שיטת פלואורסצנטית מבוססת על האפיון והקוונפיקציה של היווצרות Droplet ליפיד בגוף מעיים אנושי
Summary
פרוטוקול זה מתאר את התצורה של היווצרות droplet (LD) של השומנים במבנה המעי האנושי על גירוי עם חומצות שומן. אנו דנים כיצד משתמשים באותה שיטת לכימות היווצרות LD, וכיצד ניתן להשתמש בה עבור הקרנת תפוקה גבוהה עבור תרופות המשפיעות על היווצרות LD.
Abstract
ליפידים תזונתיים נלקחים כמו חומצות שומן חינם (בדרך) על ידי אפיתל המעי. אלה מintracellularly המרה לתוך הטריגליצרידים (TG) מולקולות, לפני שהם ארוזים לתוך chylomicrons לצורך הובלה לימפה או לתוך השומנים טיפות ציטוסולג (המוני) עבור אחסון תאיים. צעד מכריע עבור היווצרות של ה-“השלד” הוא הפעילות הקטליטית של הדיליליגליל (DGAT) בשלב הסופי של הסינתזה TG. המורדים חשובים לחיץ מינים רעילים השומנים ולווסת את חילוף החומרים הסלולרי בסוגי תאים שונים. מאז אפיתל המעי האנושי הוא התעמת באופן קבוע עם ריכוזים גבוהים של שומנים, היווצרות LD הוא בעל חשיבות רבה כדי לווסת הומאוסטזיס. כאן אנו מתארים את הבקשה הפשוטה לאפיון וככמת של היווצרות LD (LDF) על גירוי עם חומצת שומן בלתי רווי הנפוץ ביותר, חומצה אולאית, ב אורגנואידים המעי האנושי. שיטת ה-ldf מבוססת על הצבע הפלורסנט הספציפי LD LD540, אשר מאפשר כימות של הזדהות על ידי קונפוקלית מיקרוסקופ מיקוד, הקורא צלחת הפלורסנט, או הזרימה cy, try. שיטת LDF ניתן להשתמש כדי לאפיין את היווצרות LD בתאי האפיתל המעי האנושי, או ללמוד אנושי (גנטי) הפרעות המשפיעות על מטבוליזם LD, כגון DGAT1 מחסור. יתר על כן, ניתן להשתמש באפשרות זו גם בצינור תפוקה גבוהה כדי לבדוק תרכובות טיפוליות הרומן, אשר לשחזר פגמים ביצירת LD במעיים או סוגים אחרים של אורגנואידים.
Introduction
שומנים הם מרכיב חיוני של התזונה האנושית ולשחק תפקיד חשוב אחסון אנרגיה מערכתית ומטבוליזם. כאשר בלע, ליפידים תזונתיים הם מושפל לתוך חומצות שומן בחינם (FFAs) ו monoglycerides (MGs) על ידי lipases הלבלב. מצעים אלה נלקחים לאחר מכן על ידי הנוציטים של האפיתל המעי, שם הם הראשונים מחדש לדיגלידים (DG) על ידי אנזימים מונגליד (MGAT) ולאחר מכן לטריגליצרידים (TG) על ידי diacylגליצרול (DGAT1)1. לבסוף, האלה משולבים ב-טי. אס. או chylomicrons לייצוא למערכת הלימפה או טיפות השומנים ציטוסולג (השלד) עבור אחסון תאיים2,3. למרות שchylomicrons נחוצים להפצת שומנים תזונתיים לאיברים אחרים, החשיבות של אחסון שומן תאיים ב-השלד אינה ברורה לחלוטין. עם זאת, המכונה הוכחו לבצע פונקציה תקינה במעי, כפי שהם לאט לשחרר שומנים לתוך המחזור עד 16 h אחרי ארוחה4. יתר על כן, המוני הוכחו להגן מפני ריכוזי חומצות שומן רעילים, כגון במהלך התנאים לפני העכבר5.
חלבון DGAT1 ממוקם על הממברנה האנדופלזמית (ER) וממלא תפקיד מכריע ב-LD היווצרות ב אפיתל המעי. מוטציות Homozygous ב DGAT1 להוביל שלשול מוקדם התפרצות חמורה ו/או הקאות, היפואלבומין, ו/או (קטלני) חלבון מאבד בידור עם כישלון מעיים על צריכת שומן, הממחישות את החשיבות של DGAT1 הומאוסטזיס השומנים של האדם , אפיתל המעי6,7,8,9,10 מאז התרחשות של DGAT1-מחסור בבני אדם הוא נדיר, הגישה לתאים שנגזר מטופל הראשי כבר נדיר. יתר על כן, התרבות ארוכת טווח של תאים אפיתל המעי כבר זמן רב מוגבלת קווי הגידול נגזר התאים אשר מייצגים את הפיזיולוגיה נורמלי רק להאריך מוגבל. לכן, היווצרות DGAT1-בתיווך LD למדו בעיקר בפיברותקיעות או בעלי חיים שמקורם שורות תא7,10,11,12. בתור כזה, זה היה לאחרונה הראו כי DGAT1-לקויה מטופלים נגזר פיברוטים לצבור פחות התעודות לעומת תאים בריאים לאחר גירוי עם חומצה אולאית (OA)8.
בעבר, פרוטוקולים הוקמו בתאי גזע האפיתל התרבות מכל איבר העיכול בצורה של תלת מימדי (3D) אורגנואידים13. מעיים אלה ניתן לשמור בתרבות במשך תקופה ארוכה של13, ולאפשר את המחקר הפונקציונלי של המטופל-ואת המעיים מיקום ספציפי מאפיינים האפיתל14. הם גנטית, פנופנטיות בדרך כלל יציבה וניתן לאחסן, המאפשר הרחבה ארוכת טווח ו biobanking13.
לאחרונה הדגמנו כי היווצרות LD ניתן למדוד בקלות בתוך אורגנואידים המעי האנושי במערך LD (LDF) שיטת6. כאשר הם חשופים OA עבור 16 h, אורגנואידים ליצור התעודות כדי להגן על התאים מפני רעילות המושרה ליפיד. כאשר ריכוזי OA גבוהים מדי, התאים מתים על ידי caspase-תיווך ואפופטוזיס6. שיטת LDF הוצגה בעבר להיות תלויה במידה רבה ב DGAT1 כפי שצוין על ידי אורגנואידים נגזר מהחולים DGAT1-מוטנטים ועל ידי שימוש במעכבי DGAT1 ספציפיים6.
עבור שיטת ה-LDF המתוארת בפירוט כאן, אורגנואידים תלת-ממדיים הם מתורבתים מפני ביופסיות מעיים ומהווים שבועי באמצעות הפרעה לתאים בודדים היוצרים בקלות אורגנואידים חדשים. עבור הפעלת שיטת LDF, ~ 7,500 התאים היחידים הנגזרים אורגאיד מצופים בכל טוב של צלחת 24-הבאר. אורגנואידים נוצרות לאורך מספר ימים, מודלבן לילה עם OA 1 מ”מ ו ויטראז ‘ עם LD540, תא פלורסנט-מוגדר-LD לצבוע ספציפי המקל הדמיה. היווצרות LD הוא לאחר מכן כימות על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, לוחית הפלורסנט קורא, או לזרום cy, לנסות.
על-ידי שינוי קנה מידה זה היווצרות זיהוי LD לפורמט 96-ובכן, הטיפול יכול לשמש גם עבור ניתוח תפוקה גבוהה של היווצרות LD למסך תרופות הרומן המשפיעות על היווצרות LD בתרבויות המעי האנושי מחלות, או ללמוד (האדם הגנטי) הפרעות המשפיעות על . מטבוליזם של LD
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מספקים פרוטוקול כדי לקבוע את היווצרות LD במעי האנושי אורגנואידים על הדגירה עם חומצה אולאית. שיטה זו מבוססת על LD ספציפי לצבוע פלורסנט LD54018, אשר מאפשר אפיון וכימות של הנפח הכולל של טיפות השומנים בתוך תרבות אורגאידית. ההליכים להקמת ולתחזוקה של תרבויות בעלי מעיים אנושיים פ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ב. Spee על מתן בנדיבות LD540. עבודה זו נתמכה על ידי ארגון הולנד להענקת מחקר מדעי (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) לס
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
- D’Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
- Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
- Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
- van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
- Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
- Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
- Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
- Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
- Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
- Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
- Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).
