرياس. ثم يتم تناول هذه الركائز من قبل الخلايا المعوية من ظهاره الأمعاء ، حيث يتم أولا أعاده استيريفيد إلى ديسريميدس (DG) بواسطة انزيمات أحادي الغليسريد اسيترانسفيراسيس (MGAT) وبعد ذلك إلى الشحوم الثلاثية (TG) بواسطة التشكيل الجلسرين (DGAT1)1. وأخيرا ، يتم دمج هذه tgs في اي تشيلوميكرونس للتصدير إلى النظام الليمفاوي أو قطرات الدهون عصاري خلوي (LDs) للتخزين داخل الخلايا2،3. علي الرغم من ان هناك حاجه لتشيلوميكرونس لتوزيع الدهون الغذائية للأعضاء الأخرى ، فان اهميه تخزين الدهون داخل الخلايا في LDs ليست واضحة تماما. ومع ذلك, وقد أظهرت LDs لأداء وظيفة تنظيميه في الأمعاء, كما انها ببطء الإفراج عن الدهون في الدورة الدموية تصل إلى 16 ح بعد وجبه4. وعلاوة علي ذلك, وقد أظهرت LDs لحماية ضد تركيزات الأحماض الدهنية السامة, مثل في الخلايا الشحمية الماوس خلال الحالات المتعددة الدهون5.
ويقع البروتين DGAT1 علي غشاء الشبكية إندوبلازمي (ER) ويلعب دورا حاسما في تشكيل LD في ظهاره الأمعاء. الطفرات المنزلية في DGAT1 يؤدي إلى بداية مبكرة الإسهال الشديد و/أو القيء ، نقص البوميميا ، و/أو (قاتل) البروتين-فقدان الأمعاء مع فشل الأمعاء علي تناول الدهون ، مما يدل علي اهميه DGAT1 في التوازن الدهون من الإنسان ظهاره معوية6,7,8,9,10. وبما ان حدوث نقص في الDGAT1 في البشر أمر نادر ، فقد كان الوصول إلى الخلايا الاوليه المستمدة من المرضي شحيحا. وعلاوة علي ذلك ، فان الثقافة طويلة الأجل للخلايا الظهاريه المعوية قد اقتصرت منذ فتره طويلة علي خطوط الخلايا المشتقة من الورم التي تمثل فسيولوجيا الطبيعية فقط لتمديد محدوده. لذلك, [DGAT1-بوساطة] [لد] أسست تشكيل يتلقى يكون في الأغلب في [فيبروبلاستس] أو [انيمل-فيلد] خليه خطوط7,10,11,12. علي هذا النحو, وقد تبين مؤخرا ان الخلايا الليفية المشتقة من المريض DGAT1 تتراكم اقل LDs بالمقارنة مع خليه التحكم الصحية بعد التحفيز مع حمض الاوليك (OA)8.
سابقا ، تم إنشاء بروتوكولات للثقافة الخلايا الجذعية الظهاريه من اي جهاز الهضمي في شكل ثلاثي الابعاد (3D) الهيكل التنظيمي13. ويمكن الاحتفاظ بهذه العضوية المعوية في الثقافة لفتره طويلة من الزمن13، والسماح للدراسة الوظيفية للمريض-والأمعاء خصائص الظهاريه الموقع المحدد14. فهي مستقره وراثيا وظاهريا ويمكن تخزينها ، مما يسمح التوسع علي المدى الطويل و بيوانكينج13.
وقد أظهرنا مؤخرا ان تشكيل LD يمكن قياسه بسهوله في الأمعاء المعوية البشرية في الفحصالسادسلتشكيل الهوية العامة (df). عند التعرض للزراعة العضوية لمده 16 ساعة ، تولد الorganoids LDs لحماية الخلايا من السمية المستحثة بالدهن. عندما تركيزات الزراعة العضوية مرتفعه جدا ، تموت الخلايا من قبل المبرمج بوساطة caspase6. وقد تبين سابقا ان الفحص الذي قامت به هذه المبيدات يعتمد إلى حد كبير علي DGAT1 علي النحو المشار اليه في الغدد العضوية المشتقة من المرضي DGAT1 المتحولين وباستخدام مثبطات DGAT1 الخاصة6.
لفحص DF الموصوفة بالتفصيل هنا ، يتم استزراع العضو العضوي ثلاثي الابعاد من الخزعات المعوية ويتم المرور أسبوعيا عن طريق التشويش في خلايا واحده تشكل بسهوله التشكيلات العضوية الجديدة. لتشغيل فحص DF ، يتم طلاء ~ 7,500 الخلايا الاحاديه المشتقة organoid في كل بئر من لوحه 24 بئر. تتشكل organoids علي مدي عده أيام ، حضنت بين عشيه وضحيها مع 1 مم الزراعة العضوية وملطخه مع LD540 ، وهي صبغه الخلية الفلورية-نفاذيه LD الخاصة التي تسهل التصوير. ثم يتم قياس تشكيل LD عن طريق المجهر البؤري ، قارئ لوحه الفلورسنت ، أو تدفق الخلوي.
عن طريق قياس هذا الفحص التشكيل LD إلى شكل 96-بئر ، يمكن أيضا ان تستخدم المقايسة لتحليل عاليه الانتاجيه لتشكيل LD لفحص المخدرات الرواية التي تؤثر علي تكوين LD في الثقافات المعوية الأمعاء البشرية ، أو لدراسة (الوراثية البشرية) الاضطرابات التي تؤثر علي الأيض LD.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، ونحن نقدم بروتوكول لتحديد تكوين LD في العضوية المعوية البشرية عند الحضانة مع حمض الاوليك. ويستند هذا الأسلوب علي الصبغة الفلورية LD الخاصة LD54018، والذي يسمح لتوصيف والتقدير الكمي للحجم الكلي من قطرات الدهون داخل ثقافة organoid. وقد نشرت الإجراءات المتعلقة بإنشاء وصيانة الثقاف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر b. Spee لتوفير بسخاء LD540. وقد حظي هذا العمل بدعم منظمه هولندية للمنح البحثية العلمية (NWO-ZonMW ؛ VIDI 016.146.353) إلى اس ام
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
- D’Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
- Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
- Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
- van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
- Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
- Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
- Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
- Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
- Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
- Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
- Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).
