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Medicine

Um ensaio à base de fluorescência para caracterização e quantificação da formação de gotas lipídicas em organóides intestinais humanos

Published: October 13, 2019 doi: 10.3791/60150
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Division of Pediatrics, Department of Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 2Regenerative Medicine Center, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 3Science for Life Laboratory, Department of Medical Biochemistry and Microbiology, Uppsala University

Summary

Este protocolo descreve um ensaio para a caracterização da formação do gota do lipido (LD) em organóides intestinais humanos em cima da estimulação com ácidos gordos. Nós discutimos como este ensaio é usado para a quantificação da formação do LD, e como pode ser usado para a seleção elevada da taxa de transferência para as drogas que afetam a formação do LD.

Abstract

Os lipídios dietéticos são tomados como ácidos graxos livres (FAs) pelo epitélio intestinal. Estes FAS são convertidos intracelularmente em moléculas do triglicérides (TG), antes que estejam empacotados em quilomícrons para o transporte à linfa ou em gotas de lipido citosólico (LDS) para o armazenamento intracelular. Um passo crucial para a formação de LDs é a atividade catalítica das aciltransferases de diacilglicerol (DGAT) na etapa final da síntese de TG. Os LDs são importantes para a reserva de espécies lipídicas tóxicas e regulam o metabolismo celular em diferentes tipos de células. Uma vez que o epitélio intestinal humano é regularmente confrontado com altas concentrações de lipídios, a formação de LD é de grande importância para regular a homeostase. Aqui nós descrevemos um ensaio simples para a caracterização e a quantificação da formação do LD (LDF) em cima da estimulação com o ácido gordo insaturado o mais comum, ácido oleico, em organoids intestinais humanos. O ensaio LDF é baseado no corante fluorescente específico LD LD540, que permite a quantificação de LDs por microscopia confocal, leitor de placas fluorescentes ou citometria de fluxo. O ensaio de LDF pode ser usado para caracterizar a formação do LD em pilhas epithelial intestinais humanas, ou para estudar as desordens humanas (genéticas) que afetam o metabolismo do LD, tal como a deficiência DGAT1. Além disso, este ensaio pode igualmente ser usado em um encanamento da elevado-produção para testar os compostos terapêuticos novos, que restauram defeitos na formação do LD em intestinal ou em outros tipos de organoids.

Introduction

Os lipídios são um componente crucial da dieta humana e desempenham um papel importante no armazenamento de energia sistêmica e metabolismo. Quando ingeridos, os lipídios dietéticos são degradados em ácidos graxos livres (FFAs) e monoglicerídeos (MGs) por lipases pancreáticos. Estes substratos são então tomados pelos enterócitos do epitélio intestinal, onde são primeiro re-esterificados a diglicerídeos (DG) por monoglicerídeos aciltransferases (MGAT) enzimas e, posteriormente, a triglicérides (TG) por diacilglicerol aciltransferase 1 (DGAT1)1. Finalmente, estes TGS são integrados em ambos os quilomícrons para a exportação ao sistema de linfa ou às gotas de lipido citosólico (LDS) para o armazenamento intracelular2,3. Embora os quilomícrons sejam necessários distribuir lipídios dietéticos a outros órgãos, a importância do armazenamento gordo intracelular nos LDS não é completamente desobstruída. No entanto, os LDs têm sido mostrados para executar uma função reguladora no intestino, como eles lentamente liberar lipídios na circulação até 16 h após uma refeição4. Além disso, os LDS foram mostrados para proteger de encontro às concentrações tóxicas do ácido gordo, como em adipócitos do rato durante circunstâncias lipolítica5.

A proteína DGAT1 está localizada na membrana do retículo endoplasmático (er) e desempenha um papel crucial na formação de LD no epitélio intestinal. As mutações homozygous em DGAT1 conduzem à diarreia severa do cedo-início e/ou vomiting, hypoalbuminemia, e/ou (fatal) enteropatia proteína-perdedor com falha intestinal em cima da entrada gorda, ilustrando a importância de DGAT1 na homeostase do lipido do ser humano epitélio intestinal6,7,8,9,10. Desde que a ocorrência da deficiência DGAT1 nos seres humanos é rara, o acesso às pilhas paciente-derivadas preliminares foi escasso. Além disso, a cultura a longo prazo de pilhas epithelial intestinais tem sido restringida por muito tempo às linhas de pilha tumor-derivadas que representam a fisiologia normal somente a uma extensão limitada. Conseqüentemente, a formação DGAT1-negociada do LD tem sido estudada na maior parte nos fibroblastoou nas linhasde pilha animal-derivadas7,10,11,12. Como tal, mostrou-se recentemente que os fibroblastos pacientes-derivados DGAT1-deficientes acumulam menos LDs comparados às pilhas de controle saudáveis após a estimulação com ácido oleico (OA)8.

Previamente, os protocolos foram estabelecidos às pilhas de haste epithelial da cultura de todo o órgão gastrintestinal a forma dos organóides tridimensionais (3D)13. Estes organóides intestinais podem ser mantidos na cultura por um longo período de tempo13, e permitem o estudo funcional de características epithelial local-específicas paciente-e intestinal14. Eles são geneticamente e fenotipicamente estáveis e podem ser armazenados, permitindo a expansão a longo prazo e para13.

Nós demonstramos recentemente que a formação do LD pode prontamente ser medida em organóides intestinais humanos em um ensaio da formação LD (ldf)6. Quando expostos à OA por 16 h, os organóides geram LDs para proteger as células da toxicidade induzida por lipídios. Quando as concentrações de OA são muito elevadas, as células morrem por apoptose mediada por caspase6. O ensaio de ldf foi mostrado previamente para ser pela maior parte dependente em DGAT1 como indicado por organóides derivados dos pacientes do DGAT1-mutante e pelo uso de inibidores DGAT1-specific6.

Para o ensaio LDF descrito detalhadamente aqui, os organóides 3D são cultivados a partir de biópsias intestinais e são passados semanalmente por rompimento em células únicas que formam facilmente novos organóides. Para executar o ensaio LDF, ~ 7.500 células únicas derivadas de organóides são chapeadas em cada poço de uma placa de 24 poços. Organóides são formados ao longo de vários dias, incubadas durante a noite com 1 mM OA e corados com LD540, um corante fluorescente de células permeável LD-específico que facilita a imagem. A formação de LD é então quantificada por microscopia confocal, leitora de placas fluorescentes ou citometria de fluxo.

Ao dimensionar este ensaio de formação de LD para um formato 96-well, o ensaio também pode ser utilizado para a análise de alta taxa de transferência de formação de LD para a tela para novas drogas que afetam a formação de LD em culturas organóides intestinais humanas, ou para estudar (genética humana) distúrbios que afetam Metabolismo de LD.

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Protocol

Toda experimentação usando tecidos humanos aqui descritos foi aprovada pelo Comitê de ética do University Medical Center Utrecht (UMUC). O consentimento informado para coleta, geração, armazenamento e uso dos organoides foi obtido em pacientes do hospital infantil Wilhelmina (WKZ)-UMUC.

1. preparação dos meios de cultura

Nota: Este protocolo deve ser realizado dentro de um gabinete de biossegurança. Os organóides devem ser manuseados de acordo com as diretrizes da cultura celular padrão.

  1. Prepare o meio de cultura basal.
    Nota:     o meio de cultura sem fatores de crescimento é referido como meio basal (BM).
    1. Adicionar 5 mL de HEPES (1 M), 5 mL de L-glutamina (100x) e 5 mL de penicilina-estreptomicina (5.000 U/mL) a 500 mL de avançado Dulbecco ' s modificado Eagle médio com presunto ' s nutriente mistura F-12 para preparar BM médio.
    2. Conservar o meio de BM preparado a 4 ° c e utilizar durante um máximo de 2 meses.
  2. Prepare R-spondin e Noggin meio condicionado (CM) de acordo com o protocolo do fabricante.
    1. Brevemente, cresça acima as pilhas à quantidade desejada nos hyperflasks com 5 x 107 pilhas no meio de 555 ml sem o antibiótico seletivo por o frasco.
    2. Cresça as células por 4 dias até confluente.
    3. Substitua o meio com BM e cultura por 8 dias adicionais.
    4. Após 8 dias da cultura em 37 ° c, colete o meio de cultura e Centrifugue por 5 minutos em 450 x g para pellet todas as pilhas restantes.
    5. O filtro Esteriliza o sobrenadante e armazena alíquotas do R-spondin ou Noggin CM a-20 ° c durante um período máximo de 6 meses.
  3. Prepare Wnt3A CM de acordo com BOJ et al.15.
    1. Brevemente, cresça as células para a quantidade desejada em pratos de 145 mm com 2 x 106 células em meio de 20 ml sem antibiótico seletivo por prato. Enrole cada prato com folha plástica para evitar a evaporação do meio de cultura.
    2. Após 8 dias da cultura em 37 ° c, colete o meio de cultura e Centrifugue por 5 minutos em 450 x g para pellet todas as pilhas restantes.
    3. O filtro esterilizar o sobrenadante, e armazena alíquotas do Wnt3A-cm em 4 ° c por um máximo de 2 meses.
  4. Prepare o meio de expansão organóide.
    Nota:     meio de expansão organóide intestinal pequeno humano (ver receita na tabela suplementar 1) é referido como Hsi-em. As etapas a seguir produzirão um volume final de 1 L hSI-EM e podem ser dimensionadas para cima ou para baixo conforme necessário.
    1. Dissolver 1,46 g de nicotinamida em 12 mL de soro-tampão de fosfato (PBS) de grau de cultura celular para criar uma diluição final de 1 M.
    2. Dissolva 245 mg de n-acetil cisteína em 3 mL de PBS de grau de cultura celular para criar uma diluição final de 500 mM.
      Nota: Para acelerar a formação de uma solução, a nicotinamida e a n-acetil cisteína podem ser incubadas num banho de água a 37 ° c. Ambas as soluções podem ser preparadas em lote, aliquotadas e armazenadas a-20 ° c para uso futuro.
    3. O filtro esteriliza ambas as soluções através de um filtro de 0,22 μm em um tubo estéril de 15 mL.
    4. Adicionar 167 mL de BM a um balão de meio de cultura estéril de 500 mL. Adicionar 200 mL de R-Spondin-CM, 100 mL de Noggin-CM e 100 μL de mEGF recombinante (500 μg/mL) a uma concentração final de 50 ng/mL.
    5. Adicionar 10 mL da solução de nicotinamida esterilizada e 2,5 mL da solução de n-acetil cisteína esterilizada. Adicione 20 mL de suplemento B27 (50x).
      Nota: Nesta fase, o meio é referido como hSI-EM sem WAS (Wnt3A-CM, A83-01 e SB202190), podendo ser aliquotados e armazenados a-20 ° c. Se o meio é alicitado em volumes menores, ajuste as concentrações dos seguintes passos em conformidade.
    6. Para 500 mL de hSI-EM sem WAS, adicione 10 ml de Wnt3A CM do último lote preparado recentemente e 10 mL de Wnt3A CM do segundo último lote para minimizar as alterações de variabilidade em condições de Wnt3A CM.
    7. Adicionar A83-01 a uma concentração final de 500 nM, e SB202190 a uma concentração final de 10 μM.
    8. Armazene o hSI-EM preparado (com WAS) em 4 ° c e use-o por um máximo de 2 semanas.
      Nota: Adicione Y-27632 adicional a uma concentração final de 10 μM (referida como hSI-EM + Y) quando criptas ou células individuais são cultivadas ou organóides são iniciados a partir de criopreservação.
  5. Prepare o buffer de classificação de célula ativada fluorescente (FACS).
    1. Adicionar 10 mL de soro de bezerro fetal (FCS) a 40 mL de PBS sem CA2 +/mg2 + para uma concentração final de 10% FCS.
      Nota: O FCS impede que as células aderindo ao Labware.

2. procedimentos da cultura para Organoids intestinais pequenos humanos

Nota: Este protocolo deve ser realizado dentro de um gabinete de biossegurança. Os organóides devem ser manuseados de acordo com as diretrizes da cultura celular padrão. Ao manusear organóides ou células derivadas de organoides, as células devem ser mantidas no gelo sempre que possível. As células permanecerão viáveis por algumas horas após a colheita quando isso for assegurado. Os organóides devem ser cultivados em uma incubadora de cultura de células padrão a 37 ° c com 5% de CO2. Estas circunstâncias aplicam-se a todas as etapas da incubação com os organóides encaixados na matriz da membrana do porão (BMM; isto é, matrigel) durante todo este protocolo. Os autores utilizaram organóides derivados do duodeno para estes ensaios.

  1. Passaging organóides
    Nota    : Cada cultura organóide tem seu próprio tempo de duplicação. Normalmente, os organóides intestinais pequenos podem ser é 1:3 − 1:5 cada 7 − 10 dias. Quando é como únicas pilhas, a eficiência do de pode ser até 1:20, dependendo da densidade da pilha. Para o estabelecimento e a manutenção, os organóides são cultivados em 24 placas do poço; para o ensaio LDF, em placas de 24 ou 96 poços.
    1. Preparação
      1. Pré-quente descompactado 24-bem placas de cultura de tecido em uma incubadora em 37 ° c, 5% CO2 pelo menos durante a noite e de preferência 5 dias de antecedência.
        Nota: Pre-aquecendo as placas da cultura do tecido na incubadora da cultura da pilha assegura a formação apropriada e o acessório de gotas organoid-contendo de BMM.
      2. Para reduzir o número de ciclos de congelamento, prepare alíquotas de 1 mL de BMM e armazene a-20 ° c. Descongelar um frasco de BMM no gelo pelo menos 30 minutos antes de iniciar o procedimento de de organoide.
      3. Mantenha um tubo de 50 mL de BM no gelo como meio de lavagem.
      4. Prepare hSI-EM como descrito na seção 1,4, e prepare uma quantidade apropriada de hSI-EM + Y, por exemplo, 15 mL para uma placa completa de 24 poços.
    2. Colete organóides.
      1. Aspirar cuidadosamente o meio de cultura sem perturbar as gotículas de BMM.
      2. Adicione 500 μL de BM frio ao primeiro poço dos organóides, e interrompa as gotas de BMM com os organóides introduzindo com pipetas delicadamente acima e para baixo com um Pipet P1000.
      3. Repita este procedimento com o mesmo meio no poço seguinte como requerido, mas não colha mais de 2 poços por 500 μL de BM.
      4. Colete os organóides em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL de baixa ligação e gire para baixo em uma mini centrífuga de mesa para 15 − 20 s (máx. 2.000 x g). Aspirar o sobrenadante completamente e remover o último pedaço de meio com um P200 Pipet.
        Nota: Quando as culturas dos organóides olham limpas um microscópio e não contêm nenhumas pilhas inoperantes ou outros restos, as gotas de BMM podem ser colhidas diretamente no tripsina em vez do BM na etapa 2.1.2.2. Após a etapa 2.1.2.3, prossiga diretamente à incubação na etapa 2.1.3.1.
    3. Dissociar os organóides em células individuais.
      1. Adicionar 400 μL de tripsina aos organóides giradas para baixo. Incubar os organóides a 37 ° c por 5 min em um banho de água.
      2. Interrompa os agregados restantes das células pipetando para cima e para baixo suavemente com um P200 Pipet. Mais uma vez, incubar os organóides a 37 ° c por 5 min em um banho de água.
      3. Verific o progresso da dissociação da pilha um microscópio usando a ampliação 4x. Repita a interrupção manual e incubação quando grandes aglomerantes de células permanecem.
      4. Quando somente as únicas pilhas permanecem, adicione 1 mL do BM e gire para baixo as pilhas em um mini centrifugador do tabletop para 15 − 20 s.
      5. Aspirar o sobrenadante completamente. Resuspend as únicas pilhas em 200 μL de hSI-EM fresco usando um Pipet P200. Adicione um adicional de 800 μL de hSI-EM.
      6. Conte o número de células em suspensão.
        Nota: No laboratório dos autores, a contagem manual de células organóides dissociadas produz resultados mais confiáveis do que um contador automatizado de células. Quando um contador automatizado da pilha é usado, a densidade da pilha para aplicações a jusante deve ser testada em casa e ajustada se demasiado pouco ou muitos organóides crescem para fora.
    4. Organóides de sementes para a manutenção ou ensaio de formação de gotas lipídicas.
      1. Calcule o volume de células que é necessário para a densidade da célula final.
        Nota: Aproximadamente 250 células/μL é uma densidade apropriada. Em uma placa de 24 poços, 30 μL são semeados em cada poço, enquanto 5 μL são semeados em cada poço de uma placa de 96 poços.
      2. Tirar o volume apropriado de suspensão e ajustar a densidade para 750 células/μL (ou girar para baixo e ressuscite quando a densidade é muito baixa).
      3. Adicionar BMM para a suspensão da célula em uma proporção de 2:1. A densidade final da célula nesta mistura é de 250 células/μL. Misture suavemente a suspensão introduzindo pipetagem, evitando cuidadosamente quaisquer bolhas.
      4. Em uma placa de cultura de tecido pré-aquecido, semente para fora 3 10 μL de gotas por poço em uma placa de 24 poços ou uma única gota de 5 μL por poço em uma placa de 96 poços.
      5. Coloc a placa em uma incubadora em 37 ° c, 5% CO2 para 10 − 15 minutos para solidificar as gotas de BMM. Entrementes, Pre-aqueça uma quantidade apropriada de hSI-EM + Y em um banho de água em 37 ° c.
      6. Adicione cuidadosamente 500 μL de hSI-EM + Y pré-aquecido a cada poço de uma placa de 24 poços ou 100 μL a cada poço de uma placa de 96 poços. Incubar as células em uma incubadora a 37 ° c, 5% CO2 e após 2 − 3 dias mudam o meio para Hsi-em (sem Y) e refrescam 2 − 3 vezes por semana.
        Nota: Após 7 − 10 dias, uma cultura da manutenção dos organóides deve ser é outra vez.

3. ensaio de formação de gotas lipídicas

  1. Preparação do conjugado ácido oleico
    Nota:     uma vez que o ácido oleico (OA) é hidrofóbico e não solúvel em água, é conjugado com a albumina sérica bovina (BSA). BSA pode ligar múltiplas moléculas de ácidos graxos e é neste caso usado em uma proporção de 1:8 para tornar o ácido oleico acessível para as células intestinais. Os ácidos gordos livres e o BSA podem ambos ligar ao Labware plástico. Para assegurar uma concentração final apropriada, use frascos de vidro e pipetas de vidro sempre que possível.
    1. Pesar 0,2 g de ácido oleico líquido à temperatura ambiente. Adicione 1,5 mL de PBS estéril de grau de cultura e aqueça a mistura a 70 ° c por 1 h. Vortex intermitentemente.
    2. Pesar 5,89 g de ácido graxo-livre de BSA e dissolver em 33,9 mL de PBS. Aqueça a mistura em um banho de água a 37 ° c até que a BSA seja totalmente dissolvida.
    3. Vortex a mistura OA novamente para criar uma emulsão de gotículas finas e imediatamente adicioná-lo à solução de BSA usando um Pipet de vidro. Mantenha a solução final perto de 37 ° c depois de adicionar o OA. A mistura final consiste de 20 mM OA em 2,5 mM BSA.
    4. Manter a mistura a 37 ° c durante 30 min até restar uma solução límpida amarelada.
    5. O conjugado OA-BSA pode ser alicitado e congelado a-20 ° c durante pelo menos 6 meses. Após descongelar uma alíquota, incubar-a a 37 ° c até que a nebulosidade se dissolve e a mistura seja novamente limpa.
      Nota: Por causa do alto teor de proteínas e lipídios da solução final, a mistura não pode ser filtro esterilizado ou autoclavado. Quando os componentes foram manuseados com cuidado, em uma capa de fluxo laminar quando possível e usando PBS estéril, os autores não experimentaram infecções microbianas.
  2. Ensaio confocal LDF
    1. Preparação da amostra
      1. Organóides de passagem conforme descrito na seção 2,1. Semente para fora as únicas pilhas organoid-derivadas em uma placa preto do desobstruído-fundo 96-well.
      2. No dia 6 da cultura em hSI-EM, substitua o meio de cultura por hSI-EM contendo 1 mM de OA-BSA conjugada.
      3. Incubar as células por 16 − 17 h (durante a noite) a 37 ° c na presença ou ausência de inibidor de 0,1 μM DGAT1. Inclua um controle do veículo de 2,5 de milímetro BSA.
      4. Após 16 − 17 h, aspirar o meio sem perturbar as gotículas de BMM. Fixate os organóides adicionando 100 μL de formaldeído tamponado neutro de 4% aos poços por 30 min à temperatura ambiente.
        Nota: O formaldehyde dissolverá parcialmente o BMM, quando os organóides afundarem-se à parte inferior e aderir à parte inferior da placa.
      5. Retire o formaldeído suavemente e Lave cuidadosamente os poços com 150 μL de PBS por poço.
      6. Manchar as células para LDs com 0, 25 mg/mL LD540 e 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) em PBS por 15 min à temperatura ambiente no escuro.
      7. Lave os poços cuidadosamente com PBS.
        Nota: O protocolo pode ser pausado aqui quando necessário. Mantenha as amostras cobertas de PBS no escuro a 4 ° c. A coloração LD540 permanecerá estável por até uma semana. Este ensaio também pode ser realizado com células ao vivo, para monitorar a formação de LD durante um período de tempo. Para isto, a fixação tem que ser omitida do protocolo, e o DAPI deve ser substituído com mancha de Hoechst. LD540 pode manchar LDs em células vivas na mesma concentração como descrito.
    2. Imagem latente confocal
      Nota: A imagem latente pode ser executada em amostras organoid preparadas na placa preto do desobstruído-fundo 96-well.
      1. Para imagens da vista geral de organoids inteiros, use um objetivo 40x serido para a imagem latente fluorescente confocal.
      2. Ajuste o microscópio à imagem o canal DAPI na excitação de 405 nanômetro e no comprimento de onda da emissão do CA. 410 − 535 nanômetro. Para a tintura LD540 escolha um laser da excitação em 540 nanômetro (543 nanômetro é ótimo) e ajuste os filtros da emissão a 545 − 700 nanômetro.
        Nota: Neste protocolo, utilizou-se um sistema confocal de varredura a laser com laser de luz branca, divisor de feixe acousto-óptico (AOBS), objetivo de 10x/20x e sistema de detecção espectral. Isto permite o ajuste exato aos comprimentos de onda específicos. Se um sistema comparável não estiver disponível, escolha linhas de laser e filtros de curto/longo-passe próximos às especificações acima. Para a imagem latente Whole-organoid, uma definição de 512 x 512 ou de 1024 x de 1024 é suficiente para a análise de imagens a jusante.
      3. Ajuste o tamanho do furo de pino a 1 unidade arejada (AU) para a suficiente definição do eixo z.
      4. Para a imagem de uma metade de um organóide esférico, defina uma pilha z para aproximadamente 85 μm.
    3. Análise de imagem
      Nota: Para a análise de imagens, Fiji/ImageJ16,17 foi usado para gerar projeções máximas. A análise pode ser realizada com qualquer pacote de software de análise de imagem que permita a projeção máxima, a Thresholding manual e a análise de partículas.
      1. Usando Fiji/ImageJ, transforme a z-pilha de cada organoid a uma projeção máxima: imagem | Stacks | Z-projeto.
      2. Defina o limiar da projeção máxima para um nível em que não há sinal LD540 visível na amostra de controle do veículo BSA: Image | ADJUST | Limiar. Use essas configurações para limiar de cada imagem.
      3. Meça a área total da fluorescência para cada projeção máxima usando a função Analyze | Analise as partículas.
        Nota: Embora a resolução do ensaio seja melhor usando um microscópio confocal, este ensaio também pode ser analisado usando um leitor de placas fluorescentes com filtros semelhantes. Para normalizar para a contagem organoid por bem, o sinal LD540 deve ser dividido pelo sinal DAPI. Finalmente, o sinal do controle do veículo de BSA deve ser subtraído para normalizar as medidas. Esta aproximação permite que o ensaio seja escalado para um formato da placa do 96-well.
  3. Ensaio citométrico de fluxo LDF
    1. Preparação da amostra
      1. Organóides de passagem conforme descrito na seção 2,1. Semente para fora as únicas pilhas organoid-derivadas em uma placa da cultura do tecido 24-well. Dois poços por condição são suficientes para a citometria de fluxo.
      2. No dia 10 da cultura em hSI-EM, substitua o meio de cultura por hSI-EM contendo 1 mM de OA-BSA conjugada.
        Nota: Em contraste com a análise confocal, 10 dias de crescimento em em foram escolhidos para o ensaio de citometria de fluxo em vez de 6 dias. Os 4 dias extra da expansão conduzirão aos organóides opticamente de sobreposição que complicariam o ensaio microscopia-baseado. No entanto, o maior número de células facilita a análise da citometria de fluxo.
      3. Incubar as células por 16 − 17 h (durante a noite) a 37 ° c na presença ou ausência de inibidor de 0,1 μM DGAT1. Inclua um controle do veículo de 2,5 de milímetro BSA.
      4. Após 16 − 17 h, recolher os organóides como descrito na secção 2.1.2.
      5. Dissociar os organóides em células únicas, conforme descrito na seção 2.1.3.
        Nota: Embora não seja estritamente necessário, é recomendável verificar a contagem de células em cada amostra. Uma contagem total de 10.000 células por amostra é o mínimo absoluto necessário para resolução suficiente. Para obter resultados ideais, use ca. 50000 − 100000 células.
      6. Gire para baixo as pilhas em um mini centrifugador do tabletop para 15 − 20 s.
      7. Manchar cada amostra com 500 μL de 0, 25 mg/mL LD540 e 1 μg/mL Hoechst em PBS durante 15 min à temperatura ambiente no escuro.
      8. Gire para baixo as pilhas em um mini centrifugador do tabletop para 15 − 20 s e lave 3x com PBS.
      9. Fixar as células por ressusciá-los em 500 μL de 4% de formaldeído tamponado neutro por 15 min à temperatura ambiente.
      10. Gire para baixo as pilhas e lave 3x com tampão de FACS.
      11. Pré-enxague os tubos FACS com tampão FACS para evitar que as células aderem à parede do tubo.
      12. Suspender as células em 200 μL de tampão FACS e transferir a suspensão celular para os tubos FACS pré-enxaguados.
    2. Análise citométrica de fluxo
      1. Defina os parâmetros de gating para excluir células mortas e aglomerados de células (consulte a seção de resultados representativos).
      2. Na população final fechada, medir pelo menos 10.000 células para resultados confiáveis.
        Nota: A partir dessa população, a média da intensidade fluorescente (MFI) de LD540 e o sinal SSC-A médio em conjunto proporcionam uma medida do volume total de formação de LD por célula.

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Representative Results

Para a análise adequada da formação de LD, os organóides não devem ser semeados muito densamente antes da estimulação com OA e coloração subsequente. Isto é especial da importância para o readout confocal e do leitor da placa, desde que os organóides de sobreposição puderam interferir com a fluorescência. Um exemplo de densidade de semeadura organoide adequada (Figura 1a) e uma cultura com organóides sobrepostos é mostrada (Figura 1B). Para minimizar a variabilidade na estimulação da amostra com OA, o tamanho organoide e a densidade de semeadura devem ser comparáveis entre as amostras dentro de um experimento. Isso é melhor controlado por semeadura para fora um número igual de células individuais. Entretanto, alguns ajustes puderam ser necessários se determinadas linhas organoid mostram consistentemente uma eficiência mais elevada da reconstituição e assim uma contagem organoid consistentemente mais elevada.

Após a estimulação com 1 milímetro OA durante a noite, a formação do LD pode ser visualizada com um microscópio invertido do brightfield. O acúmulo de LDs espalha a luz transmitida e, portanto, os organóides aparecem mais escuros, enquanto os organóides não estimulados têm uma aparência translúcida (Figura 1C). Um exemplo da formação do LD como visto um microscópio do brightfield é mostrado em Figura 1D. Este fenômeno pode ser usado para avaliar as condições experimentais antes da leitura do ensaio fluorescente. Quando a amostra de controle positivo não é visualmente mais escura do que a amostra de controle negativo, ou quando a morte celular extensa é aparente, o experimento deve ser Descartado. Como as FFAs são tóxicas para as células em concentrações mais elevadas, e a concentração letal difere entre as espécies de FFAs, a concentração subletal ideal que induz a formação de LD deve ser titulada para cada aplicação.

Uma vez que os organóides OA-estimulados são fixos e manchados de acordo com o protocolo, o LDF pode ser visualizado usando um microscópio confocal. Como os organóides são estruturas 3D, um microscópio epifluorescente regular não é adequado devido ao sinal de fundo fora de foco. Portanto, utilizou-se a (projeção máxima de a) pilha z confocal para caracterizar LDF em organóides. A Figura 2a mostra um resultado representativo da coloração de LD em organóides de controle saudáveis que foram tratados com ou sem um inibidor de DGAT1. Embora a quantificação destas imagens seja trabalhosa, a análise confocal sere principalmente como uma ferramenta do visualization para verific para ver se há a formação anormal do LD. A quantificação das amostras de microscopia confocal também pode ser realizada por meio de um leitor de placas fluorescentes (Figura 2B), normalizado ao sinal fluorescente de Hoechst. O ensaio do leitor de placas indica uma diminuição significativa no sinal de LD540 em células organóides tratadas com inibidor de DGAT1 (D1i) em comparação com organóides não tratados.

A quantificação da formação de LD em células individuais pode ser alcançada com o uso do citometro de fluxo. A estratégia de gating usada para organóides intestinais humanos dissociados é mostrada na Figura 3A. O primeiro passo de gating no FSC-A/SSC-um enredo é uma primeira seleção de ' ao vivo ' (quando fixo), células individuais. Para excluir ainda mais doublets, trigêmeos ou Aglomeradores de células maiores, incluímos duas etapas adicionais de gating em FSC-W/FSC-H e SSC-W/SSC-H. Finalmente, o gating no FSC-A/Hoechst assegura a exclusão de todas as pilhas que eram inoperantes ou morrendo antes da fixação. A Figura 3B, C mostra os HISTOGRAMAS do sinal SSC-a e LD540 da população final de células ao vivo. A LDF resultará em aumento da SSC-A devido à formação de gotas lipídicas intracelulares. Além disso, LD540 manchas para lipídios que são armazenados no LDs e este sinal também aumentará após a indução LDF. Como tal, a formação de LD é medida como uma mudança no MFI de ambos SSC-A e LD540 (Figura 3D, e). O MFI pode ser plotado e usado para executar a análise estatística.

Figure 1
Figura 1: culturas Organoides visualizadas por microscopia brightfield. (A, B) Para os métodos confocal e fluorescente do leitor da placa, é importante que os organóides não estão semeados na densidade demasiado elevada na gota de BMM. (A) os organóides são semeados em uma densidade apropriada de 250 células/μl. (B) os organóides foram semeados em uma densidade muito alta, causando sobreposição de organóides e morte celular. (C, D) Após a estimulação durante a noite com OA, a formação de LD pode ser avaliada visualmente. (C) organóides foram incubados durante a noite com 12% de controle de veículos BSA. (D) os organóides foram incubados durante a noite com 1 mm de OA conjugados à BSA, resultando em uma aparência escura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: resultados representativos da caracterização de LDF usando a imagem latente confocal e um leitor da placa fluorescente. Os organóides controle-derivados saudáveis foram estimulados durante a noite com BSA, 1 milímetro OA, ou 1 milímetro OA + D1i. (A) projeção máxima de pilhas confocais de 85 μm manchadas para DAPI (ciano) e LD540 (amarelo). Este subgráfico é adaptado de Van Rijn et al.6. (B) intensidade de fluorescência relativa de LD540 normalizada para o sinal DAPI nuclear, medida por meio de um leitor de placas fluorescentes. A média ± DP é plotada para duas repetições biológicas. A significância estatística foi determinada por meio de ANOVA unidirecional sem medidas repetidas com post-hoc de Tukey. *, P < 0, 5. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: resultados representativos da quantificação de LDF utilizando citometria de fluxo. Os organóides controle-derivados saudáveis foram estimulados durante a noite com BSA, 1 milímetro OA, ou 1 milímetro OA + D1i. (A) estratégia de gating para selecionar para pilhas individuais organoid-derivadas. Da esquerda para a direita, primeiro exclua detritos por gating para FSC-A/SSC-A. Em seguida, portão em FSC-W/FSC-H e SSC-W/SSC-H para excluir doublets, trigêmeos, ou aglomerantes maiores de células. Finalmente, portão para FSC-A/Hoechst para selecionar para células ao vivo. Ambos os canais SSC-a e LD540 são usados para quantificar a formação de LD. Os histogramas destes parâmetros mostram uma mudança na intensidade média da fluorescência (MFI) de (B) SSC-a e (C) LD540 em cima da estimulação com OA. (D, E) O MFI por amostra pode ser plotado em um gráfico e usado para realizar a análise estatística. A média ± DP é plotada para três repetições biológicas. A significância estatística foi determinada por meio de ANOVA unidirecional sem medidas repetidas com post-hoc de Tukey. *, P < 0, 5; * *, P < 0, 1; , P < 0, 1. Este número é adaptado de Van Rijn et al.6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Química Solvente Concentração de estoque Concentração final
Wnt3a CM - 100% de 50% de
R-spondin-1 CM - 100% de 20
Noggin CM - 100% de 10
A83-01 (TGFβ-INH) Dmso 50 milímetros 500 nanômetro
B27 - 50x 1x
o mEGF PBS/0.1% BSA 500 μg/mL 50 ng/mL
N-acetil Água 500 milímetros 1,25 milímetros
Nicotinamida Pbs 1 M de de 10 mM
Primocin
(uso até que MCB esteja no congelador)		 - 50 mg/mL 100 μg/mL
SB202190 Dmso de 30 mM 10 μM

Tabela suplementar 1: receita para o meio de expansão organóide.

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Discussion

Aqui, nós fornecemos um protocolo para determinar a formação do LD em organóides intestinais humanos em cima da incubação com ácido oleico. Este método é baseado no corante fluorescente específico LD LD54018, que permite a caracterização e quantificação do volume total de gotas lipídicas dentro de uma cultura organoide. Os procedimentos para estabelecer e manter culturas organoid intestinais humanas foram publicados antes de13, e um guia visual deste protocolo está disponível também15.

As etapas cruciais neste protocolo são a cultura de organóides intestinais humanos, e a conjugação adequada de OA para BSA. A cultura dos organóides requer uma formulação correta do meio de cultura, pois a manutenção de uma população de células-tronco é altamente dependente de Wnt3A-CM funcionais. Quando Wnt3A CM é feito em casa, recomendamos um fluxo de trabalho altamente padronizado e a produção mensal de meio condicionado devido ao tempo de expiração de cerca de 2 meses. Além disso, 1:1 mistura de lotes consecutivos de Wnt3A CM resulta em uma cultura de longo prazo mais constante, pois assegura que um lote ligeiramente sub-ideal não terá um grande impacto no crescimento organoide.

Além disso, nosso BM consiste em meio DMEM/F12 avançado, que contém BSA rico em lipídios. Desde que nosso controle do veículo (12% BSA/BM) não induz a formação do LD nos organoids, nós concluímos que a quantidade ou o tipo de FFA no BM não são suficientes influenciar o ensaio de LDF.

A conjugação de OA para BSA é um processo delicado que pode exigir alguma otimização. Nós experimentamos que o protocolo descrito aqui é o mais óptimo quando todas as mudanças de temperatura são seguidas meticulosamente e quando executadas usando o Labware de vidro.

Em pesquisa prévia, os ensaios de formação de LD têm sido utilizados para caracterizar o tamanho e o número de LD com alta ampliação8,12. Estes ensaios foram realizados principalmente usando boro-dipirrometeno (BODIPY) 493/503, que fornece uma excelente coloração para LDs com alta relação sinal-ruído. Entretanto, o espectro de emissão de BODIPY é completamente largo, e sobrepõe-se pela maior parte com o espectro fluorescente de tinturas fluorescentes verdes da proteína (GFP)-derivadas. Embora nós esperamos que a aplicação atual do ensaio de LDF trabalhasse com BODIPY também, a escolha para LD540 permite uma escala mais larga de imagens multicolor, incluindo a cocoloração com etiquetas de GFP18. Nós igualmente executamos este ensaio usando o vermelho do Nilo da mancha do lipido (dados não mostrados). Entretanto, desde que o vermelho de Nile tende a manchar não somente LDs mas igualmente bilayers do lipido, nós encontramos que o sinal de fundo mais elevado do vermelho de Nile abaixa a capacidade de nosso ensaio para distinguir diferenças pequenas da formação do LD. Por estas razões, nós preferimos usar LD540 em um ensaio do LDF organoid-baseado.

Comparado aos estudos mais adiantados que usam ensaios elevados do ldf da ampliação, o ensaio que nós descrevemos aqui permite a quantificação da elevado-produção do volume total do LD em uma grande população das pilhas. Conseqüentemente, especial a quantitation fluorescente do leitor da placa, e potencial a análise cytometric do do fluxo, pode ser escalada testando o efeito das drogas na formação do LD. Como nós mostramos que a formação do LD é pela maior parte DGAT1 dependente, os organóides paciente-derivados ou D1i-tratados DGAT1-deficientes representam uma oportunidade desobstruída para a aplicação de tal seleção. Especial para tais doenças de ocorrência raras, o ensaio de ldf combinado com os organóides paciente-derivados poderia fornecer uma plataforma para a seleção paciente-específica para drogas terapêuticas novas.

No entanto, uma consequência de uma abordagem de alta taxa de transferência é que o poder de caracterizar LDs individuais é perdido. Quando a visualização microscópica ou fluorescente do elétron da elevado-ampliação de LDS puder ser usada para estudar a dinâmica no tamanho do LD e no número12,19, a aproximação da elevado-taxa de transferência não distingue entre o múltiplo pequeno ou menos LDs grandes e não podem conseqüentemente ser usados para quantificar diferenças no metabolismo do LD onde ao volume total de LDs remanesce constante. Portanto, em aplicativos onde o número ou o tamanho dos LDs são suspeitos de ser de interesse, isso deve ser abordado com uma técnica de ampliação de menor throughput, maior. Além disso, os organóides no ensaio atual recebem a estimulação basolateral do lipido quando os lipídios dietéticos forem tomados tipicamente acima na membrana apical. Portanto, é necessário algum cuidado se os resultados forem traduzidos para a situação fisiológica.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a B. Spee por generosamente fornecer LD540. Este trabalho foi apoiado por uma organização dos Países Baixos para a concessão da pesquisa científica (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) para S.M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-028
B27 supplement  Gibco 17504-044
Basement membrane matrix (matrigel) BD Biosciences 356231
DAPI Sigma-Aldrich D9542-1MG
DGAT1 inhibitor (AZD 3988) Tocris Bioscience 4837/10
Fatty acid free BSA Sigma-Aldrich A7030
Formaldehyde Klinipath 4078-9001
Glutamin (GlutaMAX, 100x) Gibco 15630-056
HEPES (1 M) Gibco 15630-080
Laser scanning confocal microscope Leica SP8X
LD540 kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University
mEGF Peprotech 315-09_500ug
N-acetyl cysteine Sigma-Aldrich A9165-100G
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636-500G
Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Oleic acid Sigma-Aldrich O1008-5G
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) Sigma-Aldrich S7067-25MG
PBS Sigma-Aldrich D8662-500ML
PBS without Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537-500ML
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) Gibco 15070-063
R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) R&D systems 3710-001-01
TC-treated 24 well plates Greiner-One 662160
TC-treated black clear-bottom 96 well plates Corning Life Sciences 353219
TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)  Tocris Bioscience 2939/10
Trypsin (TrypLE Express) Life Technologies 12604021
WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) Abcam ab120129-10

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References

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van Rijn, J. M., van Hoesel, M., Middendorp, S. A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60150, doi:10.3791/60150 (2019).

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