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मानव आंत्र organoids में लिपिड ड्रॉपलेट गठन की विशेषता और परिमाणीकरण के लिए एक फ्लोरोसेंट आधारित परख

Published: October 13, 2019 doi: 10.3791/60150
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Division of Pediatrics, Department of Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 2Regenerative Medicine Center, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 3Science for Life Laboratory, Department of Medical Biochemistry and Microbiology, Uppsala University

Summary

इस प्रोटोकॉल फैटी एसिड के साथ उत्तेजना पर मानव आंतों organoids में लिपिड छोटी बूंद (एलडी) गठन की विशेषता के लिए एक परख का वर्णन करता है. हम चर्चा कैसे इस परख एलडी गठन के परिमाणीकरण के लिए प्रयोग किया जाता है, और यह कैसे दवाओं है कि LD गठन को प्रभावित करने के लिए उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

आहार लिपिड को आंतों के उपकला द्वारा मुक्त फैटी एसिड (एफए) के रूप में लिया जाता है। इन FAs intracellularly ट्राइग्लिसराइड (TG) अणुओं में परिवर्तित कर रहे हैं, इससे पहले कि वे lymph के लिए परिवहन के लिए या cytosolic लिपिड बूंदों में intracellular भंडारण के लिए chylomicrons में पैक कर रहे हैं. एल डी के गठन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम टीजी संश्लेषण के अंतिम चरण में diacylglycerol acyltransferases (डीजीएटी) के उत्प्रेरक गतिविधि है। एल डी विषाक्त लिपिड प्रजातियों बफर और विभिन्न सेल प्रकार में सेलुलर चयापचय को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. चूंकि मानव आंतों उपकला नियमित रूप से लिपिड के उच्च सांद्रता के साथ सामना किया जाता है, एलडी गठन homeostasis को विनियमित करने के लिए बहुत महत्व का है। यहाँ हम मानव आंतों organoids में सबसे आम असंतृप्त फैटी एसिड, oleic एसिड के साथ उत्तेजना पर एलडी गठन (LDF) की विशेषता और परिमाणीकरण के लिए एक सरल परख का वर्णन. LDF परख LD-विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाई LD540 पर आधारित है, जो confocal माइक्रोस्कोपी, फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर, या प्रवाह साइटोमिति द्वारा एलडी के परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है. LDF परख मानव आंतों उपकला कोशिकाओं में एलडी गठन की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या मानव का अध्ययन करने के लिए (आनुवंशिक) विकारों है कि एलडी चयापचय को प्रभावित, जैसे DGAT1 की कमी. इसके अलावा, इस परख भी एक उच्च थ्रूपुट पाइप लाइन में इस्तेमाल किया जा सकता है उपन्यास चिकित्सीय यौगिकों का परीक्षण करने के लिए, जो आंतों या organoids के अन्य प्रकार में एलडी गठन में दोष बहाल.

Introduction

लिपिड मानव आहार का एक महत्वपूर्ण घटक हैं और प्रणालीगत ऊर्जा भंडारण और चयापचय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। जब ingested, आहार लिपिड मुक्त फैटी एसिड में अपमानित कर रहे हैं (FFAs) और monoglycerides (MGs) अग्नाशय lipases द्वारा. इन substrates तो आंतों उपकला के entercytes द्वारा लिया जाता है, जहां वे पहले re-esterified कर रहे हैं diglycerides (डीजी) मोनोग्लाइसराइड acyltransferases द्वारा (MGAT) एंजाइमों और बाद में ट्राइग्लिसराइड्स (टीजी) के लिए dicylglyrol द्वारा acyltransferase 1 (DGAT1)1| अंत में, इन टीजी को इंट्रासेल्यूलर स्टोरेज2,3के लिए लसीका प्रणाली या साइटोसोलिक लिपिड बूंदों (एलडी) के निर्यात के लिए या तो किलोमाइक्रोन में एकीकृत किया जाता है। हालांकि chilomicrons अन्य अंगों के लिए आहार लिपिड वितरित करने के लिए आवश्यक हैं, LDs में intracellular वसा भंडारण के महत्व को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं है. हालांकि, एलडी को आंत में एक नियामक कार्य करने के लिए दिखाया गया है, क्योंकि वे धीरे-धीरे भोजन4के बाद 16 एच तक लिपिड को परिसंचरण में छोड़ देते हैं। इसके अलावा, एलडी विषाक्त फैटी एसिड सांद्रता के खिलाफ की रक्षा के लिए दिखाया गया है, जैसे lipolytic शर्तों के दौरान माउस एडिपोसाइट्स में5.

DGAT1 प्रोटीन एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) झिल्ली पर स्थित है और आंतों उपकला में एलडी गठन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। DGAT1 में समयुग्मज उत्परिवर्तनों के कारण प्रारंभिक-ऑनसेट गंभीर दस्त और/या उल्टी, हाइपोएल्बुमिनमिया, और/या (घातक) प्रोटीन खोने वाले आंत्र वसा सेवन पर आंतों की विफलता के साथ आंत्र विफलता के साथ, मानव के लिपिड होमियोस्टेसिस में DGAT1 के महत्व का चित्रण आंत्र उपकला6,7,8,9,10. चूंकि मनुष्यों में DGAT1 की कमी की घटना दुर्लभ है, प्राथमिक रोगी व्युत्पन्न कोशिकाओं तक पहुंच दुर्लभ हो गई है। इसके अलावा, आंतों उपकला कोशिकाओं की दीर्घकालिक संस्कृति लंबे समय से ट्यूमर व्युत्पन्न सेल लाइनों जो केवल एक सीमित विस्तार करने के लिए सामान्य शरीर क्रिया विज्ञान का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रतिबंधित किया गया है। इसलिए, DGAT1-मध्यस्थ एल डी गठन ज्यादातर फाइब्रोब्लास्ट्स या पशु व्युत्पन्न सेल लाइनों7,10,11,12में अध्ययन किया गया है । इस प्रकार, यह हाल ही में दिखाया गया था कि DGAT1 कमी रोगी व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट्स oleic एसिड (OA)8के साथ उत्तेजना के बाद स्वस्थ नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में कम एलडी जमा .

इससे पहले, प्रोटोकॉल तीन आयामी (3 डी) organoids13के रूप में किसी भी जठरांत्र अंग से उपकला स्टेम कोशिकाओं संस्कृति के लिए स्थापित किए गए थे. इन आंतों के organoids13समय की एक लंबी अवधि के लिए संस्कृति में रखा जा सकता है , और रोगी और आंतों के स्थान विशेष उपकला विशेषताओं14के कार्यात्मक अध्ययन की अनुमति . वे आनुवंशिक रूप से और phenoआमरूपा स्थिर कर रहे हैं और संग्रहीत किया जा सकता है, लंबी अवधि के विस्तार और biobanking13की अनुमति.

हमने हाल ही में यह प्रदर्शित किया है कि एल डी गठन को मानव आंतों के organoids में एलडी गठन (एलडीएफ) परख 6 में आसानी से मापा जा सकताहै। जब 16 ज के लिए OA के संपर्क में, organoids लिपिड प्रेरित विषाक्तता से कोशिकाओं की रक्षा के लिए LDs उत्पन्न करते हैं. जब OA सांद्रता बहुत अधिक होती है, तो कोशिकाएं कैपेस-मध्यस्थ एपोप्टोसिस6से मर जाती हैं। एलडीएफ परख को पहले DGAT1 पर काफी हद तक निर्भर दिखाया गया था जैसा कि DGAT1-म्यूटेंट रोगियों से प्राप्त organoids द्वारा और DGAT1-विशिष्टअवरोधकों 6के उपयोग द्वारा दर्शाया गया था।

एलडीएफ परख के लिए यहाँ विस्तार से वर्णित, 3 डी organoids आंतों बायोप्सी से सुसंस्कृत हैं और एकल कोशिकाओं है कि आसानी से नए organoids फार्म में व्यवधान से साप्ताहिक पारित कर रहे हैं. एलडीएफ परख चलाने के लिए, $ 7,500 organoid व्युत्पन्न एकल कोशिकाओं को एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में चढ़ाया जाता है. Organoids कई दिनों में गठन कर रहे हैं, 1 एम एम OA के साथ रात भर incubated और LD540 के साथ दाग, एक फ्लोरोसेंट सेल permeable एलडी विशिष्ट डाई कि इमेजिंग की सुविधा. एलडी गठन तो confocal माइक्रोस्कोपी, फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर, या प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मात्रा निर्धारित है.

एक 96 अच्छी तरह से प्रारूप करने के लिए इस एलडी गठन परख स्केलिंग करके, परख भी मानव आंतों organoid संस्कृतियों में एलडी गठन को प्रभावित जो उपन्यास दवाओं के लिए स्क्रीन करने के लिए LD गठन के उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या अध्ययन करने के लिए (मानव आनुवंशिक) विकारों है कि प्रभावित एलडी चयापचय.

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Protocol

यहां वर्णित मानव ऊतकों का उपयोग करते हुए सभी प्रयोग विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर यूट्रैक्ट (यूएमसीयू) में नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे। ऊतक संग्रह, पीढ़ी, भंडारण, और organoids के उपयोग के लिए सूचित सहमति Wilhelmina बच्चों के अस्पताल (WK$)-UMCU में रोगियों से प्राप्त किया गया था.

1. संस्कृति मीडिया की तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर किया जाना चाहिए. organoids मानक सेल संस्कृति के दिशा निर्देशों के अनुसार नियंत्रित किया जाना चाहिए.

  1. आधारी संस्कृति माध्यम तैयार करें।
    नोट:     विकास कारकों के बिना संस्कृति माध्यम बेसल माध्यम (बीएम) के रूप में संदर्भित किया जाता है।
    1. बीपीएस (1 एमएल), एल-ग्लूटामिन (100x) के 5 एमएल और 5 एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (5,000 यू/एमएल) को 500 एमएल उन्नत डुलबेकको के ईगल ईगल को बीएम माध्यम तैयार करने के लिए उन्नत डुल्बेकको के ईगल के साथ संशोधित माध्यम जोड़ें।
    2. तैयार बीएम माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें और अधिकतम 2 महीने के लिए उपयोग करें।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार आर-स्पॉन्डिन और नोगिन वातानुकूलित माध्यम (सीएम) तैयार करें।
    1. संक्षेप में, 5x 107 कोशिकाओं के साथ hyperflasks में वांछित मात्रा के लिए कोशिकाओं को बड़े हो 555 एमएल माध्यम में चयनात्मक एंटीबायोटिक प्रति फ्लास्क के बिना.
    2. 4 दिनों के लिए कोशिकाओं को बढ़ाएँ जब तक confluent.
    3. 8 अतिरिक्त दिनों के लिए बीएम और संस्कृति के साथ माध्यम बदलें.
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति के 8 दिनों के बाद, किसी भी शेष कोशिकाओं को गोली के लिए 450 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए संस्कृति मध्यम और अपकेंद्रित्र इकट्ठा।
    5. सुपरनेंट को छानकर, और अधिकतम 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर आर-स्पॉन्डिन या नोगिन मुख्यमंत्री के एलाइजाट्स को स्टोर करें।
  3. Wnt3A-CM बोज एट अल15के अनुसार तैयार करें ।
    1. संक्षेप में, 2 x 106 कोशिकाओं के साथ 20 एमएल माध्यम में चयनात्मक प्रति पकवान एंटीबायोटिक के बिना 145 मिमी व्यंजन में वांछित मात्रा के लिए कोशिकाओं को बड़े होते हैं। संस्कृति माध्यम के वाष्पीकरण से बचने के लिए प्लास्टिक की पन्नी के साथ प्रत्येक पकवान लपेटें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति के 8 दिनों के बाद, किसी भी शेष कोशिकाओं को गोली के लिए 450 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए संस्कृति मध्यम और अपकेंद्रित्र इकट्ठा।
    3. सुपरनेंट को छानकर, और अधिकतम 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर Wnt3A-CM के alicots की दुकान।
  4. ऑर्गेनॉइड विस्तार माध्यम तैयार करें।
    नोट:     मानव छोटे आंतों organoid विस्तार माध्यम (पूरक तालिका 1में नुस्खा देखें) hSI-EM के रूप में जाना जाता है. निम्न चरणों का अंतिम वॉल्यूम 1 L hSI-EM का उत्पादन करेगा, और आवश्यक के रूप में स्केल किया जा सकता है या नीचे।
    1. 1 म के अंतिम कमजोर पड़ने के लिए सेल कल्चर ग्रेड फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के 12 एमएल में 1ण्46 ग्राम निकोटिनमाइड को भंग करें।
    2. 500 एमएल सेल कल्चर ग्रेड पीबीएस में एन-ऐसीटिल सिस्टीन की 245 मिलीग्राम भंग करने से 500 एम एम का अंतिम कमजोर पड़ने का निर्माण होता है।
      नोट: एक समाधान के गठन में तेजी लाने के लिए, Nicotinamide और n-ऐसीटिल cysteine 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में incubated किया जा सकता है. दोनों समाधान बैच में तैयार किया जा सकता है, aliकोत, और भविष्य में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत.
    3. फ़िल्टर एक बाँझ 15 एमएल ट्यूब में एक 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से दोनों समाधान बाँझ.
    4. एक बाँझ 500 एमएल संस्कृति मध्यम फ्लास्क के लिए बीएम के 167 एमएल जोड़ें। आर-स्पॉन्डिन-सीएम के 200 एमएल जोड़ें, नोगिन-सीएम के 100 एमएल, और रिकॉमबिनेंट एमईजीएफ के 100 $L (500 $g/mL) को अंतिम सांद्रता में 50 एनजी/
    5. बंध्याकरण निकोटिनमाइड समाधान के 10 एमएल और स्टरलाइज़्ड एन-ऐसीटिल सिस्टीन समाधान के 2.5 एमएल जोड़ें। B27 पूरक (50x) के 20 एमएल जोड़ें.
      नोट: इस स्तर पर, माध्यम को बिना WAS (Wnt3A-CM, A83-01, और SB202190) के बिना एचएसआई-ईएम के रूप में संदर्भित किया जाता है, और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर जमा किया जा सकता है। यदि माध्यम को छोटे खंडों में शामिल किया गया है, तो तदनुसार निम्नलिखित चरणों की सांद्रता समायोजित करें।
    6. WAS बिना hSI-EM के 500 एमएल करने के लिए, Wnt3A-CM के 10 एमएल पिछले ताजा तैयार बैच के और Wnt3A-सीएम के 10 एमएल Wnt3A-सीएम की स्थिति में परिवर्तनशीलता परिवर्तन को कम करने के लिए जोड़ें।
    7. 500 nM की एक अंतिम एकाग्रता के लिए A83-01 जोड़ें, और SB202190 10 डिग्री एम की एक अंतिम एकाग्रता के लिए.
    8. तैयार एचएसआई-ईएम (WAS के साथ) को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें और अधिकतम 2 सप्ताह के लिए उपयोग करें।
      नोट: 10 डिग्री सेल्सियस की एक अंतिम एकाग्रता के लिए अतिरिक्त Y-27632 जोड़ें (hSI-EM+Y के रूप में संदर्भित) जब crypts या एकल कोशिकाओं को सुसंस्कृत कर रहे हैं या organoids cryopservation से शुरू कर रहे हैं.
  5. फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) बफर तैयार करें।
    1. 10% FCS की एक अंतिम एकाग्रता के लिए CA2 +/ Mg2 + बिना पीबीएस के 40 एमएल करने के लिए भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के 10 एमएल जोड़ें।
      नोट: एफसीएस कोशिकाओं को प्रयोगशाला का उपयोग करने से रोकता है।

2. मानव छोटे आंत्र organoids के लिए संस्कृति प्रक्रियाओं

नोट: इस प्रोटोकॉल एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर किया जाना चाहिए. organoids मानक सेल संस्कृति के दिशा निर्देशों के अनुसार नियंत्रित किया जाना चाहिए. organoids या organoid व्युत्पन्न कोशिकाओं से निपटने, कोशिकाओं बर्फ पर रखा जाना चाहिए जब भी संभव हो. कोशिकाओं को कटाई के बाद कुछ घंटों के लिए व्यवहार्य रहेगा जब यह सुनिश्चित किया जाता है। ऑर्गेनोइड्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मानक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत किया जाना चाहिए जिसमें 5% सीओ2है . ये शर्तें इस प्रोटोकॉल के दौरान तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (बीएमएम; यानी मैट्रिगेल) में एम्बेडेड organoids के साथ सभी ऊष्मायन चरणों पर लागू होती हैं। लेखकों इन परख के लिए ग्रहणी व्युत्पन्न organoids इस्तेमाल किया है.

  1. पासिंग ऑर्गेनॉइड्स
    नोट    : हर organoid संस्कृति अपने स्वयं के दोहरीकरण समय है. आम तौर पर, छोटे आंतों organoids पारित किया जा सकता है 1:3 "1:5 हर 7 "10 दिन. जब एकल कोशिकाओं के रूप में पारित, passaging दक्षता अप करने के लिए किया जा सकता है 1:20, सेल घनत्व पर निर्भर करता है. स्थापना और रखरखाव के लिए, organoids 24-वेल प्लेटों में सुसंस्कृत हैं; LDF परख के लिए, या तो 24 या 96 अच्छी प्लेटों में.
    1. तैयारी
      1. प्री-वार्म ने 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इन्क्यूबेटर में 24-वेल टिशू कल्चर प्लेट्स को खोल दिया, 5 % सीओ2 कम से कम रात में और अधिमानतः 5 दिन पहले।
        नोट: कोशिका संस्कृति में ऊतक संस्कृति प्लेटों को पूर्व-गर्म करने से बीएमएम की organoid युक्त बूंदों के उचित गठन और लगाव सुनिश्चित होता है।
      2. फ्रीज-थॉव चक्रों की संख्या को कम करने के लिए, बीएमएम के 1 एमएल एलिकोट्स तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। organoid passaging प्रक्रिया शुरू करने से पहले कम से कम 30 मिनट बर्फ पर BMM की एक शीशी thaw.
      3. धोने के माध्यम के रूप में बर्फ पर बीएम की एक 50 एमएल ट्यूब रखें।
      4. HSI-EM को अनुभाग 1.4 में वर्णित के रूप में तैयार करें, और hSI-EM+Y की एक उचित मात्रा तैयार करें, उदाहरण के लिए, एक पूर्ण 24-वेल प्लेट के लिए 15 एमएल।
    2. organoids लीजिए.
      1. बीएमएम की बूंदों को परेशान किए बिना संस्कृति माध्यम को सावधानी से प्रेरित करें।
      2. organoids के पहले अच्छी तरह से करने के लिए ठंड बीएम के 500 डिग्री एल जोड़ें, और धीरे ऊपर और नीचे एक P1000 पाइप्ट के साथ pipeting द्वारा organoids के साथ BMM बूंदों को बाधित.
      3. इस प्रक्रिया को उसी माध्यम से अगले साथ-साथ आवश्यक दोहराएँ, लेकिन बीएम के 500 डिग्री एल पर 2 कुओं से अधिक फसल न करें।
      4. एक कम बाध्यकारी 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में organoids ले लीजिए और 15 डिग्री 20 s (अधिकतम 2,000 x g)के लिए एक मिनी टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में नीचे स्पिन। सुपरनेंट को पूरी तरह से प्रेरित करें और एक P200 पाइप्ट के साथ माध्यम के अंतिम बिट को हटा दें।
        नोट: जब organoids संस्कृतियों एक माइक्रोस्कोप के नीचे साफ लग रही है और किसी भी मृत कोशिकाओं या अन्य मलबे शामिल नहीं है, BMM बूँदें कदम 2.1.2.2 में बीएम के बजाय trypsin में सीधे काटा जा सकता है. चरण 2.1.2.3 के बाद, चरण 2.1.3.1 में सीधे ऊष्मायन के लिए आगे बढ़ें।
    3. अंगको एकल कोशिकाओं में वियोजन ितना.
      1. काता नीचे organoids करने के लिए trypsin के 400 $L जोड़ें. पानी के स्नान में 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर organoids इनक्यूबेट करें।
      2. एक P200 पाइप्ट के साथ धीरे से ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं के शेष समुच्चय को बाधित. फिर, एक पानी के स्नान में 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर organoids इनक्यूबेट।
      3. 4x आवर्धन का उपयोग करएक सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत कोशिका वियोजन की प्रगति की जाँच करें। कोशिकाओं के बड़े clumps रहते हैं जब मैनुअल व्यवधान और ऊष्मायन दोहराएँ.
      4. जब केवल एकल कोशिकाएं रहती हैं, तो 1 एमएल BM जोड़ें और 15$20 s के लिए एक मिनी टेबलटॉप अपकेंद्रण में कोशिकाओं को स्पिन करें।
      5. सुपरनेटेंट को पूरी तरह से प्रेरित करें। एक P200 पाइप्ट का उपयोग कर ताजा hSI-EM के 200 $L में एकल कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। hSI-EM का एक अतिरिक्त 800 $L जोड़ें.
      6. निलंबन में कक्षों की संख्या की गणना करें.
        नोट: लेखकों की प्रयोगशाला में, अलग organoid कोशिकाओं के मैनुअल गिनती एक स्वचालित सेल काउंटर की तुलना में अधिक विश्वसनीय परिणाम पैदावार. जब एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग किया जाता है, downstream अनुप्रयोगों के लिए सेल घनत्व घर में परीक्षण किया जाना चाहिए और समायोजित अगर बहुत कम या बहुत अधिक organoids बाहर हो जाना.
    4. रखरखाव या लिपिड छोटी बूंद गठन परख के लिए बीज organoids.
      1. अंतिम कोशिका घनत्व के लिए आवश्यक कोशिकाओं की मात्रा की गणना कीजिए।
        नोट: लगभग 250 कोशिकाओं/जेडएल एक उपयुक्त घनत्व है। 24-वेल प्लेट में, प्रत्येक कुएं में 30 डिग्री सेल्सियस सीड होता है, जबकि 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 5 डिग्री सेल्सियस को बीज दिया जाता है।
      2. निलंबन की उचित मात्रा को बाहर ले जाओ और 750 कोशिकाओं के लिए घनत्व को समायोजित /
      3. 2:1 के अनुपात में कक्ष निलंबन में BMM जोड़ें. इस मिश्रण में अंतिम कोशिका घनत्व 250 कोशिकाओं/जेडएल है। धीरे-धीरे किसी भी बुलबुले से बचने के लिए पाइपिंग द्वारा निलंबन को मिला दें।
      4. एक पूर्व गर्म ऊतक संस्कृति प्लेट में, एक 24 अच्छी तरह से थाली या एक 96 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति एक 5 डिग्री एल छोटी बूंदों में अच्छी तरह से प्रति तीन 10 डिग्री एल बूंदों बाहर बीज.
      5. बीएमएम की बूंदों को ठोस बनाने के लिए प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 10 डिग्री 15 मिनट के लिए 5% ब्व्2 में एक इन्क्यूबेटर में रखें। इस बीच, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में एचएसआई-ईएम + वाई की एक उचित राशि पूर्व गर्म।
      6. ध्यान से एक 24 अच्छी तरह से थाली या एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से पूर्व-वार्म्ड HSI-EM+Y के 500 $L जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 और 2 डिग्री 3 दिनों के बाद एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को क्यूबे में रखें, माध्यम को एचएसआई-ईएम (बिना वाई के) में बदलें और सप्ताह में 2 बार ताज़ा करें।
        नोट: 7 डिग्री 10 दिनों के बाद, organoids के रखरखाव संस्कृति फिर से पारित किया जाना चाहिए.

3. लिपिड ड्रॉपलेट गठन परख

  1. ओलिक एसिड संयुग्मी की तैयारी
    नोट:     के बाद से oleic एसिड (OA) हाइड्रोफोबिक और पानी में घुलनशील नहीं है, यह गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) के लिए संयुग्मी है. बीएसए कई फैटी एसिड अणुओं बाँध कर सकते हैं और इस मामले में एक 1:8 अनुपात में इस्तेमाल किया है oleic एसिड आंतों की कोशिकाओं के लिए सुलभ बनाने के लिए. नि: शुल्क फैटी एसिड और बीएसए दोनों प्लास्टिक labware के लिए बाध्य कर सकते हैं. एक उचित अंतिम एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए, जब भी संभव हो कांच की शीशियों और कांच के पिपेट का उपयोग करें।
    1. कमरे के तापमान पर तरल oleic एसिड के 0.2 ग्राम वजन। संस्कृति ग्रेड बाँझ पीबीएस के 1.5 एमएल जोड़ें और मिश्रण को 70 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 एच भंवर आवर्तक रूप से गर्म करें।
    2. 5.89 ग्राम फैटी एसिड-मुक्त बीएसए और पीबीएस के 33.9 एमएल में भंग। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में मिश्रण गर्म जब तक बीएसए पूरी तरह से भंग कर दिया है.
    3. ठीक बूंदों की पायस बनाने के लिए फिर से OA मिश्रण भंवर और तुरंत एक गिलास पाइप का उपयोग कर बीएसए समाधान करने के लिए इसे जोड़ने के लिए। OA जोड़ने के बाद अंतिम समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस के करीब रखें। अंतिम मिश्रण 2.5 एम एम बीएसए में 20 एम एम OA के होते हैं।
    4. मिश्रण को 30 मिनट तक 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि एक स्पष्ट पीला समाधान न बना रहे।
    5. OA-BSA संयुग्मी को कम से कम 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोटेंड किया जा सकता है और जमे हुए किया जा सकता है। एक एलिकोट को थपथपाने पर, इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि बादल घुल न जाए और मिश्रण फिर से स्पष्ट न हो जाए।
      नोट: अंतिम समाधान के उच्च प्रोटीन और लिपिड सामग्री के कारण, मिश्रण को निष्फल या ऑटोक्लेवित फ़िल्टर नहीं किया जा सकता है। जब घटकों देखभाल के साथ नियंत्रित किया गया, एक laminar प्रवाह हुड में जब संभव है और बाँझ पीबीएस का उपयोग कर, लेखकों माइक्रोबियल संक्रमण का अनुभव नहीं किया.
  2. एलडीएफ कॉन्फोकल परख
    1. नमूना तैयारी
      1. धारा 2.1 में वर्णित के रूप में मार्ग organoids. एक काले स्पष्ट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली में organoid व्युत्पन्न एकल कोशिकाओं बीज.
      2. एचएसआई-ईएम पर संस्कृति के 6 दिन, एचएसआई-ईएम युक्त 1 एम एम ओए-बीएसए संयुग्मी के साथ संस्कृति माध्यम की जगह।
      3. कोशिकाओं को 16 डिग्री 17 ज (रात में) की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर या 0ण्1 डिग्री डीजीएटी1 अवरोधक की अनुपस्थिति में इनक्यूबेट करें। 2.5 एम एम बीएसए के एक वाहन नियंत्रण शामिल करें।
      4. 16 डिग्री 17 एच के बाद, बीएमएम बूंदों को परेशान किए बिना माध्यम को प्रेरित करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कुओं के लिए 4% तटस्थ बफर फार्मेडिहाइड के 100 $L जोड़कर organoids को ठीक करें।
        नोट: formaldehyde आंशिक रूप से बीएमएम भंग होगा, जबकि organoids नीचे सिंक और थाली के नीचे का पालन करें.
      5. धीरे से formaldehyde निकालें, और ध्यान से अच्छी तरह से प्रति पीबीएस के 150 डिग्री एल के साथ कुओं धोने.
      6. LDs के लिए कोशिकाओं को दाग के साथ 0.025 mg/mL LD540 और 4 $,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए.
      7. कुओं को पीबीएस से सावधानी से धो लें।
        नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है जब आवश्यक हो. पीबीएस में नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रखें। LD540 धुंधला एक सप्ताह तक के लिए स्थिर रहेगा. यह परख भी लाइव कोशिकाओं के साथ किया जा सकता है, समय की अवधि में एलडी गठन की निगरानी करने के लिए. इसके लिए, प्रोटोकॉल से छोड़ा जा करने के लिए निर्धारण है, और DAPI Hoechst धुंधला के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। LD540 वर्णित के रूप में एक ही एकाग्रता में रहने वाले कोशिकाओं में LDs दाग कर सकते हैं.
    2. कॉन्फोकल इमेजिंग
      नोट: इमेजिंग काले स्पष्ट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली में तैयार organoid नमूने पर किया जा सकता है.
      1. पूरे organoids के अवलोकन छवियों के लिए, confocal फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए अनुकूल एक 40x उद्देश्य का उपयोग करें.
      2. 405 एनएम उत्तेजना पर DAPI चैनल छवि के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें और ca. 410$535 एनएम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य. LD540 डाई के लिए 540 एनएम (543 एनएम इष्टतम है) पर एक उत्तेजना लेजर का चयन करें और 545 डिग्री 700 एनएम करने के लिए उत्सर्जन फिल्टर सेट.
        नोट: इस प्रोटोकॉल में, एक सफेद प्रकाश लेजर के साथ एक लेजर स्कैनिंग confocal प्रणाली, acousto-ऑप्टिकल बीम विभाजक (AOBS), 10x/ यह विशिष्ट तरंगदैर्ध्य के लिए सटीक ट्यूनिंग के लिए अनुमति देता है. यदि एक तुलनीय प्रणाली उपलब्ध नहीं है, लेजर लाइनों और लघु / पूरे organoid इमेजिंग के लिए, 512 x 512 या 1024 x 1024 का एक संकल्प बहाव छवि विश्लेषण के लिए पर्याप्त है.
      3. पर्याप्त z-अक्ष रिज़ॉल्यूशन के लिए पिनहोल आकार को 1 हवादार इकाई (AU) पर सेट करें.
      4. एक गोलाकार organoid के एक आधे छवि के लिए, लगभग 85 डिग्री उ करने के लिए एक z-स्टैक सेट करें।
    3. छवि विश्लेषण
      नोट: छवि विश्लेषण के लिए, फिजी/ विश्लेषण किसी भी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज जो अधिकतम प्रक्षेपण के लिए अनुमति देता है के साथ किया जा सकता है, मैनुअल दहलीज, और कण विश्लेषण.
      1. फिजी/ImageJ का उपयोग करना, प्रत्येक organoid के z-स्टैक को अधिकतम प्रक्षेपण में रूपांतरित करें: Image | ढेर ] $ परियोजना|
      2. अधिकतम प्रक्षेपण की सीमा को उस स्तर पर सेट करें जिसमें बीएसए वाहन नियंत्रण नमूने में कोई LD540 संकेत दिखाई नहीं देता है: छवि | समायोजित करें ] थ्रेशहोल्ड| प्रत्येक छवि को थ्रेशोल्ड करने के लिए इन सेटिंग्स का उपयोग करें.
      3. फ़ंक्शन विश्लेषण का उपयोग करके प्रत्येक अधिकतम प्रक्षेपण के लिए फ्लोरोसेंट के कुल क्षेत्र को मापें | कणों का विश्लेषण करें|
        नोट: हालांकि परख संकल्प बेहतर एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहा है, इस परख भी इसी तरह के फिल्टर के साथ एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है. organoid गिनती के लिए अच्छी तरह से सामान्य करने के लिए, LD540 संकेत DAPI संकेत से विभाजित किया जाना चाहिए. अंत में, बीएसए वाहन नियंत्रण के संकेत माप सामान्य करने के लिए घटाया जाना चाहिए. इस दृष्टिकोण परख एक 96 अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप की ओर बढ़ाया जा करने के लिए अनुमति देता है.
  3. एलडीएफ प्रवाह साइटोमेट्रिक परख
    1. नमूना तैयारी
      1. धारा 2.1 में वर्णित के रूप में मार्ग organoids. एक 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली में organoid व्युत्पन्न एकल कोशिकाओं बीज. प्रति स्थिति दो कुओं प्रवाह साइटोमेट्री के लिए पर्याप्त है.
      2. एचएसआई-ईएम पर संस्कृति के 10 दिन, एचएसआई-ईएम युक्त 1 एम एम ओए-बीएसए संयुग्मी के साथ संस्कृति माध्यम की जगह।
        नोट: confocal विश्लेषण के साथ इसके विपरीत, EM में विकास के 10 दिनों के बजाय प्रवाह साइटोमेट्री परख के लिए चुना गया था 6 दिनों. विस्तार के अतिरिक्त 4 दिनों के परिणामस्वरूप ऑप्टिकली ओवरलैपिंग organoids जो माइक्रोस्कोपी आधारित परख को जटिल बना देगा। हालांकि, कोशिकाओं की अधिक से अधिक संख्या प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण की सुविधा.
      3. कोशिकाओं को 16 डिग्री 17 ज (रात में) की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर या 0ण्1 डिग्री डीजीएटी1 अवरोधक की अनुपस्थिति में इनक्यूबेट करें। 2.5 एम एम बीएसए के एक वाहन नियंत्रण शामिल करें।
      4. 16 डिग्री 17 ज के बाद, organoids इकट्ठा के रूप में अनुभाग 2.1.2 में वर्णित है.
      5. organoids खंड 2.1.3 में वर्णित के रूप में एकल कोशिकाओं में विघटित.
        नोट: हालांकि सख्ती से आवश्यक नहीं है, यह प्रत्येक नमूने में कक्ष गिनती की जाँच करने के लिए सिफारिश की है. प्रति नमूना 10,000 कोशिकाओं की कुल गिनती पर्याप्त समाधान के लिए आवश्यक पूर्ण न्यूनतम है. इष्टतम परिणामों के लिए ca. 50,000$100,000 कोशिकाओं का उपयोग करें।
      6. 15 डिग्री 20 एस के लिए एक मिनी टेबलटॉप अपकेंद्रण में कोशिकाओं को नीचे स्पिन।
      7. 0.025 mg/mL LD540 के 500 $L और PBS में 1$g/एमएल Hoechst के साथ प्रत्येक नमूने को अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए दाग।
      8. 15 डिग्री 20 एस के लिए एक मिनी टेबलटॉप अपकेंद्रण में कोशिकाओं को स्पिन और पीबीएस के साथ 3x धो लें।
      9. कक्ष के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% तटस्थ बफर फार्मेडिहाइड के 500 डिग्री एल में उन्हें resssinssinate कोशिकाओं.
      10. कोशिकाओं को नीचे स्पिन और FACS बफर के साथ 3x धोने.
      11. ट्यूब दीवार से चिपके हुए कोशिकाओं को रोकने के लिए FACS बफर के साथ पूर्व-रस्से FACS ट्यूब।
      12. एफएसीएस बफर के 200 डिग्री एल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और सेल निलंबन को पूर्व-रिस्किड एफएसीएस ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    2. प्रवाह साइटोमीटरी विश् लेषण
      1. मृत कोशिकाओं और कोशिकाओं के clumps को बाहर करने के लिए gating पैरामीटर सेट (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें).
      2. अंतिम गेट आबादी में, विश्वसनीय परिणामों के लिए कम से कम 10,000 कोशिकाओं को मापने.
        नोट: इस जनसंख्या से, LD540 का मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता (MFI) और मतलब एसएससी-एक संकेत एक साथ सेल प्रति एलडी गठन की कुल मात्रा का एक उपाय प्रदान करते हैं.

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Representative Results

एलडी गठन के उचित विश्लेषण के लिए, organoids भी घने OA और बाद में धुंधला के साथ उत्तेजना से पहले बीज नहीं होना चाहिए. यह confocal और प्लेट रीडर readout के लिए विशेष रूप से महत्व का है, के बाद से ओवरलैपिंग organoids फ्लोरोसेंट के साथ हस्तक्षेप हो सकता है. उचित अंगाभ बीज घनत्व का एक उदाहरण (चित्र 1क) और अतिव्यापन वाले अंगभनों वाली संस्कृति (चित्र 1ठ) दिखाई देती है । OA के साथ नमूना उत्तेजना में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, organoid आकार और बोने घनत्व एक प्रयोग के भीतर नमूने के बीच तुलनीय होना चाहिए. यह सबसे अच्छा एकल कोशिकाओं की एक समान संख्या बाहर बोने के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. हालांकि, कुछ समायोजन आवश्यक हो सकता है अगर कुछ organoid लाइनों लगातार एक उच्च पुनर्गठन दक्षता दिखाने के लिए और इस तरह एक लगातार उच्च organoid गिनती.

1 एम एम OA रात भर के साथ उत्तेजना के बाद, एलडी गठन एक उलटा चमकीले क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ कल्पना की जा सकती है. एल.डी. का संचय संचारित प्रकाश को तितर-बितर कर देता है, और इसलिए ऑर्गनॉइड गहरा दिखाई देते हैं, जबकि गैर-उत्तेजित organoids में एक पारदर्शी रूप होता है (चित्र 1ग)। एक चमकीले सूक्ष्मदर्शी के नीचे दर्शाए गए एल डी गठन का एक उदाहरण चित्र 1डमें दिखाया गया है। इस घटना फ्लोरोसेंट परख readout से पहले प्रयोगात्मक स्थितियों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जब सकारात्मक नियंत्रण नमूना नकारात्मक नियंत्रण नमूने की तुलना में नेत्रहीन गहरा नहीं है, या जब व्यापक सेल मौत स्पष्ट है, प्रयोग खारिज कर दिया जाना चाहिए. के रूप में FFAs उच्च सांद्रता में कोशिकाओं के लिए विषाक्त कर रहे हैं, और घातक एकाग्रता FFAs की प्रजातियों के बीच अलग है, इष्टतम sublethal एकाग्रता है कि LD गठन लाती प्रत्येक आवेदन के लिए titrated किया जाना चाहिए.

एक बार OA उत्तेजित organoids तय कर रहे हैं और प्रोटोकॉल के अनुसार दाग, LDF एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कल्पना की जा सकती है. के रूप में organoids 3 डी संरचनाओं रहे हैं, एक नियमित रूप से epifluorescent माइक्रोस्कोप बाहर के फोकस पृष्ठभूमि संकेत के कारण उपयुक्त नहीं है. इसलिए, हमने organoids में LDF की विशेषता के लिए एक (अधिकतम प्रक्षेपण) confocal z-स्टैक का उपयोग किया। चित्र ााा े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े हालांकि इन छवियों के परिमाण कठिन है, confocal विश्लेषण असामान्य LD गठन के लिए जाँच करने के लिए एक दृश्य उपकरण के रूप में मुख्य रूप से कार्य करता है. confocal माइक्रोस्कोपी नमूनों की मात्रा भी एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है (चित्र 2बी),फ्लोरोसेंट Hoechst संकेत करने के लिए सामान्यीकृत. प्लेट रीडर परख untreated organoids की तुलना में DGAT1 अवरोध करनेवाला (D1i) के साथ इलाज organoids कोशिकाओं में LD540 संकेत में एक महत्वपूर्ण कमी इंगित करता है.

अलग-अलग कोशिकाओं में एलडी गठन का परिमाण प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। अलग-अलग मानव आंत्र अंगों के लिए प्रयुक्त गेटिंग कार्यनीति चित्र 3कमें दर्शायागया है . FSC-A/SSC-A प्लॉट में गेटिंग का पहला चरण 'लाइव' (जब तय हो जाता है), एकल कोशिकाओं का पहला चयन है। डबलेट, ट्राइलेट, या बड़े सेल क्लंप्स को और बाहर करने के लिए, हमने FSC-W/FSC-H और एसएससी-डब्ल्यू/एसएससी-एच पर दो अतिरिक्त गैटिंग चरण शामिल किए हैं। अंत में, FSC-A/Hoechst पर gating किसी भी कोशिकाओं है कि मर गया या निर्धारण से पहले मर रहे थे के बहिष्कार सुनिश्चित करता है. चित्र 3बी, सी एसएससी-ए और अंतिम लाइव सेल आबादी के LD540 संकेत दोनों के हिस्टोग्राम से पता चलता है। एलडीएफ के परिणामस्वरूप इंट्रासेल्यूलर लिपिड बूंदों के गठन के कारण एसएससी-ए में वृद्धि होगी। इसके अलावा, लिपिड कि LDs में जमा हो जाती है और इस संकेत के लिए LD540 दाग भी LDF प्रेरण पर वृद्धि होगी. इस प्रकार, एल डी गठन को एसएससी-ए और एलडी540 दोनों के एमएफआई में बदलाव के रूप में मापा जाता है (चित्र 3डी, ई)। MFI प्लॉट किया जा सकता है और सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया.

Figure 1
चित्रा 1: ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा गया है। (ए, बी) confocal और फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर तरीकों के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि organoids BMM छोटी बूंद में बहुत अधिक घनत्व में बीज नहीं कर रहे हैं. (ए) ऑर्गेनोइड्स को 250 कोशिकाओं/जेडएल के उचित घनत्व में बीजित किया जाता है (बी) आर्गेनोइड बहुत अधिक घनत्व में बीजित होते हैं, जिससे ऑर्गेनोइड्स तथा कोशिका मृत्यु का अतिव्यापन होता है। (सी, डी) OA के साथ रात भर उत्तेजना के बाद, LD गठन नेत्रहीन मूल्यांकन किया जा सकता है. (सी) 12% बीएसए वाहन नियंत्रण के साथ रात भर organoids incubated थे. (डी) ऑर्गेनोइड्स को रात भर 1 एमएम ओए के साथ बीएसए को शामिल किया गया, जिसके परिणामस्वरूप एक अंधेरा रूप दिखाई दिया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: confocal इमेजिंग और एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर का उपयोग करके LDF लक्षणीकरण के प्रतिनिधि परिणाम. स्वस्थ नियंत्रण व्युत्पन्न-organoids बीएसए के साथ रात भर प्रेरित किया गया, 1 mM OA, या 1 mM OA + D1i. (क)डीएपीआई (सियान) और LD540 (पीला) के लिए 85 डिग्री मीटर confocal ढेर का अधिकतम प्रक्षेपण। इस उपआकृतिक वैन Rizn एट अल से अनुकूलितहै. (बी)एलडी 540 की सापेक्ष फ्लोरोसेंट तीव्रता को फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर का उपयोग करके मापे गए परमाणु डीएपीआई संकेत के लिए सामान्यीकृत किया गया है। मतलब - एसडी दो जैविक प्रतिकृति के लिए साजिश रची है. सांख्यिकीय महत्व एक तरह से एक Tukey के बाद-हॉक के साथ दोहराया उपायों के बिना एक तरह से ANOVA का उपयोग कर निर्धारित किया गया था. *, पी एंड एलटी; 0.05. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके एलडीएफ परिमाणीकरण के प्रतिनिधि परिणाम। स्वस्थ नियंत्रण व्युत्पन्न-organoids बीएसए के साथ रात भर प्रेरित किया गया, 1 mM OA, या 1 mM OA + D1i. (क)organoid व्युत्पन्न एकल कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए गैटिंग रणनीति. बाएं से दाएं, पहले FSC-A/SSC-A के लिए gating द्वारा मलबे को बाहर। फिर FSC-W/FSC-H और SSC-W/SSC-H पर गेट डबलेट, त्रिफला, या कोशिकाओं के बड़े clumps को बाहर करने के लिए। अंत में, लाइव कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए FSC-A/Hoechst के लिए गेट। दोनों एसएससी-ए और LD540 चैनलों LD गठन की मात्रा के लिए उपयोग किया जाता है. इन पैरामीटरों के हिस्टोग्राम (बी) एसएससी-ए और (सी) एलडी540 के मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता (एमएफआई) में बदलाव दिखाते हैं। (डी, ई) प्रति नमूना MFI एक ग्राफ में प्लॉट किया जा सकता है और सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया. मतलब - एसडी तीन जैविक प्रतिकृति के लिए साजिश रची है. सांख्यिकीय महत्व एक तरह से एक Tukey के बाद-हॉक के साथ दोहराया उपायों के बिना एक तरह से ANOVA का उपयोग कर निर्धारित किया गया था. *, पी एंड एलटी; 0.05; *, पी एंड टी एल; 0.01; , पी एंड टी एल टी; 0.001. यह आंकड़ा वैन रिजन एट अल से अनुकूलितहै। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

रासायनिक विलायक स्टॉक एकाग्रता अंतिम एकाग्रता
Wnt3a मुख्यमंत्री - 100% 50%
आर-स्पोडिन-1 मुख्यमंत्री - 100% 20%
नोगिन मुख्यमंत्री - 100% 10%
A83-01 (TGF]-inh) डीएमएसओ 50mm 500 एनएम
बी 27 - 50x 1x
एमईजीएफ पीबीएस/0.1% बीएसए 500 ग्राम/ 50 एनजी/
एन-ऐसीटिल पानी 500 एमएम 1.25 एम.एम.
निकोटिनामाइड Pbs 1 एम 10 एमएम
प्रिमोसिन
(जब तक एमसीबी फ्रीजर में है का उपयोग करें)		 - 50 मिलीग्राम/एमएल 100 ग्राम/
SB202190 (P38 inh) डीएमएसओ 30 एमएम 10 डिग्री मी.

पूरक तालिका 1: organoid विस्तार माध्यम के लिए पकाने की विधि.

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Discussion

यहाँ, हम oleic एसिड के साथ ऊष्मायन पर मानव आंतों organoids में एलडी गठन निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इस विधि LD-विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाई LD54018पर आधारित है, जो एक organoid संस्कृति के भीतर लिपिड बूंदों की कुल मात्रा के लक्षण और परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है. मानव आंत्र अंगभन संस्कृतियों की स्थापना और उसे बनाए रखने कीप्रक्रियाएं 13से पहले प्रकाशित की जा चुकी हैं और इस प्रोटोकॉल का एक दृश्य गाइडभीउपलब्ध है .

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम मानव आंतों organoids की संस्कृति, और बीएसए के लिए OA के उचित संयोजन कर रहे हैं. organoids की संस्कृति संस्कृति माध्यम का एक सही निर्माण की आवश्यकता है, के रूप में एक स्टेम सेल आबादी के रखरखाव कार्यात्मक Wnt3A-सीएम पर अत्यधिक निर्भर है. Wnt3A-CM घर में किया जाता है, जब हम एक उच्च मानकीकृत कार्यप्रवाह और के बारे में 2 महीने की समाप्ति समय के कारण वातानुकूलित माध्यम के मासिक उत्पादन की सलाह देते हैं। इसके अलावा, 1:1 लगातार Wnt3A-सीएम बैचों के मिश्रण एक और अधिक निरंतर दीर्घकालिक संस्कृति में परिणाम, के रूप में यह सुनिश्चित करता है कि एक थोड़ा उप इष्टतम बैच organoid विकास पर एक बड़ा प्रभाव नहीं होगा.

इसके अलावा, हमारे बी एम उन्नत DMEM/F12 माध्यम है, जो लिपिड अमीर बीएसए शामिल हैं के होते हैं. चूंकि हमारे वाहन नियंत्रण (12% बीएसए/बीएम) organoids में एलडी गठन प्रेरित नहीं करता है, हम निष्कर्ष है कि राशि या बीएम में एफएफए के प्रकार LDF परख को प्रभावित करने के लिए पर्याप्त नहीं है.

बीएसए के लिए OA के संयोजन एक नाजुक प्रक्रिया है जो कुछ अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. हमने अनुभव किया है कि प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित सबसे इष्टतम है जब सभी तापमान परिवर्तन सावधानी से पालन कर रहे हैं और जब कांच प्रयोगशाला का उपयोग कर प्रदर्शन किया.

पिछले शोध में, एलडी गठन परख का उपयोग एल डी आकार और संख्या को उच्च आवर्धन8,12के साथ पहचानने के लिए किया गया है . ये परख ज्यादातर बोरोन-डिपिरोमेथीन (BODIPY) 493/503 का उपयोग करके किया गया, जो उच्च संकेत-से-शोर अनुपात के साथ एलडी के लिए एक उत्कृष्ट धुंधला प्रदान करता है। हालांकि, BODIPY के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम काफी व्यापक है, और मोटे तौर पर हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्युत्पन्न रंगों के फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रम के साथ ओवरलैप. हालांकि हम उम्मीद करते हैं कि LDF परख के वर्तमान आवेदन के रूप में अच्छी तरह से BODIPY के साथ काम करेंगे, LD540 के लिए चुनाव बहुरंगा छवियों की एक व्यापक रेंज के लिए अनुमति देता है, GFP लेबल के साथ सह दाग सहित18. हम भी लिपिड दाग नील लाल (डेटा नहीं दिखाया) का उपयोग कर इस परख प्रदर्शन किया है. हालांकि, के बाद से नील लाल न केवल LDs लेकिन यह भी लिपिड bilayers दाग जाता है, हमने पाया कि नील लाल की उच्च पृष्ठभूमि संकेत हमारे परख की क्षमता को कम करने के लिए LD गठन के छोटे मतभेदभेद. इन कारणों के लिए, हम एक organoid आधारित LDF परख में LD540 का उपयोग करना पसंद करते हैं.

उच्च आवर्धन LDF assays का उपयोग कर पहले के अध्ययनों की तुलना में, परख हम यहाँ का वर्णन कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी में कुल एलडी मात्रा के उच्च throughput परिमाणके लिए अनुमति देता है. इसलिए, विशेष रूप से फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर परिमाणीकरण, और संभावित प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण, एलडी गठन पर दवाओं के प्रभाव के परीक्षण के लिए बढ़ाया जा सकता है. जैसा कि हमने दिखाया है कि एलडी गठन काफी हद तक DGAT1 निर्भर है, DGAT1 कमी रोगी व्युत्पन्न या D1i इलाज organoids इस तरह के एक स्क्रीनिंग के आवेदन के लिए एक स्पष्ट अवसर का प्रतिनिधित्व करते हैं. विशेष रूप से इस तरह के दुर्लभ होने वाली बीमारियों के लिए, LDF परख रोगी व्युत्पन्न organoids के साथ संयुक्त नई चिकित्सीय दवाओं के लिए रोगी विशेष स्क्रीनिंग के लिए एक मंच प्रदान कर सकता है.

हालांकि, एक उच्च throughput दृष्टिकोण का एक परिणाम यह है कि व्यक्तिगत LDs की विशेषता की शक्ति खो दिया है. जबकि उच्च आवर्धक इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म या एलडी के फ्लोरोसेंट दृश्य लदी आकार और संख्या12में गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ,19,उच्च throughput दृष्टिकोण कई छोटे या कम के बीच अंतर नहीं करता है बड़े LDs और इसलिए एलडी चयापचय जहां LDs की कुल मात्रा के लिए स्थिर रहता है में मतभेदों को मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है. इसलिए, अनुप्रयोगों में जहां संख्या या LDs के आकार के लिए ब्याज की होने का संदेह है, यह एक कम throughput, उच्च आवर्धन तकनीक के साथ संबोधित किया जाना चाहिए. इसके अलावा, वर्तमान परख में organoids basolateral लिपिड उत्तेजना प्राप्त करते हैं, जबकि आहार लिपिड आम तौर पर शीर्ष झिल्ली पर लिया जाता है. इसलिए कुछ सावधानी की आवश्यकता है अगर परिणाम शारीरिक स्थिति के लिए अनुवाद किया जा करने के लिए कर रहे हैं.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम उदारता से LD540 प्रदान करने के लिए बी Spee धन्यवाद. यह काम वैज्ञानिक अनुसंधान अनुदान के लिए एक नीदरलैंड संगठन द्वारा समर्थित किया गया था (NWO-zonMW; VIDI 016.146.353) से एस.एम.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-028
B27 supplement  Gibco 17504-044
Basement membrane matrix (matrigel) BD Biosciences 356231
DAPI Sigma-Aldrich D9542-1MG
DGAT1 inhibitor (AZD 3988) Tocris Bioscience 4837/10
Fatty acid free BSA Sigma-Aldrich A7030
Formaldehyde Klinipath 4078-9001
Glutamin (GlutaMAX, 100x) Gibco 15630-056
HEPES (1 M) Gibco 15630-080
Laser scanning confocal microscope Leica SP8X
LD540 kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University
mEGF Peprotech 315-09_500ug
N-acetyl cysteine Sigma-Aldrich A9165-100G
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636-500G
Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Oleic acid Sigma-Aldrich O1008-5G
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) Sigma-Aldrich S7067-25MG
PBS Sigma-Aldrich D8662-500ML
PBS without Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537-500ML
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) Gibco 15070-063
R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) R&D systems 3710-001-01
TC-treated 24 well plates Greiner-One 662160
TC-treated black clear-bottom 96 well plates Corning Life Sciences 353219
TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)  Tocris Bioscience 2939/10
Trypsin (TrypLE Express) Life Technologies 12604021
WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) Abcam ab120129-10

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References

  1. Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
  2. Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
  3. D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
  4. Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
  5. Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
  6. van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
  7. Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
  8. Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
  9. Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
  10. Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
  11. Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
  12. Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
  13. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  14. Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
  15. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  18. Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
  19. Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).

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चिकित्सा अंक 152 मानव आंतों organoids प्राथमिक कोशिका संस्कृति बायोप्सी लिपिड बूंदों DGAT1 confocal माइक्रोस्कोपी
मानव आंत्र organoids में लिपिड ड्रॉपलेट गठन की विशेषता और परिमाणीकरण के लिए एक फ्लोरोसेंट आधारित परख
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van Rijn, J. M., van Hoesel, M.,… More

van Rijn, J. M., van Hoesel, M., Middendorp, S. A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60150, doi:10.3791/60150 (2019).

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