Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

שיטת פלואורסצנטית מבוססת על האפיון והקוונפיקציה של היווצרות Droplet ליפיד בגוף מעיים אנושי

Published: October 13, 2019 doi: 10.3791/60150
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Division of Pediatrics, Department of Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 2Regenerative Medicine Center, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 3Science for Life Laboratory, Department of Medical Biochemistry and Microbiology, Uppsala University

Summary

פרוטוקול זה מתאר את התצורה של היווצרות droplet (LD) של השומנים במבנה המעי האנושי על גירוי עם חומצות שומן. אנו דנים כיצד משתמשים באותה שיטת לכימות היווצרות LD, וכיצד ניתן להשתמש בה עבור הקרנת תפוקה גבוהה עבור תרופות המשפיעות על היווצרות LD.

Abstract

ליפידים תזונתיים נלקחים כמו חומצות שומן חינם (בדרך) על ידי אפיתל המעי. אלה מintracellularly המרה לתוך הטריגליצרידים (TG) מולקולות, לפני שהם ארוזים לתוך chylomicrons לצורך הובלה לימפה או לתוך השומנים טיפות ציטוסולג (המוני) עבור אחסון תאיים. צעד מכריע עבור היווצרות של ה-"השלד" הוא הפעילות הקטליטית של הדיליליגליל (DGAT) בשלב הסופי של הסינתזה TG. המורדים חשובים לחיץ מינים רעילים השומנים ולווסת את חילוף החומרים הסלולרי בסוגי תאים שונים. מאז אפיתל המעי האנושי הוא התעמת באופן קבוע עם ריכוזים גבוהים של שומנים, היווצרות LD הוא בעל חשיבות רבה כדי לווסת הומאוסטזיס. כאן אנו מתארים את הבקשה הפשוטה לאפיון וככמת של היווצרות LD (LDF) על גירוי עם חומצת שומן בלתי רווי הנפוץ ביותר, חומצה אולאית, ב אורגנואידים המעי האנושי. שיטת ה-ldf מבוססת על הצבע הפלורסנט הספציפי LD LD540, אשר מאפשר כימות של הזדהות על ידי קונפוקלית מיקרוסקופ מיקוד, הקורא צלחת הפלורסנט, או הזרימה cy, try. שיטת LDF ניתן להשתמש כדי לאפיין את היווצרות LD בתאי האפיתל המעי האנושי, או ללמוד אנושי (גנטי) הפרעות המשפיעות על מטבוליזם LD, כגון DGAT1 מחסור. יתר על כן, ניתן להשתמש באפשרות זו גם בצינור תפוקה גבוהה כדי לבדוק תרכובות טיפוליות הרומן, אשר לשחזר פגמים ביצירת LD במעיים או סוגים אחרים של אורגנואידים.

Introduction

שומנים הם מרכיב חיוני של התזונה האנושית ולשחק תפקיד חשוב אחסון אנרגיה מערכתית ומטבוליזם. כאשר בלע, ליפידים תזונתיים הם מושפל לתוך חומצות שומן בחינם (FFAs) ו monoglycerides (MGs) על ידי lipases הלבלב. מצעים אלה נלקחים לאחר מכן על ידי הנוציטים של האפיתל המעי, שם הם הראשונים מחדש לדיגלידים (DG) על ידי אנזימים מונגליד (MGAT) ולאחר מכן לטריגליצרידים (TG) על ידי diacylגליצרול (DGAT1)1. לבסוף, האלה משולבים ב-טי. אס. או chylomicrons לייצוא למערכת הלימפה או טיפות השומנים ציטוסולג (השלד) עבור אחסון תאיים2,3. למרות שchylomicrons נחוצים להפצת שומנים תזונתיים לאיברים אחרים, החשיבות של אחסון שומן תאיים ב-השלד אינה ברורה לחלוטין. עם זאת, המכונה הוכחו לבצע פונקציה תקינה במעי, כפי שהם לאט לשחרר שומנים לתוך המחזור עד 16 h אחרי ארוחה4. יתר על כן, המוני הוכחו להגן מפני ריכוזי חומצות שומן רעילים, כגון במהלך התנאים לפני העכבר5.

חלבון DGAT1 ממוקם על הממברנה האנדופלזמית (ER) וממלא תפקיד מכריע ב-LD היווצרות ב אפיתל המעי. מוטציות Homozygous ב DGAT1 להוביל שלשול מוקדם התפרצות חמורה ו/או הקאות, היפואלבומין, ו/או (קטלני) חלבון מאבד בידור עם כישלון מעיים על צריכת שומן, הממחישות את החשיבות של DGAT1 הומאוסטזיס השומנים של האדם , אפיתל המעי6,7,8,9,10 מאז התרחשות של DGAT1-מחסור בבני אדם הוא נדיר, הגישה לתאים שנגזר מטופל הראשי כבר נדיר. יתר על כן, התרבות ארוכת טווח של תאים אפיתל המעי כבר זמן רב מוגבלת קווי הגידול נגזר התאים אשר מייצגים את הפיזיולוגיה נורמלי רק להאריך מוגבל. לכן, היווצרות DGAT1-בתיווך LD למדו בעיקר בפיברותקיעות או בעלי חיים שמקורם שורות תא7,10,11,12. בתור כזה, זה היה לאחרונה הראו כי DGAT1-לקויה מטופלים נגזר פיברוטים לצבור פחות התעודות לעומת תאים בריאים לאחר גירוי עם חומצה אולאית (OA)8.

בעבר, פרוטוקולים הוקמו בתאי גזע האפיתל התרבות מכל איבר העיכול בצורה של תלת מימדי (3D) אורגנואידים13. מעיים אלה ניתן לשמור בתרבות במשך תקופה ארוכה של13, ולאפשר את המחקר הפונקציונלי של המטופל-ואת המעיים מיקום ספציפי מאפיינים האפיתל14. הם גנטית, פנופנטיות בדרך כלל יציבה וניתן לאחסן, המאפשר הרחבה ארוכת טווח ו biobanking13.

לאחרונה הדגמנו כי היווצרות LD ניתן למדוד בקלות בתוך אורגנואידים המעי האנושי במערך LD (LDF) שיטת6. כאשר הם חשופים OA עבור 16 h, אורגנואידים ליצור התעודות כדי להגן על התאים מפני רעילות המושרה ליפיד. כאשר ריכוזי OA גבוהים מדי, התאים מתים על ידי caspase-תיווך ואפופטוזיס6. שיטת LDF הוצגה בעבר להיות תלויה במידה רבה ב DGAT1 כפי שצוין על ידי אורגנואידים נגזר מהחולים DGAT1-מוטנטים ועל ידי שימוש במעכבי DGAT1 ספציפיים6.

עבור שיטת ה-LDF המתוארת בפירוט כאן, אורגנואידים תלת-ממדיים הם מתורבתים מפני ביופסיות מעיים ומהווים שבועי באמצעות הפרעה לתאים בודדים היוצרים בקלות אורגנואידים חדשים. עבור הפעלת שיטת LDF, ~ 7,500 התאים היחידים הנגזרים אורגאיד מצופים בכל טוב של צלחת 24-הבאר. אורגנואידים נוצרות לאורך מספר ימים, מודלבן לילה עם OA 1 מ"מ ו ויטראז ' עם LD540, תא פלורסנט-מוגדר-LD לצבוע ספציפי המקל הדמיה. היווצרות LD הוא לאחר מכן כימות על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, לוחית הפלורסנט קורא, או לזרום cy, לנסות.

על-ידי שינוי קנה מידה זה היווצרות זיהוי LD לפורמט 96-ובכן, הטיפול יכול לשמש גם עבור ניתוח תפוקה גבוהה של היווצרות LD למסך תרופות הרומן המשפיעות על היווצרות LD בתרבויות המעי האנושי מחלות, או ללמוד (האדם הגנטי) הפרעות המשפיעות על . מטבוליזם של LD

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים באמצעות רקמות אנושיות שתוארו במסמך זה אושרו על ידי הוועדה האתית במרכז הרפואי האוניברסיטאי אוטרכט (UMCU). הסכמה מושכלת לאיסוף רקמות, הדור, האחסון והשימוש באורגנואידים הושגו ממטופלים בבית החולים לילדים וילהלמינה (WKZ)-UMCU.

1. הכנת המדיה התרבותית

הערה: הפרוטוקול הזה צריך להתבצע. בתוך ארון בטיחות יש לטפל באורגנואידים על פי ההנחיות הסטנדרטיות לתרבות התא.

  1. הכינו את מדיום התרבות הבזליים.
    הערה:     בינונית תרבותית ללא גורמי גדילה מכונה בינונית-בסיס (BM).
    1. הוסף 5 מ ל של HEPES (1 M), 5 מ ל של L-glutamin (100x) ו 5 מ ל של פניצילין-סטרפטומיצין (5,000 U/mL) כדי 500 mL של מתקדם בינונית מתקדמת של דולבקה עם תערובת מזינים של Ham F-12 כדי להכין מדיום BM.
    2. אחסן את מדיום ה-BM המוכן ב-4 ° c והשתמש בו למשך מקסימום 2 חודשים.
  2. הכן את R-החתן והראש הבינוני (CM) לפי פרוטוקול היצרן.
    1. בקצרה, לגדול את התאים לכמות הרצויה היפרמבחנות עם 5 x 107 תאים ב 555 mL בינונית ללא אנטיביוטיקה סלקטיבית לכל בקבוקון.
    2. לגדל את התאים 4 ימים עד שוטפת.
    3. החלף את המדיום באמצעות BM ותרבות למשך 8 ימים נוספים.
    4. לאחר 8 ימים של תרבות ב 37 ° c, לאסוף את בינוני התרבות צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 450 x g כדי גלולה כל התאים הנותרים.
    5. מסננים מעקר את הסופרנטאנט, ומאחסנים את מאגר ה-R-שדין או את הראש ב-20 ° c למשך שישה חודשים לכל היותר.
  3. הכינו Wnt3A-CM לפי Boj ואח '15.
    1. בקצרה, לגדול את התאים לכמות הרצויה במנות 145 מ"מ עם 2 x 106 תאים בינונית 20 מ ל ללא אנטיביוטיקה סלקטיבית לכל מנה. לעטוף כל מנה עם רדיד פלסטיק כדי למנוע אידוי של מדיום התרבות.
    2. לאחר 8 ימים של תרבות ב 37 ° c, לאסוף את בינוני התרבות צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 450 x g כדי גלולה כל התאים הנותרים.
    3. המסנן מעקר את הסופרנטאנט ומאחסן את הWnt3A-CM ב -4 ° c למשך מקסימום 2 חודשים.
  4. הכן מדיום הרחבה אורגאיד.
    הערה:     בינונית הרחבה ארגונית מעיים האדם קטן (ראה מתכון בטבלה משלימה 1) מכונה HSI-EM. השלבים הבאים יפיקו נפח סופי של 1 L hSI-EM, וניתן לשנות את גודלם למעלה או למטה כנדרש.
    1. מתמוסס 1.46 g של ניטינאמיד ב 12 מ ל של תרבות תא כיתה פוספט באגירה מלוחים (PBS) כדי ליצור דילול הסופי של 1 M.
    2. לפזר 245 מ"ג של n-מרחריל ציסטאין ב 3 מ ל של תרבות התא PBS כיתה כדי ליצור דילול הסופי של 500 mM.
      הערה: כדי להאיץ את היווצרות הפתרון, ניתן לשלב את הניטינאמיד ו-n-מרחלין באמבט מים ב-37 ° c. ניתן להכין את שני הפתרונות באצווה, מצוטטים ומאוחסנים ב-20 ° c לשימוש עתידי.
    3. מסנן לעקר את שני הפתרונות באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר לתוך שפופרת סטרילי 15 מ"ל.
    4. הוסף 167 mL של BM ל סטרילי 500 mL תרבות בקבוקון בינוני. הוסף 200 mL של R-החתן-CM, 100 מ ל של ראש-CM, ו 100 μL של רקומביננטי mEGF (500 μg/mL) לריכוז הסופי של 50 ng/mL.
    5. הוסף 10 מ ל של הפתרון ניטינאמיד מעוקר ו 2.5 mL של הפתרון שאינו מעוקר n-מרחלי. הוסף 20 מ ל של B27 מוסף (50x).
      הערה: בשלב זה, המדיום מכונה hSI-EM ללא היה (Wnt3A ס"מ, A83-01, ו SB202190), והוא יכול להיות מצוטט ומאוחסן ב-20 ° c. אם המדיום מצוטט לנפחים קטנים יותר, התאם את ריכוזי השלבים הבאים בהתאם.
    6. כדי 500 mL של hSI-EM ללא היה, להוסיף 10 מ ל של Wnt3A ס מ של האצווה האחרונה טרי ו 10 מ ל של Wnt3A-CM של האצווה השנייה האחרונה כדי למזער את שינויי ההשתנות בתנאים Wnt3A-CM.
    7. הוסף A83-01 לריכוז הסופי של 500 nM, ו SB202190 לריכוז הסופי של 10 μM.
    8. לאחסן את hSI-EM המוכנים (עם היה) ב -4 ° c ולהשתמש למשך מקסימום 2 שבועות.
      הערה: הוסף Y-27632 נוספים לריכוז הסופי של 10 μM (המכונה hSI-EM + Y) כאשר הקריפטטים או תאים בודדים הם מתורבתים או אורגנואידים התחילו מהקריוגנית.
  5. הכן מאגר מיון תאים המופעל על-ידי פלורסנט (FACS).
    1. הוסף 10 מ ל של סרום עגל עוברי (FCS) כדי 40 mL של PBS ללא Ca2 +/Mg2 + עבור ריכוז סופי של 10% fcs.
      הערה: FCS מונע תאים הקפדה על labware.

2. הליכי התרבות לאורגנואידים המעי האנושי

הערה: הפרוטוקול הזה צריך להתבצע. בתוך ארון בטיחות יש לטפל באורגנואידים על פי ההנחיות הסטנדרטיות לתרבות התא. בעת טיפול בתאים מאורגנואידים או בתאי מאורגנואיד, יש לשמור על התאים בקרח כאשר הדבר אפשרי. התאים יישארו קיימא במשך כמה שעות לאחר הקציר כאשר זה מובטחת. אורגנואידים צריך להיות תרבותי בחממה סטנדרטית לתרבות התא ב 37 ° c עם 5% CO2. תנאים אלה חלים על כל שלבי הדגירה עם אורגנואידים מוטבע מטריצות קרום מרתף (BMM; כלומר, מטריצות) לאורך פרוטוקול זה. המחברים השתמשו אורגנואידים הנגזרים התריסריון עבור אלה מספר.

  1. משתני הפסנואידים
    הערה    : לכל תרבות ארגונית יש זמן הכפלה משלה. בדרך כלל, מאבנואידים מעיים קטנים יכולים להיות מעבר לגיל 1:3-1:5 כל 7-10 ימים. כאשר מדובר בתאים בודדים, יעילות passaged יכולה להיות עד 1:20, בהתאם לצפיפות התא. לצורך הקמה ואחזקה, אורגנואידים מתורבתים בצלחות של 24 שעות ביממה; עבור שיטת ה-LDF, בלוחות בנות 24 או 96.
    1. כנה
      1. לפני החום הארוזה לוחות 24-היטב הרקמה בחממה ב 37 ° c, 5% CO2 לפחות לילה ורצוי 5 ימים מראש.
        הערה: מחמם את לוחיות התרבות של הרקמה בחממה התרבות התאית מבטיח היווצרות והחזקה של מבנה המכיל של טיפות BMM.
      2. כדי להפחית את מספר מחזורי הקפאת ההקפאה, הכינו 1 מילימטר mL של BMM ואחסן ב-20 ° c. הפשרת בקבוקון של BMM על הקרח לפחות 30 דקות לפני הפעלת הליך מעבר אורגנואיד.
      3. לשמור על שפופרת 50 mL של BM על הקרח כמו כביסה בינונית.
      4. הכינו את hSI-EM כמתואר בסעיף 1.4, והכינו כמות מתאימה של hSI-EM + Y, לדוגמה, 15 מ"ל לצלחת מלאה של 24 שעות ביממה.
    2. לאסוף אורגנואידים.
      1. מתיף בזהירות את המדיום תרבות מבלי להפריע טיפות של BMM.
      2. הוסף 500 μL של מוניטור קר לבאר הראשונה של אורגנואידים, ולשבש את טיפות BMM עם אורגנואידים על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה עם P1000 pipetting.
      3. חזור על הליך זה עם מדיום זהה הבאה גם הנדרש, אבל לא לקצור יותר 2 בארות לכל 500 μL של BM.
      4. לאסוף את האורגנואידים בתוך מחייב נמוך 1.5 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה ספין למטה בצנטריפוגה שולחן מיני עבור 15 לאחד-20 (מקסימום. 2,000 x g). ולהוריד את החלק האחרון של בינוני עם P200 pipet.
        הערה: כאשר התרבויות האורגנואידים נראים נקיים תחת מיקרוסקופ ולא מכילים תאים מתים או פסולת אחרת, טיפות BMM ניתן לקצור ישירות בטריפסין במקום BM בשלב 2.1.2.2. לאחר שלב 2.1.2.3, המשך ישירות לדגירה בשלב 2.1.3.1.
    3. הנתק את האורגנואידים. לתאים בודדים
      1. הוסף 400 μL של טריפסין לתוך הסובב אורגנואידים. מודקון את האורגנואידים ב 37 ° c עבור 5 דקות באמבט מים.
      2. לשבש את האגרגטים הנותרים של תאים על ידי ליטוף למעלה ולמטה בעדינות עם P200 pipetting. שוב, מודג את האורגנואידים ב-37 ° c עבור 5 דקות באמבט מים.
      3. בדוק את ההתקדמות של דיסוציאציה של התא תחת מיקרוסקופ באמצעות הגדלה 4x. חזור על שיבוש ידני ודגירה כאשר גושים גדולים של תאים נשארים.
      4. כאשר רק תאים בודדים נשארים, להוסיף 1 מ ל של BM ו ספין למטה את התאים בצנטריפוגה שולחן מיני עבור 15 ל-20.
      5. . מרוב את הסופרנטאנט לחלוטין השהה מחדש את התאים היחידים ב-200 μL של hSI-EM טריים באמצעות P200 pipet. הוסף תוספת 800 μL של hSI-EM.
      6. לספור את מספר התאים בהשעיה.
        הערה: במעבדת המחברים, ספירה ידנית של התאים האורגנואיד המונתק תשואות תוצאות אמינות יותר מאשר מונה תאים אוטומטי. כאשר נעשה שימוש במונה תאים אוטומטיים, צפיפות התא עבור יישומי במטה צריך להיבדק בתוך הבית ולהתאים אם קטן מדי או יותר מדי אורגנואידים לגדול.
    4. אורגנואידים זרעים עבור תחזוקה או השומנים היווצרות ליפיד שיטת.
      1. חשב את נפח התאים הדרוש עבור צפיפות התא הסופית.
        הערה: כ 250 תאים/μL הוא צפיפות מתאימה. בצלחת 24-הבאר, 30 μL הוא הנזרע בכל הבאר, בעוד 5 μL הוא נזרע לכל טוב של צלחת 96-באר.
      2. להוציא את הנפח המתאים של ההשעיה ולהתאים את הצפיפות 750 תאים/μL (או ספין למטה ולהשעות כאשר הצפיפות נמוכה מדי).
      3. הוסף BMM להשעיה התא ביחס של 2:1. צפיפות התא הסופית בתערובת זו היא 250 תאים/μL. בעדינות לערבב את ההשעיה על ידי ליטוף, בזהירות הימנעות כל בועות.
      4. בתוך לוחית טרום מחומם של התרבות הרקמה, הזרע החוצה 3 10 μL טיפות לכל טוב בצלחת 24-באר או אחד 5 μL droplet לכל טוב בצלחת 96-באר.
      5. מניחים את הצלחת בחממה ב 37 ° c, 5% CO2 עבור 10-15 דקות כדי לגבש את טיפות bmm. בינתיים, לחמם את הסכום המתאים של hSI-EM + Y באמבט מים ב 37 ° c.
      6. בקפידה להוסיף 500 μL של טרום מחומם hSI-EM + Y לכל טוב של צלחת 24-באר או 100 μL לכל טוב של צלחת 96-באר. מרחיב את התאים בחממה ב 37 ° c, 5% CO2 ואחרי 2-3 ימים לשנות את המדיום כדי hsi-EM (בלי Y) ולרענן 2-3 פעמים בשבוע.
        הערה: לאחר 7-10 ימים, יש לחזור על תרבות תחזוקה של אורגנואידים.

3. שיטת השומנים של היווצרות Droplet

  1. הכנת חומצה אולאית המשלים
    הערה:     מאז חומצה אולאית (OA) הוא הידרופובי ולא מסיסים במים, היא מצוערת לאלבומין סרום של שור (BSA). BSA יכול לאגד מולקולות חומצות שומן מרובות והוא במקרה זה בשימוש ביחס 1:8 כדי להפוך חומצה אולאית נגיש לתאי המעיים. חומצות שומן חינם BSA יכול לאגד גם labware פלסטיק. על מנת להבטיח ריכוז סופי מתאים, השתמש בצלוחיות זכוכית והכל כאשר אפשר.
    1. שוקל 0.2 גרם של חומצה אולאית נוזלית בטמפרטורת החדר. להוסיף 1.5 mL של התרבות כיתה מעוקר PBS ולחמם את התערובת ל 70 ° צ' עבור 1 h. מערבולת לסירוגין.
    2. שוקלים 5.89 גרם של BSA ללא חומצות שומן ומתמוסס ב 33.9 mL של PBS. חמם את התערובת באמבט מים ב-37 ° c עד ה-BSA מומס במלואו.
    3. מערבולת התערובת OA שוב כדי ליצור אמולסיה של טיפות בסדר מיד להוסיף אותו לפתרון BSA באמצעות pipet זכוכית. שמור את הפתרון הסופי קרוב ל 37 ° צ' לאחר הוספת OA. התערובת הסופית מורכבת 20 מ"מ מ OA ב 2.5 mM BSA.
    4. שמרו על התערובת ב-37 ° c למשך 30 דקות עד שיישאר פתרון צהבהב ברור.
    5. המשלים OA-BSA יכול להיות מצוטט וקפוא ב-20 ° c עבור לפחות 6 חודשים. בשעה שהיא מתפרקת, מודסת אותה ב-37 ° c עד שהוא מתמוסס והתערובת ברורה שוב.
      הערה: בגלל החלבון הגבוה ותוכן השומנים של הפתרון הסופי, התערובת לא יכולה להיות מסנן מעוקר או אוטוקלבד. כאשר המרכיבים טופלו בזהירות, במכסה הזרימה המבינארי כאשר הדבר אפשרי ובשימוש ב-PBS מעוקר, המחברים לא חוו זיהומים מיקרוביאלית.
  2. שיטת החיבור של LDF
    1. הכנה לדוגמא
      1. מעבר אורגנואידים כמתואר בסעיף 2.1. הזרע החוצה את התאים היחידים הנגזרים מאורגאיד בצלחת שחורה בצבע 96-בהיר.
      2. ביום 6 של התרבות על hSI-EM, להחליף את מדיום התרבות עם hSI-EM המכיל 1 mM OA-BSA המשלים.
      3. דגירה את התאים עבור 16-17 שעות (לילה) ב 37 ° c בנוכחות או היעדרות של 0.1 μM DGAT1 מעכב. כלול בקרת רכב של 2.5 mM BSA.
      4. לאחר 16 עד 17 שעות, מנושף את המדיום מבלי להפריע לטיפות BMM. התיקונים האורגנואידים על ידי הוספת 100 μL של 4% פורמלדהיד באגירה ניטרלי לבארות עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
        הערה: פורמלדהיד יהיה חלקית לפזר את BMM, בעוד האורגנואידים לשקוע לתחתית ולדבוק בתחתית הצלחת.
      5. הסר את פורמלדהיד בעדינות, ובזהירות לשטוף את הבארות עם 150 μL של PBS לכל טוב.
      6. כתם תאים עבור ה0.025 mg/mL LD540 ו-4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) ב PBS עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
      7. שטפו את הבארות בזהירות בערוץ PBS.
        הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן בעת הצורך. שמרו את הדגימות מכוסות ב-PBS בחשיכה ב -4 ° c. LD540 הצביעת יישארו יציבה למשך שבוע. ניתן לבצע שחזור זה באמצעות תאים חיים, כדי לפקח על היווצרות LD לאורך זמן. בשביל זה, יש להשמיט את הקיבעון מהפרוטוקול, ולהחליף את ה-DAPI בצביעת הואכסט. LD540 יכול להכתים את התעודות בתאי החיים באותו ריכוז כפי שמתואר.
    2. הדמיה קונפוקלית
      הערה: ניתן לבצע את ההדמיה על דגימות מוכנות מאורגאיד בצלחת השחורה 96-בסדר גמור.
      1. לתמונות מבט כולל של אורגנואידים שלמים, השתמש במטרה 40x מתאים לדימות פלורסנט ממוקד.
      2. הגדר את המיקרוסקופ כדי לדמות את ערוץ DAPI ב 405 ננומטר, ca. 410-535 ננומטר גל של פליטה. עבור LD540 לבחור לייזר עירור ב 540 ננומטר (543 nm הוא אופטימלי) ולהגדיר את מסנני פליטה 545-700 ננומטר.
        הערה: בפרוטוקול זה, מערכת בסריקת לייזר קונפוקלית וקד עם לייזר אור לבן, מפצל קרן acousto-אופטי (aobs), 10x/20x המטרה, ו מערכת איתור ספקטרלית שימש. הדבר מאפשר כוונון מדויק של אורכי הגל הספציפיים. אם מערכת דומה אינה זמינה, בחרו קווי לייזר ומסנני למעבר קצר/ארוך בקרבת המפרט שלעיל. עבור הדמיה שלמה-אורגאיד, רזולוציה של 512 x 512 או 1024 x 1024 מספיקה עבור ניתוח תמונה במורד.
      3. הגדר את גודל הנקב ליחידה אוורירית אחת (AU) עבור רזולוציה מספקת של ציר z.
      4. כדי לדמות מחצית אחת של אורגאיד כדורית, הגדר את מחסנית z ל-85 μm בקירוב.
    3. אנליזת תמונות
      הערה: לניתוח תמונה, פיג'י/imagej16,17 שימש להפקת תחזיות מרביות. ניתן לבצע את הניתוח בכל חבילת תוכנה לניתוח תמונה המאפשרת הקרנה מקסימלית, סף ידני וניתוח חלקיקים.
      1. באמצעות פיג'י/ImageJ, הפוך את מחסנית z של כל אורגנואיד להקרנה מרבית: תמונה | ערימות | Z-פרוייקט.
      2. הגדר את הסף של ההקרנה המקסימלית לרמה שבה אין אות LD540 לעין במדגם בקרת הרכב BSA: תמונה | כוונן | הסף. השתמש בהגדרות אלה כדי לעבור לסף כל תמונה.
      3. למדוד את השטח הכולל של הזריחה עבור כל הקרנה מקסימלית באמצעות הפונקציה לנתח | ניתוח חלקיקים.
        הערה: למרות שרזולוציית השיטת הפעולה טובה יותר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית, ניתן לנתח את השיטה גם באמצעות קורא לוחית פלורסנט עם מסננים דומים. כדי לנרמל את הספירה לאחר ספירת האורגנואיד, יש לחלק את האות LD540 באות DAPI. לבסוף, יש לחיסור את האות של פקד הרכב BSA כדי לנרמל את המידות. גישה זו מאפשרת לשנות את היכולת להיות משתנה לקראת תבנית צלחת 96.
  3. שיטת הזרימה
    1. הכנה לדוגמא
      1. מעבר אורגנואידים כמתואר בסעיף 2.1. הזרע את התאים היחידים הנגזרים מאורגאיד בצלחת תרבות של 24 שעות ביממה. שתי בארות בכל תנאי מספיקה עבור cy, הזרימה הציטונסה.
      2. ביום 10 של התרבות על hSI-EM, להחליף את מדיום התרבות עם hSI-EM המכיל 1 mM OA-BSA המשלים.
        הערה: לעומת ניתוח מוקד, 10 ימים של צמיחה ב-EM נבחר עבור שיטת הזרימה cy, try במקום 6 ימים. 4 הימים הנוספים של התרחבות יגרמו לאורגנואידים חופפים שהיו מסבכים את הצורה המבוססת על מיקרוסקופ. עם זאת, מספר גדול יותר של תאים מאפשר זרימה cy, לנסות ניתוח.
      3. דגירה את התאים עבור 16-17 שעות (לילה) ב 37 ° c בנוכחות או היעדרות של 0.1 μM DGAT1 מעכב. כלול בקרת רכב של 2.5 mM BSA.
      4. לאחר 16 עד 17 שעות, לאסוף את האורגנואידים כמתואר בסעיף 2.1.2.
      5. הנתק את האורגנואידים לתאים בודדים כמתואר בסעיף 2.1.3.
        הערה: למרות שאין צורך באופן מדויק, מומלץ לבדוק את ספירת התא בכל אחת מהדוגמאות. מספר כולל של 10,000 תאים לכל מדגם הוא המינימום הנדרש לרזולוציה מספקת. לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש בתאים ca. 50,000-100,000.
      6. סובב את התאים בצנטריפוגה. מיני עבור 15 לעשרים
      7. כתם כל מדגם עם 500 μL של 0.025 mg/mL LD540 ו-1 μg/mL Hoechst ב-PBS עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
      8. לסובב את התאים בצנטריפוגה שולחן מיני עבור 15 למעלה ולשטוף 3x עם PBS.
      9. תיקונים התאים על ידי השעיית אותם ב500 μL של 4% פורמלדהיד באגירה ניטרלי עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.
      10. לסובב את התאים ולשטוף 3x עם מאגר FACS.
      11. לשטוף מראש את צינורות FACS עם מאגר FACS כדי למנוע תאים הדבקים בקיר הצינור.
      12. השהה מחדש את התאים ב-200 μL של מאגר FACS והעבירו את ההשעיה הסלולרית לצינורות ה-FACS שוטפים מראש.
    2. ניתוח ציטומטלי זרימה
      1. הגדר את הפרמטרים כדי להוציא תאים מתים וגושים של תאים (עיין בסעיף התוצאות המייצג).
      2. באוכלוסייה הסופית מגודרת, למדוד לפחות 10,000 תאים עבור תוצאות אמינות.
        הערה: מאוכלוסיה זו, את עוצמת הפלורסנט הממוצע (MFI) של LD540 ואת ממוצע האות של האס. פי. או מספקים מידה של הנפח הכולל של היווצרות LD לכל תא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לניתוח הנכון של היווצרות LD, האורגנואידים לא צריך להיות הנזרע בצפיפות רבה לפני גירוי עם OA והכתים הבאים. הדבר מהווה חשיבות במיוחד עבור מוקד הקריאה וקורא הצלחות, כיוון שהאורגנואידים החופפים עלולים להפריע לזריחה. דוגמה לצפיפות מתאימה של זריעה אורגאידית (איור 1א) ותרבות עם אורגנואידים חופפים מוצגת (איור 1B). כדי למזער את השונות בגירוי לדוגמה עם OA, גודל האורגנואיד וצפיפות הזריעה צריכים להיות מקבילים בין דגימות בתוך ניסוי אחד. דבר זה נשלט בדרך הטובה ביותר על-ידי זריעת מספר שווה של תאים בודדים. עם זאת, ייתכן שהתאמות מסוימות יהיו נחוצות אם קווים מסוימים של אורגנואיד מראים בעקביות את היעילות הגבוהה יותר של החוקה ולכן ספירת מבנה גבוהה יותר באופן עקבי.

לאחר גירוי עם 1 mM OA לילה, היווצרות LD יכול להיות דמיינו עם מיקרוסקופ הפוך ברייטפילד. הצטברות של התעודות המועברות באור, ולכן האורגנואידים נראים כהים יותר, בעוד שאין ממריצים בעלי מראה שקוף (איור 1ג). דוגמה להיווצרות LD כפי שנראה תחת מיקרוסקופ ברייטפילד מוצג באיור 1D. ניתן להשתמש בתופעה זו כדי להעריך את התנאים הניסיוניים לפני הבדיקה הפלואורסצנטית. כאשר דגימת הבקרה החיובית אינה כהה מבחינה חזותית מדוגמת הבקרה השלילית, או כאשר מוות תאים נרחב מתברר, יש להיפטר מהניסוי. כמו ffas רעילים לתאים בריכוזים גבוהים יותר, ואת הריכוז הקטלני שונה בין מינים של ffas, הריכוז האופטימלי הקטלני המניע את היווצרות LD צריך להיות טיטרציה עבור כל יישום.

לאחר האורגנואידים OA ממריצים קבועים ומוכתמים בהתאם לפרוטוקול, ldf יכול להיות דמיינו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. כמו האורגנואידים הם מבנים תלת-ממדיים, מיקרוסקופ אפיאוסצנט רגיל אינו מתאים בשל האות מחוץ לפוקוס הרקע. לכן, השתמשנו (השלכה מקסימלית של) קונפוקלית z מחסנית לאפיין ldf ב אורגנואידים. איור 2A מראה תוצאה מייצגת של מכתים LD בארגון שליטה בריא שטופלו עם או בלי מעכבי DGAT1. למרות הקוונפיקציה של תמונות אלה הוא מפרך, ניתוח קונפוקלית וקד משמש בעיקר ככלי ויזואליזציה כדי לבדוק את היווצרות LD נורמלי. ניתן לבצע את הקוונפיקציה של דגימות המיקרוסקופיה הקונפוקלית גם באמצעות קורא לוחית פלורסנט (איור 2ב'), המנורמל לאות הפלורסנט הופסט. הקביעה של קורא הצלחות מצביעה על ירידה משמעותית באות LD540 בתאי הארגון המטופלת בDGAT1 מעכבי (D1i) בהשוואה לאורגנואידים מטופלים.

הקוונפיקציה של היווצרות LD בתאים בודדים ניתן להשיג באמצעות cytometer זרם. האסטרטגיה המשמשת לגיבוש מעיים אנושי מוצגת באיור 3א. השלב הראשון של העליה ב-FSC-A/מדינת לילה-מחלקה היא הבחירה הראשונה של ' חיים ' (כאשר הוא קבוע), תאים בודדים. כדי שלא לכלול יותר doublets, שלישיות או גושי תאים גדולים יותר, כללנו שני צעדים נוספים על FSC-W/FSC-H ו-אס. אס. סי. לבסוף, העליה של FSC-A/Hoechst מבטיח הדרה של כל התאים שהיו מתים או מתים לפני קיבעון. איור 3ב, ג מראה את היסטגרמות של שתי הLD540-A ואת האות של האוכלוסייה הסופית של התא החי. LDF יגרום לעלייה ב-המטה-מדינת-מדינת מדינת-מדינת-מדינת-מדינת-בגלל היווצרות טיפות שומנים תאיים. בנוסף, LD540 כתמים עבור שומנים המאוחסנים ב-ה, האות הזה יגדל גם על אינדוקציה LDF. בתור שכזה, היווצרות LD נמדד כמשמרת ב MFI של מדינת האס. אס. או LD540 (איור 3D, E). ניתן להתוות את MFI ולהשתמש בה לביצוע ניתוח סטטיסטי.

Figure 1
איור 1: תרבויות אורגנואיד דמיינו על ידי מיקרוסקופ ברייטפילד. (א, ב) עבור שיטות הקורא ולוחית הפלורסנט, חשוב שהאורגנואידים לא נזרע בדחיסות גבוהה מדי ב-droplet של BMM. (א) אורגנואידים הם שנזרע בצפיפות מתאימה של 250 תאים/μl. (ב) אורגנואידים הופרה בצפיפות גבוהה מדי, גורם לחפיפה של אורגנואידים ומוות תאים. (ג, ד) לאחר גירוי לילה עם OA, היווצרות LD ניתן להעריך ויזואלית. (ג) אורגנואידים היו לבן לילה עם 12% בקרת רכב bsa. (ד) אורגנואידים היו מודבטים לילה עם 1 mM OA מצופני bsa, וכתוצאה מכך מראה כהה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התוצאות הייצוגיות של אפיון LDF באמצעות דימות מיקוד וקורא לוחית פלורסנט. שליטה בריאה-נגזר-אורגנואידים היו לילה עם BSA, 1 mM OA, או 1 מ"מ OA + D1i. (A) הקרנה מרבית של 85 יקרומטר מערימות קונפוקלית וקדי ויטראז עבור dapi (ציאן) ו LD540 (צהוב). דמות משנה זו מותאמת מוואן ריין ואח '6. (ב) עוצמה פלואורסצנטית יחסית של LD540 מנורמל לאות dapi גרעינית כפי שנמדד באמצעות קורא צלחת פלורסנט. ממוצע ± SD מותווה עבור שני משכפל ביולוגי. מובהקות סטטיסטית נקבע באמצעות ANOVA חד כיוון ללא צעדים חוזרים עם הפוסט-הוק של Tukey. *, P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: התוצאות הייצוגיות של כימות LDF באמצעות הזרימה cy, לנסות. שליטה בריאה-נגזר-אורגנואידים היו לילה עם BSA, 1 mM OA, או 1 מ"מ OA + D1i. (א) לעבור על האסטרטגיה לבחירת תאים בודדים הנגזרים מאורגאיד. משמאל לימין, להוציא תחילה פסולת על ידי המשך עבור FSC-A/מיקוד. לאחר מכן השער על FSC-W/FSC-H ו-המטה-מדינת-מדינת-מדינת-מדינת-מדינת-מדינת-מדינת-המלך. לבסוף, השער עבור FSC-A/Hoechst לבחור עבור תאים חיים. שני ערוצי ה-LD540 והערוצים משמשים לכמת את היווצרות LD. היסטגרמות מפרמטרים אלה מציגים משמרת בעוצמת קרינה מרושעת (MFI) של (ב)הבנקהLD540-a ו-(ג) על גירוי עם OA. (D, E) ניתן להתוות את MFI לכל מדגם בגרף ולהשתמש בו לביצוע ניתוח סטטיסטי. ממוצע ± SD מותווה עבור שלושה משכפל ביולוגי. מובהקות סטטיסטית נקבע באמצעות ANOVA חד כיוון ללא צעדים חוזרים עם הפוסט-הוק של Tukey. *, P < 0.05; * *, P < 0.01; , P < 0.001. נתון זה מותאם מוואן ריין ואח '6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

כימי ממס ריכוז מניות ריכוז סופי
Wnt3a ס מ - 100% 50%
R-החתן-1 ס מ - 100% 20
ראש ס מ - 100% 10
A83 (TGFβ-inh) דימתיל סולפוקסיד 50 ממ ' 500 nM
B27 - 50x 1x
מגה מז ערוץ PBS/0.1% BSA 500 μg/mL 50 ng/mL
מרחריל מים 500 ממ ' 1.25 ממ '
Nicotinamide PBS 1 מדיום 10 ממ '
פרימוצין
(השתמש עד MCB נמצא במקפיא)		 - 50 מ"ג/mL 100 μg/mL
SB202190 (P38 inh) דימתיל סולפוקסיד 30 ממ ' 10 μM

טבלה משלימה 1: מתכון מדיום הרחבה ארגונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מספקים פרוטוקול כדי לקבוע את היווצרות LD במעי האנושי אורגנואידים על הדגירה עם חומצה אולאית. שיטה זו מבוססת על LD ספציפי לצבוע פלורסנט LD54018, אשר מאפשר אפיון וכימות של הנפח הכולל של טיפות השומנים בתוך תרבות אורגאידית. ההליכים להקמת ולתחזוקה של תרבויות בעלי מעיים אנושיים פורסמו לפני13, ומדריך חזותי של פרוטוקול זה זמין גם הוא15.

הצעדים הקריטיים בפרוטוקול זה הם התרבות של אורגנואידים המעי האנושי, ואת הקוניוגציה הנכונה של OA כדי BSA. התרבות של אורגנואידים דורש ניסוח נכון של מדיום התרבות, כמו התחזוקה של אוכלוסיית הגזע מאוד תלוי Wnt3A-CM פונקציונלי. כאשר Wnt3A-CM מורכב בתוך הבית, אנו ממליצים על זרימת עבודה סטנדרטית והייצור החודשי של המדיום הממוזג בשל זמן התפוגה של כ 2 חודשים. יתר על כן, 1:1 ערבוב של אצוות Wnt3A ברציפות לטווח ארוך, כפי שהיא מבטיחה כי אצווה משנה מעט מיטבית לא תהיה השפעה גדולה על גידול אורגאיד.

בנוסף, מוניטור שלנו מורכב מדיום DMEM תקדם/F12, אשר מכיל BSA עשיר ליפיד. מאז שליטה ברכב שלנו (12% BSA/BM) לא לגרום LD היווצרות באורגנואידים, אנו מסיקים כי כמות או סוג של FFA ב-BM לא מספיק כדי להשפיע על שיטת LDF.

הקוניוגציה של OA כדי BSA הוא תהליך עדין אשר עשוי לדרוש אופטימיזציה מסוימת. חווינו כי הפרוטוקול המתואר כאן הוא האופטימלי ביותר כאשר כל שינויי הטמפרטורה מבוצעים בקפדנות וכאשר בוצעו באמצעות זכוכית labware.

במחקר הקודם, היווצרות תעודת זהות שימשו כדי לאפיין את גודל ומספר ld עם הגדלה גבוהה8,12. מספר זה מבוצע בעיקר באמצעות בורון-דיפירורומנה (BODIPY) 493/503, המספק כתמים מצוינים עבור השלד עם יחס אות לרעש גבוה. עם זאת, ספקטרום הפליטה של BODIPY הוא רחב למדי, וחופף ברובו עם ספקטרום פלורסנט של חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-צבעים נגזר. למרות שאנו מצפים כי היישום הנוכחי של שיטת ldf יעבוד עם bodipy כמו גם, הבחירה עבור LD540 מאפשר מגוון רחב יותר של תמונות ססגוניות, כולל משותף עם תוויות gfp18. אנחנו גם ביצעו את השיטה הזאת באמצעות כתם השומנים הנילוס אדום (נתונים לא מוצגים). עם זאת, מאז הנילוס האדום נוטה להכתים לא רק השלד אלא גם bilayers השומנים, מצאנו כי אות הרקע הגבוה יותר של הנילוס אדום מפחית את הקיבולת של היכולת שלנו כדי להבחין הבדלים קטנים של היווצרות LD. מסיבות אלה, אנו מעדיפים להשתמש ב-LD540 בתוך שיטת LDF מבוססת-אורגאיד.

לעומת מחקרים מוקדמים יותר באמצעות הגדלה גבוהה LDF assays, הבקשה שאנו מתארים כאן מאפשר בדיקת תפוקה גבוהה של נפח LD הכולל באוכלוסייה גדולה של תאים. לכן, במיוחד את הקורא לוחית הפלורנטית, והוא עלול לנתח את הניתוח הציטומטרי של הזרימה, ניתן לשנות את השפעת התרופות על היווצרות LD. כפי שראינו כי היווצרות LD הוא במידה רבה DGAT1 תלוי, DGAT1-לקויה החולה נגזר או D1i המטופלים מטופלים מייצגים הזדמנות ברורה ליישום של כזה הקרנה. במיוחד עבור מחלות נדירות כאלה מתרחשות, שיטת LDF בשילוב עם החולה נגזר אורגנואידים יכול לספק פלטפורמה עבור המטופל ספציפי הקרנה עבור תרופות טיפוליות חדשות.

עם זאת, תוצאה של גישה בתפוקה גבוהה היא כי הכוח לאפיין את הזהות האישית אובד. בעוד שניתן להשתמש בהגדלה מיקרוסקופית הגבוהה או ההדמיה הפלואורסצנטית של ה-"מזהה המקום" ללימוד הדינמיקה בגודל LD ומספר12,19, הגישה לתפוקה גבוהה אינה מבדילה בין מספר קטן או פחות התעודות הגדולות ולכן לא ניתן להשתמש כדי לכמת את ההבדלים בחילוף החומרים LD היכן הנפח הכולל של המשוד נשאר קבוע. לכן, ביישומים שבהם חשודים מספר או גודל של ה-' המילד ' הם עניין, יש להתייחס לשיטה זו באמצעות טכניקת הגדלה גבוהה יותר. יתר על כן, האורגנואידים בתוך התקופה הנוכחית לקבל גירוי שומנים באסולתיים בעוד ליפידים תזונתיים הם בדרך כלל השתלטו על קרום פסגה. לכן יש להיזהר מסוימים אם יש לתרגם את התוצאות למצב הפיזיולוגי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים ב. Spee על מתן בנדיבות LD540. עבודה זו נתמכה על ידי ארגון הולנד להענקת מחקר מדעי (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) לס

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-028
B27 supplement  Gibco 17504-044
Basement membrane matrix (matrigel) BD Biosciences 356231
DAPI Sigma-Aldrich D9542-1MG
DGAT1 inhibitor (AZD 3988) Tocris Bioscience 4837/10
Fatty acid free BSA Sigma-Aldrich A7030
Formaldehyde Klinipath 4078-9001
Glutamin (GlutaMAX, 100x) Gibco 15630-056
HEPES (1 M) Gibco 15630-080
Laser scanning confocal microscope Leica SP8X
LD540 kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University
mEGF Peprotech 315-09_500ug
N-acetyl cysteine Sigma-Aldrich A9165-100G
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636-500G
Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Oleic acid Sigma-Aldrich O1008-5G
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) Sigma-Aldrich S7067-25MG
PBS Sigma-Aldrich D8662-500ML
PBS without Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537-500ML
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) Gibco 15070-063
R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) R&D systems 3710-001-01
TC-treated 24 well plates Greiner-One 662160
TC-treated black clear-bottom 96 well plates Corning Life Sciences 353219
TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)  Tocris Bioscience 2939/10
Trypsin (TrypLE Express) Life Technologies 12604021
WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) Abcam ab120129-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
  2. Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
  3. D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
  4. Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
  5. Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
  6. van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
  7. Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
  8. Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
  9. Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
  10. Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
  11. Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
  12. Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
  13. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  14. Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
  15. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  18. Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
  19. Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).

Tags

רפואה סוגיה 152 אורגנואידים למעיים אנושיים תרבות תא ראשית ביופסיה טיפות ליפיד DGAT1 מיקרוסקופיה קונפוקלית
שיטת פלואורסצנטית מבוססת על האפיון והקוונפיקציה של היווצרות Droplet ליפיד בגוף מעיים אנושי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van Rijn, J. M., van Hoesel, M.,… More

van Rijn, J. M., van Hoesel, M., Middendorp, S. A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60150, doi:10.3791/60150 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter