Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Un ensayo basado en fluorescencia para la caracterización y cuantificación de la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos

Published: October 13, 2019 doi: 10.3791/60150
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Division of Pediatrics, Department of Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 2Regenerative Medicine Center, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 3Science for Life Laboratory, Department of Medical Biochemistry and Microbiology, Uppsala University

Summary

Este protocolo describe un ensayo para la caracterización de la formación de gotas lipídicas (LD) en organoides intestinales humanos tras la estimulación con ácidos grasos. Discutimos cómo se utiliza este ensayo para la cuantificación de la formación de LD, y cómo se puede utilizar para la detección de alto rendimiento de medicamentos que afectan a la formación de LD.

Abstract

Los lípidos dietéticos son tomados como ácidos grasos libres (FAs) por el epitelio intestinal. Estos FA se convierten intracelularmente en moléculas de triglicéridos (TG), antes de que se envasen en quilomicrones para su transporte a la linfa o en gotas de lípidos citosólicos (LD) para el almacenamiento intracelular. Un paso crucial para la formación de LOS LU es la actividad catalítica de las aciltransferasas diacilglicerol (DGAT) en el paso final de la síntesis de TG. Los D.M. son importantes para amortiguar las especies de lípidos tóxicos y regular el metabolismo celular en diferentes tipos de células. Dado que el epitelio intestinal humano se enfrenta regularmente con altas concentraciones de lípidos, la formación de LD es de gran importancia para regular la homeostasis. Aquí describimos un simple ensayo para la caracterización y cuantificación de la formación de LD (LDF) sobre la estimulación con el ácido graso insaturado más común, el ácido oleico, en los organoides intestinales humanos. El ensayo LDF se basa en el tinte fluorescente LD540 específico de LD, que permite cuantificar los D mediante microscopía confocal, lector de placas fluorescentes o citometría de flujo. El ensayo LDF se puede utilizar para caracterizar la formación de LD en células epiteliales intestinales humanas, o para estudiar trastornos humanos (genéticos) que afectan el metabolismo de la LD, como la deficiencia de DGAT1. Además, este ensayo también se puede utilizar en una tubería de alto rendimiento para probar nuevos compuestos terapéuticos, que restauran defectos en la formación de LD en los órganooides intestinales u otros tipos.

Introduction

Los lípidos son un componente crucial de la dieta humana y juegan un papel importante en el almacenamiento de energía sistémica y el metabolismo. Cuando se ingenian, los lípidos dietéticos se degradan en ácidos grasos libres (FFA) y monoglicéridos (GM) por lipasas pancreáticas. Estos sustratos son entonces tomados por los enterocitos del epitelio intestinal, donde primero son reesterificados a diglicéridos (DG) por enzimas aciltransferasas monoglicéridos (MGAT) y posteriormente a triglicéridos (TG) por diacilglicerol acitransferasa 1 (DGAT1)1. Por último, estos TG s están integrados en quilomicrones para su exportación al sistema linfático o gotas lipídicas citosólicas (LD) para el almacenamiento intracelular2,3. Aunque se necesitan quilomicrones para distribuir lípidos dietéticos a otros órganos, la importancia del almacenamiento de grasa intracelular en los D No está completamente clara. Sin embargo, se ha demostrado que los DN realizan una función reguladora en el intestino, ya que liberan lentamente lípidos en la circulación hasta 16 h después de una comida4. Además, se ha demostrado que los LU protegen contra las concentraciones de ácidos grasos tóxicos, como en los adipocitos de ratón durante condiciones lililíticas5.

La proteína DGAT1 se encuentra en la membrana del retículo endoplasmático (ER) y desempeña un papel crucial en la formación de LD en el epitelio intestinal. Las mutaciones homocigotas en DGAT1 conducen a diarrea y/o vómitos graves de inicio temprano, hipoalbuminemia y/o enteropatía (fatal) que pierde proteínas con insuficiencia intestinal al tener grasa, lo que ilustra la importancia de DGAT1 en la homeostasis lipídica del ser humano epitelio intestinal6,7,8,9,10. Dado que la aparición de deficiencia de DGAT1 en humanos es poco frecuente, el acceso a las células primarias derivadas del paciente ha sido escaso. Además, el cultivo a largo plazo de las células epiteliales intestinales se ha restringido durante mucho tiempo a las líneas celulares derivadas de tumores que representan la fisiología normal sólo a una extensión limitada. Por lo tanto, la formación de LD mediada por DGAT1 se ha estudiado principalmente en fibroblastos o líneas celulares de origen animal7,10,11,12. Como tal, recientemente se demostró que los fibroblastos derivados del paciente con deficiencia de DGAT1 acumulan menos LDs en comparación con las células de control sanas después de la estimulación con ácido oleico (OA)8.

Anteriormente, se establecieron protocolos para cultivar células madre epiteliales de cualquier órgano gastrointestinal en forma de organoides tridimensionales (3D)13. Estos organoides intestinales se pueden mantener en cultivo durante un largo período de tiempo13,y permiten el estudio funcional de las características epiteliales específicas del paciente e intestinal14. Son genética y fenotípicamente estables y pueden almacenarse, permitiendo la expansión a largo plazo y la biobanca13.

Recientemente demostramos que la formación de LD se puede medir fácilmente en organoides intestinales humanos en un ensayo de formación de LD (LDF)6. Cuando se exponen a OA durante 16 h, los organoides generan LDs para proteger las células de la toxicidad inducida por lípidos. Cuando las concentraciones de OA son demasiado altas, las células mueren por apoptosis mediada por caspasa6. Anteriormente se demostró que el ensayo LDF dependía en gran medida de DGAT1, como indican los organoides derivados de pacientes con mutantes DGAT1 y el uso de inhibidores específicos de DGAT16.

Para el ensayo de LDF descrito en detalle aquí, los organoides 3D se cultivan a partir de biopsias intestinales y se reperduen semanalmente por la interrupción en células individuales que forman fácilmente nuevos organoides. Para ejecutar el ensayo de LDF, se celen células individuales derivadas de organoides de 7.500 euros en cada pocal de una placa de 24 pocillos. Los organoides se forman durante varios días, se incuban durante la noche con 1 mM de OA y se tiñen con LD540, un tinte específico para LD permeable a las células fluorescentes que facilita la toma de imágenes. La formación de LD se cuantifica entonces mediante microscopía confocal, lector de placas fluorescentes o citometría de flujo.

Al escalar este ensayo de formación de LD a un formato de 96 pozos, el ensayo también se puede utilizar para el análisis de alto rendimiento de la formación de LD para detectar nuevos fármacos que afectan a la formación de LD en cultivos organoides intestinales humanos, o para estudiar trastornos (genéticos humanos) que afectan Metabolismo de la LD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toda la experimentación con los tejidos humanos descritos en este documento fue aprobada por el comité ético del University Medical Center Utrecht (UMCU). Se obtuvo un consentimiento informado para la recolección, generación, almacenamiento y uso de los organoides de los pacientes en el Wilhelmina Children's Hospital (WKZ)-UMCU.

1. Preparación de medios de comunicación culturales

NOTA: Este protocolo debe realizarse dentro de un gabinete de bioseguridad. Los organoides deben manipularse de acuerdo con las pautas de cultivo celular estándar.

  1. Preparar el medio de cultivo basal.
    NOTA:     El medio de cultivo sin factores de crecimiento se conoce como medio basal (BM).
    1. Añadir 5 ml de HEPES (1 M), 5 ml de L-glutamino (100x) y 5 ml de penicilina-estreptomicina (5.000 U/ml) a 500 ml del medio águila modificado de Dulbecco avanzado con la mezcla de nutrientes F-12 de Jamón para preparar el medio BM.
    2. Conservar el medio BM preparado a 4oC y utilizarlo durante un máximo de 2 meses.
  2. Preparar el medio acondicionado (CM) De R-spondin y Noggin de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    1. Brevemente, aumentar las células a la cantidad deseada en hiperflfrascos con 5 x 107 células en medio de 555 ml sin antibiótico selectivo por matraz.
    2. Cultivar las células durante 4 días hasta que confluente.
    3. Sustituya el medio por BM y el cultivo durante 8 días adicionales.
    4. Después de 8 días de cultivo a 37oC, recoger el medio de cultivo y centrifugar durante 5 min a 450 x g para peletizar las células restantes.
    5. Filtrar esterilizar el sobrenadante, y almacenar alícuotas de la R-espondina o Noggin CM a -20 oC durante un máximo de 6 meses.
  3. Preparar Wnt3A-CM según Boj et al.15.
    1. Brevemente, crecer las células a la cantidad deseada en platos de 145 mm con 2 x 106 células en medio de 20 ml sin antibiótico selectivo por plato. Envuelva cada plato con papel de plástico para evitar la evaporación del medio de cultivo.
    2. Después de 8 días de cultivo a 37oC, recoger el medio de cultivo y centrifugar durante 5 min a 450 x g para peletizar las células restantes.
    3. Filtrar esterilizar el sobrenadante, y almacenar las alícuotas del Wnt3A-CM a 4 oC durante un máximo de 2 meses.
  4. Preparar el medio de expansión organoide.
    NOTA:     El medio de expansión organoide intestinal pequeño humano (ver receta en la Tabla Suplementaria 1)se conoce como hSI-EM. Los siguientes pasos producirán un volumen final de 1 L hSI-EM, y se pueden escalar hacia arriba o hacia abajo según sea necesario.
    1. Disolver 1,46 g de nicotinamida en 12 ml de solución salina con fosfato de grado de cultivo celular (PBS) para crear una dilución final de 1 M.
    2. Disolver 245 mg de n-acetilcisteína en 3 ml de grado de cultivo celular PBS para crear una dilución final de 500 mM.
      NOTA: Para acelerar la formación de una solución, la nicotinamida y la n-acetilcisteína se pueden incubar en un baño de agua a 37 oC. Ambas soluciones se pueden preparar por lotes, alícuotas y almacenarse a -20 oC para su uso futuro.
    3. El filtro esteriliza ambas soluciones a través de un filtro de 0,22 m en un tubo estéril de 15 ml.
    4. Añadir 167 ml de BM a un matraz medio de cultivo estéril de 500 ml. Añadir 200 ml de R-Spondin-CM, 100 ml de noggin-CM y 100 ml de mEGF recombinante (500 g/ml) a una concentración final de 50 ng/ml.
    5. Añadir 10 ml de la solución esterilizada de nicotinamida y 2,5 ml de la solución esterilizada de n-acetilcisteína. Añadir 20 mL de suplemento B27 (50x).
      NOTA: En esta etapa, el medio se conoce como hSI-EM sin WAS (Wnt3A-CM, A83-01 y SB202190), y puede ser alícuota y almacenado a -20 oC. Si el medio se alícuota en volúmenes más pequeños, ajuste las concentraciones de los siguientes pasos en consecuencia.
    6. A 500 mL de hSI-EM sin WAS, agregue 10 mL de Wnt3A-CM del último lote recién preparado y 10 mL de Wnt3A-CM del segundo último lote para minimizar los cambios de variabilidad en condiciones Wnt3A-CM.
    7. Añadir A83-01 a una concentración final de 500 nM, y SB202190 a una concentración final de 10 m.
    8. Conservar el hSI-EM preparado (con WAS) a 4oC y utilizardurante durante un máximo de 2 semanas.
      NOTA: Añadir Y-27632 adicional a una concentración final de 10 m (denominado hSI-EM+Y) cuando se cultivan criptas o células individuales o se inician organoides a partir de la criopreservación.
  5. Prepare el búfer de clasificación de células activadas fluorescentes (FACS).
    1. Añadir 10 ml de suero de becerro fetal (FCS) a 40 ml de PBS sin Ca2+/Mg2+ para una concentración final de 10% FCS.
      NOTA: El FCS evita que las células se adhieran a labware.

2. Procedimientos de cultivo para los pequeños organoides intestinales pequeños humanos

NOTA: Este protocolo debe realizarse dentro de un gabinete de bioseguridad. Los organoides deben manipularse de acuerdo con las pautas de cultivo celular estándar. Al manipular organoides u células derivadas de organoides, las células deben mantenerse en hielo siempre que sea posible. Las células permanecerán viables durante unas horas después de la cosecha cuando esto esté asegurado. Los organoides deben cultivarse en una incubadora de cultivo celular estándar a 37 oC con un 5% de CO2. Estas condiciones se aplican a todos los pasos de incubación con organoides incrustados en la matriz de membrana del sótano (BMM; es decir, Matrigel) a lo largo de este protocolo. Los autores han utilizado organoides derivados del duodeno para estos ensayos.

  1. Organoides de paso
    Nota    : Cada cultivo organoide tiene su propio tiempo de duplicación. Normalmente, los pequeños organoides intestinales se pueden pasar 1:3-1:5 cada 7-10 días. Cuando se pasa como células individuales, la eficiencia de paso puede ser de hasta 1:20, dependiendo de la densidad celular. Para el establecimiento y mantenimiento, los organoides se cultivan en placas de 24 pocillos; para el ensayo de FDN, ya sea en placas de 24 o 96 pocillos.
    1. Preparación
      1. Placas de cultivo de tejido precalentadas de 24 pocillos en una incubadora a 37oC, 5 % CO2 al menos durante la noche y preferiblemente 5 días de antelación.
        NOTA: El precalentamiento de las placas de cultivo de tejido en la incubadora de cultivo celular garantiza la correcta formación y unión de gotas que contienen organoides de BMM.
      2. Para reducir el número de ciclos de congelación-descongelación, prepare 1 ml de alícuotas de BMM y guárdelas a -20 oC. Descongelar un vial de BMM sobre hielo al menos 30 minutos antes de iniciar el procedimiento de paso organoide.
      3. Mantenga un tubo de 50 ml de BM sobre hielo como medio de lavado.
      4. Prepare hSI-EM como se describe en la sección 1.4, y prepare una cantidad apropiada de hSI-EM+Y, por ejemplo, 15 ml para una placa completa de 24 pocillos.
    2. Recoger organoides.
      1. Aspirar cuidadosamente el medio de cultivo sin perturbar las gotas de BMM.
      2. Añadir 500 ml de BM frío al primer pozo de organoides, y interrumpir las gotas BMM con organoides mediante la pipeteo suavemente hacia arriba y hacia abajo con un pipeta P1000.
      3. Repita este procedimiento con el mismo medio en el siguiente pozo requerido, pero no cosechar más de 2 pozos por 500 ml de BM.
      4. Recoger los organoides en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de unión baja y girar hacia abajo en una mini centrífuga de mesa para 15 x 20 s (máx. 2.000 x g). Aspirar el sobrenadante por completo y eliminar el último bit de medio con un pipeta P200.
        NOTA: Cuando los cultivos organoides se ven limpios bajo un microscopio y no contienen células muertas u otros desechos, las gotas de BMM se pueden cosechar directamente en trippsina en lugar de BM en el paso 2.1.2.2. Después del paso 2.1.2.3, proceda directamente a la incubación en el paso 2.1.3.1.
    3. Disociar los organoides en células individuales.
      1. Añadir 400 l de tripsina a los organoides hilado por. Incubar los organoides a 37oC durante 5 min en un baño de agua.
      2. Interrumpa los agregados restantes de las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo suavemente con un pipeta P200. Una vez más, incubar los organoides a 37 oC durante 5 minutos en un baño de agua.
      3. Compruebe el progreso de la disociación celular bajo un microscopio utilizando aumento 4x. Repita la interrupción manual y la incubación cuando queden grandes grupos de células.
      4. Cuando sólo queden células individuales, agregue 1 ml de BM y gire hacia abajo las células en una mini centrífuga de sobremesa durante 15 x 20 s.
      5. Aspira rinde al sobrenadante por completo. Resuspenda las células individuales en 200 ml de hSI-EM fresco utilizando un pipeta P200. Añadir 800 s l adicionales de hSI-EM.
      6. Cuente el número de células en suspensión.
        NOTA: En el laboratorio de autores, el recuento manual de células organoides disociadas produce resultados más fiables que un contador de células automatizado. Cuando se utiliza un contador de células automatizado, la densidad celular para aplicaciones posteriores debe probarse internamente y ajustarse si crecen demasiado pocos o demasiados organoides.
    4. Organoides de semilla para mantenimiento o ensayo de formación de gotas lipídicas.
      1. Calcule el volumen de celdas que se necesita para la densidad de celda final.
        NOTA: Aproximadamente 250 células/ L es una densidad adecuada. En una placa de 24 pocillos, se filtran 30 l en cada poca, mientras que 5 l se sembra en cada pocil de una placa de 96 pocillos.
      2. Saque el volumen adecuado de suspensión y ajuste la densidad a 750 celdas /L (o gire hacia abajo y resuspenda cuando la densidad es demasiado baja).
      3. Agregue BMM a la suspensión celular en una proporción de 2:1. La densidad celular final en esta mezcla es de 250 células/ L. Mezcle suavemente la suspensión pipeteando, evitando cuidadosamente cualquier burbuja.
      4. En una placa de cultivo de tejido precalentado, saque tres gotas de 10 litros por poca en una placa de 24 pocillos o una sola gota de 5 sL por poca en una placa de 96 pocillos.
      5. Colocar la placa en una incubadora a 37oC, 5%CO2 durante 10-15 min para solidificar las gotas BMM. Mientras tanto, precalienta una cantidad apropiada de hSI-EM+Y en un baño de agua a 37oC.
      6. Agregue cuidadosamente 500 s de hSI-EM+Y precalentado a cada pocto de una placa de 24 pocillos o 100 ol a cada pocal de una placa de 96 pocillos. Incubar las células en una incubadora a 37 oC, 5% CO2 y después de 2 a 3 días cambiar el medio a hSI-EM (sin Y) y actualizar 2 a 3 veces a la semana.
        NOTA: Después de 7 a 10 días, un cultivo de mantenimiento de organoides debe ser pasado de nuevo.

3. Ensayo de formación de gotas de lípidos

  1. Preparación de conjugado de ácido oleico
    NOTA:     Dado que el ácido oleico (OA) es hidrófobo y no soluble en agua, se conjuga con la albúmina sérica bovina (BSA). BSA puede unir múltiples moléculas de ácidos grasos y en este caso se utiliza en una proporción de 1:8 para hacer ácido oleico accesible a las células intestinales. Los ácidos grasos libres y la BSA pueden unirse al material de laboratorio de plástico. Para garantizar una concentración final adecuada, utilice viales de vidrio y pipetas de vidrio siempre que sea posible.
    1. Pesar 0,2 g de ácido oleico líquido a temperatura ambiente. Añadir 1,5 ml de PBS estéril de grado de cultivo y calentar la mezcla a 70 oC durante 1 h. Vórtice intermitentemente.
    2. Pesar 5,89 g de BSA libre de ácidos grasos y disolver en 33,9 ml de PBS. Calentar la mezcla en un baño de agua a 37 oC hasta que la BSA se disuelva por completo.
    3. Vortex la mezcla OA de nuevo para crear una emulsión de gotas finas y añadirlo inmediatamente a la solución BSA utilizando un pipeta de vidrio. Mantenga la solución final cerca de 37 oC después de añadir el OA. La mezcla final consiste en 20 mM de OA en 2,5 mM de BSA.
    4. Conservar la mezcla a 37oC durante 30 min hasta que quede una solución transparente amarillento.
    5. El conjugado OA-BSA puede ser aliquoted y congelado a -20 oC durante al menos 6 meses. Al descongelar una alícuota, incubarla a 37oC hasta que la nubosidad se disuelva y la mezcla se vuelva a aclarar.
      NOTA: Debido al alto contenido de proteínas y lípidos de la solución final, la mezcla no se puede esterilizar o autoclaver. Cuando los componentes se manejaron con cuidado, en una campana de flujo laminar cuando era posible y utilizando PBS estéril, los autores no experimentaron infecciones microbianas.
  2. Ensayo confocal de LDF
    1. Preparación de muestras
      1. Pasaje organoides como se describe en la sección 2.1. Saque las células individuales derivadas de organoides en una placa negra de fondo claro de 96 pocillos.
      2. En el día 6 del cultivo en hSI-EM, reemplace el medio de cultivo por hSI-EM que contiene 1 mM de conjugado OA-BSA.
      3. Incubar las células durante 16 a 17 h (durante la noche) a 37 oC en presencia o ausencia de inhibidor de DGAT1 de 0,1 oM. Incluya un control del vehículo de 2,5 mM DeSA.
      4. Después de 16-17 h, aspirar el medio sin perturbar las gotas BMM. Fije los organoides añadiendo 100 éL de formaldehído tamponado neutro al 4% a los pozos durante 30 minutos a temperatura ambiente.
        NOTA: El formaldehído disolverá parcialmente el BMM, mientras que los organoides se hunden hasta el fondo y se adhieren a la parte inferior de la placa.
      5. Retire el formaldehído suavemente y lave cuidadosamente los pozos con 150 ml de PBS por poca.
      6. Manchar las células para los LD con 0.025 mg/mL LD540 y 4o,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) en PBS durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
      7. Lave los pozos cuidadosamente con PBS.
        NOTA: El protocolo se puede pausar aquí cuando sea necesario. Mantener las muestras cubiertas de PBS en la oscuridad a 4 oC. La tinción LD540 permanecerá estable hasta por una semana. Este ensayo también se puede realizar con células vivas, para monitorear la formación de LD durante un período de tiempo. Para ello, la fijación debe omitirse del protocolo, y la DAPI debe sustituirse por la tinción Hoechst. LD540 puede manchar los LD en células vivas en la misma concentración que se describe.
    2. Imágenes confocales
      NOTA: La toma de imágenes se puede realizar en muestras de organoides preparadas en la placa negra de fondo transparente de 96 pocillos.
      1. Para obtener imágenes de resumen de organoides enteros, utilice un objetivo de 40x adecuado para la imagen fluorescente confocal.
      2. Ajuste el microscopio para que idee el canal DAPI a 405 nm de excitación y aprox. 410 a 535 nm de longitud de onda de emisión. Para el tinte LD540, elija un láser de excitación a 540 nm (543 nm es óptimo) y establezca los filtros de emisión en 545 x 700 nm.
        NOTA: En este protocolo, se utilizó un sistema confocal de escaneo láser con un láser de luz blanca, divisor de haz acousto-óptico (AOBS), objetivo 10x/20x y sistema de detección espectral. Esto permite ajustar exactamente las longitudes de onda específicas. Si un sistema comparable no está disponible, elija líneas láser y filtros de paso corto/largo cerca de las especificaciones anteriores. Para imágenes de órganoide entero, una resolución de 512 x 512 o 1024 x 1024 es suficiente para el análisis de imágenes aguas abajo.
      3. Ajuste el tamaño del agujero en 1 unidad ventilada (AU) para una resolución suficiente del eje z.
      4. Para crear una imagen de la mitad de un organoide esférico, establezca una pila z en aproximadamente 85 m.
    3. Análisis de imágenes
      NOTA: Para el análisis de imágenes, Fiji/ImageJ16,17 se utilizó para generar proyecciones máximas. El análisis se puede realizar con cualquier paquete de software de análisis de imágenes que permita la máxima proyección, umbral manual y análisis de partículas.
      1. Usando Fiji/ImageJ, transforme la pila z de cada organoide a una proyección máxima: Imagen ? Pilas ? Proyecto Z.
      2. Establezca el umbral de la proyección máxima en un nivel en el que no haya señal LD540 visible en la muestra de control del vehículo BSA: Imagen Ajustar ? Umbral. Utilice esta configuración para umbral de cada imagen.
      3. Mida el área total de fluorescencia para cada proyección máxima utilizando la función Analizar . Analizar partículas.
        NOTA: Aunque la resolución del ensayo es mejor utilizando un microscopio confocal, este ensayo también se puede analizar mediante el uso de un lector de placas fluorescentes con filtros similares. Para normalizar el recuento de organoides por pozo, la señal LD540 debe dividirse por la señal DAPI. Por último, se debe restar la señal del control del vehículo BSA para normalizar las mediciones. Este enfoque permite escalar el ensayo hacia un formato de placa de 96 pocillos.
  3. Ensayo citométrico de flujo LDF
    1. Preparación de muestras
      1. Pasaje organoides como se describe en la sección 2.1. Saque las células individuales derivadas de organoides en una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos. Dos pozos por condición es suficiente para la citometría de flujo.
      2. El día 10 del cultivo en hSI-EM, reemplace el medio de cultivo por hSI-EM que contiene 1 mM de conjugado OA-BSA.
        NOTA: En contraste con el análisis confocal, se eligieron 10 días de crecimiento en EM para el ensayo de citometría de flujo en lugar de 6 días. Los 4 días adicionales de expansión darán lugar a organoides superpuestos ópticamente que complicarían el ensayo basado en microscopía. Sin embargo, el mayor número de células facilita el análisis de citometría de flujo.
      3. Incubar las células durante 16 a 17 h (durante la noche) a 37 oC en presencia o ausencia de inhibidor de DGAT1 de 0,1 oM. Incluya un control del vehículo de 2,5 mM DeSA.
      4. Después de las 16 a 17 h, recoger los organoides como se describe en la sección 2.1.2.
      5. Disociar los organoides en células individuales como se describe en la sección 2.1.3.
        NOTA: Aunque no es estrictamente necesario, se recomienda comprobar el recuento de celdas en cada muestra. Un recuento total de 10.000 celdas por muestra es el mínimo absoluto necesario para una resolución suficiente. Para obtener resultados óptimos, utilice entre 50.000 y 100.000 células.
      6. Gire las células en una mini centrífuga de mesa durante 15 x 20 s.
      7. Estañe cada muestra con 500 ml de 0,025 mg/ml LD540 y 1 Hoechst de g/ml en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
      8. Gire las células en una mini centrífuga de sobremesa durante 15 x 20 s y lave 3 veces con PBS.
      9. Fijar las células resubyficarlos en 500 l de 4% de formaldehído tampón neutro durante 15 minutos a temperatura ambiente.
      10. Gire hacia abajo las células y lave 3veces con el tampón FACS.
      11. Enjuague previamente los tubos FACS con tampón FACS para evitar que las células se peguen a la pared del tubo.
      12. Resuspenda las células en 200 ml de tampón FACS y transfiera la suspensión celular a los tubos FACS preenjuirados.
    2. Análisis citométrico de flujo
      1. Establezca los parámetros de gating para excluir celdas muertas y grupos de celdas (consulte la sección de resultados representativos).
      2. En la población cerrada final, mida al menos 10.000 células para obtener resultados fiables.
        NOTA: A partir de esta población, la intensidad fluorescente media (IMF) de LD540 y la señal saci-A media proporcionan conjuntamente una medida del volumen total de formación de LD por célula.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Para un análisis adecuado de la formación de LD, los organoides no deben ser sembrados demasiado densamente antes de la estimulación con OA y posterior tinción. Esto es especialmente importante para la lectura confocal y lector de placas, ya que los organoides superpuestos podrían interferir con la fluorescencia. Se muestra un ejemplo de densidad de semilla de organoides adecuada(Figura 1A) y un cultivo con organoides superpuestos (Figura 1B). Para minimizar la variabilidad en la estimulación de la muestra con OA, el tamaño organoide y la densidad de semilla deben ser comparables entre las muestras dentro de un experimento. Esto se controla mejor sembrando un número igual de celdas individuales. Sin embargo, algunos ajustes podrían ser necesarios si ciertas líneas organoides muestran consistentemente una mayor eficiencia de reconstitución y, por lo tanto, un recuento de organoides consistentemente mayor.

Después de la estimulación con 1 mM de OA durante la noche, la formación de LD se puede visualizar con un microscopio de campo brillante invertido. La acumulación de D dispersa la luz transmitida, y por lo tanto los organoides aparecen más oscuros, mientras que los organoides no estimulados tienen un aspecto translúcido(Figura 1C). Un ejemplo de formación de LD como se ve bajo un microscopio de campo brillante se muestra en la Figura 1D. Este fenómeno se puede utilizar para evaluar las condiciones experimentales antes de la lectura del ensayo fluorescente. Cuando la muestra de control positivo no es visualmente más oscura que la muestra de control negativo, o cuando la muerte celular extensa es evidente, el experimento debe descartarse. Como los FFA son tóxicos para las células en concentraciones más altas, y la concentración letal difiere entre especies de FFA, la concentración subletal óptima que induce la formación de LD debe valorarse para cada aplicación.

Una vez que los organoides estimulados por OA se fijan y tiñen de acuerdo con el protocolo, el LDF se puede visualizar utilizando un microscopio confocal. Como los organoides son estructuras 3D, un microscopio epifluorescente regular no es adecuado debido a la señal de fondo fuera de foco. Por lo tanto, utilizamos una (proyección máxima de una) pila z confocal para caracterizar LDF en organoides. La Figura 2A muestra un resultado representativo de la tinción de LD en organoides de control saludables que fueron tratados con o sin un inhibidor DGAT1. Aunque la cuantificación de estas imágenes es laboriosa, el análisis confocal sirve principalmente como una herramienta de visualización para comprobar la formación anormal de LD. La cuantificación de las muestras de microscopía confocal también se puede realizar utilizando un lector de placas fluorescentes(Figura 2B),normalizado a la señal fluorescente Hoechst. El ensayo del lector de placas indica una disminución significativa de la señal LD540 en las células organoides tratadas con el inhibidor DGAT1 (D1i) en comparación con los organoides no tratados.

La cuantificación de la formación de LD en células individuales se puede lograr utilizando el citómetro de flujo. La estrategia de gating utilizada para los organoides intestinales humanos disociados se muestra en la Figura 3A. El primer paso de la gating en la gráfica FSC-A/SSC-A es una primera selección de celdas individuales 'vivas' (cuando están fijas). Para excluir aún más dobletes, trillizos o grupos de células más grandes, incluimos dos pasos adicionales en FSC-W/FSC-H y SSC-W/SSC-H. Por último, la venta en FSC-A/Hoechst garantiza la exclusión de las células que estaban muertas o muriendo antes de la fijación. La Figura 3B,C muestra los histogramas de la señal SSC-A y la señal LD540 de la población final de células vivas. LDF dará lugar a un aumento en SSC-A debido a la formación de gotas de lípidos intracelulares. Además, las manchas LD540 para los lípidos que se almacenan en los LD y esta señal también aumentarán tras la inducción de LDF. Como tal, la formación de LD se mide como un cambio en la IMF de SSC-A y LD540(Figura 3D,E). La IMF se puede trazar y utilizar para realizar análisis estadísticos.

Figure 1
Figura 1: Cultivos organoides visualizados por microscopía de campo brillante. (A,B) Para los métodos de lector de placas confocales y fluorescentes, es importante que los organoides no se sembran en una densidad demasiado alta en la gota de BMM. (A) Los organoides se sembran en una densidad adecuada de 250 células / L. (B) Organoides fueron sembrados en una densidad demasiado alta, causando la superposición de organoides y la muerte celular. (C,D) Después de la estimulación durante la noche con OA, la formación de LD se puede evaluar visualmente. (C) Los organoides se incubaron durante la noche con un 12% de control del vehículo BSA. (D) Los organoides se incubaron durante la noche con 1 mM de OA conjugado a BSA, lo que resultó en una apariencia oscura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Resultados representativos de la caracterización de LDF mediante el uso de imágenes confocales y un lector de placas fluorescentes. Los organoides sanos derivados del control se estimularon durante la noche con BSA, 1 mM OA o 1 mM OA+D1i. (A) Proyección máxima de pilas confocales de 85 m teñidas para DAPI (cian) y LD540 (amarillo). Esta subfigura está adaptada de van Rijn et al.6. (B) Intensidad relativa de fluorescencia de LD540 normalizada a la señal DAPI nuclear medida mediante el uso de un lector de placas fluorescentes. Media: sD se traza para dos réplicas biológicas. La significancia estadística se determinó utilizando un ANOVA unidireccional sin medidas repetidas con el post-hoc de un Tukey. *, P < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Resultados representativos de la cuantificación de LDF mediante citometría de flujo. Los organoides sanos derivados del control se estimularon durante la noche con BSA, 1 mM OA o 1 mM OA+D1i. (A) Estrategia de gating para seleccionar células individuales derivadas de organoides. De izquierda a derecha, primero excluya los desechos haciendo una venta para FSC-A/SSC-A. Luego afión en FSC-W/FSC-H y SSC-W/SSC-H para excluir dobletes, trillizos o grupos más grandes de células. Finalmente, puerta para FSC-A/Hoechst para seleccionar para celdas vivas. Los canales SSC-A y LD540 se utilizan para cuantificar la formación de LD. Los histogramas de estos parámetros muestran un cambio en la intensidad media de fluorescencia (IMF) de (B) SSC-A y (C) LD540 al ser estimulado con OA. (D,E) La IMF por muestra se puede trazar en un gráfico y utilizarse para realizar análisis estadísticos. Media: SD se traza para tres réplicas biológicas. La significancia estadística se determinó utilizando un ANOVA unidireccional sin medidas repetidas con el post-hoc de un Tukey. *, P < 0.05; **, P < 0.01; , P < 0.001. Esta figura está adaptada de van Rijn et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Química Solvente Concentración de stock Concentración final
Wnt3a CM - 100% 50%
R-spondin-1 CM - 100% 20%
Noggin CM - 100% 10%
A83-01 (TGF-inh) Dmso 50 mM 500 nM
B27 - 50x 1x
mEGF PBS/0.1% BSA 500 g/ml 50 ng/mL
N-acetil Agua 500 mM 1,25 mM
Nicotinamida Pbs 1 M 10 mM
Primocin
(utilizar hasta que MCB esté en el congelador)		 - 50 mg/ml 100 g/ml
SB202190 (P38 inh) Dmso 30 mM 10 m

Tabla suplementaria 1: Receta para medio de expansión organoide.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aquí, proporcionamos un protocolo para determinar la formación de LD en organoides intestinales humanos tras la incubación con ácido oleico. Este método se basa en el tinte fluorescente específico ld 54018,que permite la caracterización y cuantificación del volumen total de gotas lipídicas dentro de un cultivo organoide. Los procedimientos para establecer y mantener los cultivos organoides intestinales humanos se han publicado antes de13, y una guía visual de este protocolo está disponible también15.

Los pasos cruciales en este protocolo son el cultivo de organoides intestinales humanos, y la conjugación adecuada de OA a La BSA. El cultivo de organoides requiere una formulación correcta del medio de cultivo, ya que el mantenimiento de una población de células madre depende en gran medida de la wnt3A-CM funcional. Cuando Wnt3A-CM se hace internamente, recomendamos un flujo de trabajo altamente estandarizado y la producción mensual de medio acondicionado debido al tiempo de expiración de aproximadamente 2 meses. Además, la mezcla 1:1 de lotes Wnt3A-CM consecutivos da como resultado un cultivo más constante a largo plazo, ya que garantiza que un lote ligeramente subóptimo no tendrá un impacto importante en el crecimiento organoide.

Además, nuestro BM consiste en un medio avanzado DeM/F12, que contiene BSA rico en lípidos. Dado que nuestro control de vehículos (12% BSA/BM) no induce la formación de LD en organoides, llegamos a la conclusión de que la cantidad o el tipo de FFA en BM no es suficiente para influir en el ensayo LDF.

La conjugación de OA a BSA es un proceso delicado que podría requerir cierta optimización. Hemos experimentado que el protocolo descrito aquí es más óptimo cuando todos los cambios de temperatura se siguen meticulosamente y cuando se realizan utilizando cristal de laboratorio.

En investigaciones anteriores, se han utilizado ensayos de formación de LD para caracterizar el tamaño y el número de LD con un aumento alto8,12. Estos ensayos se realizaron principalmente utilizando boro-dipirrometeno (BODIPY) 493/503, que proporciona una excelente tinción para los LDs con alta relación señal-ruido. Sin embargo, el espectro de emisión de BODIPY es bastante amplio, y se superpone en gran medida con el espectro fluorescente de los colorantes derivados de proteínas fluorescentes verdes (GFP). Aunque esperamos que la aplicación actual del ensayo LDF también funcione con BODIPY, la elección de LD540 permite una gama más amplia de imágenes multicolores, incluyendo la co-manchación con etiquetas GFP18. También hemos realizado este ensayo utilizando la mancha lipídica Nile rojo (datos no mostrados). Sin embargo, dado que el rojo del Nilo tiende a manchar no sólo los LD, sino también las bicapas de lípidos, encontramos que la señal de fondo más alta del rojo del Nilo reduce la capacidad de nuestro ensayo para distinguir pequeñas diferencias de la formación de LD. Por estas razones, preferimos utilizar LD540 en un ensayo LDF basado en organoides.

En comparación con estudios anteriores que utilizan ensayos DeL de alta magnificación, el ensayo que describimos aquí permite una cuantificación de alto rendimiento del volumen total de LD en una gran población de células. Por lo tanto, especialmente la cuantificación del lector de placas fluorescentes, y potencialmente el análisis citométrico de flujo, se puede escalar para probar el efecto de los fármacos en la formación de LD. Como hemos demostrado, la formación de LD depende en gran medida de la DGAT1, los organoides derivados del paciente o tratados con D1i, con deficiencia de DGAT1, representan una clara oportunidad para la aplicación de dicho cribado. Especialmente para estas enfermedades raras, el ensayo LDF combinado con organoides derivados del paciente podría proporcionar una plataforma para la detección de nuevos medicamentos terapéuticos específicos del paciente.

Sin embargo, una consecuencia de un enfoque de alto rendimiento es que se pierde el poder de caracterizar los D individuales. Mientras que la visualización microscópica o fluorescente electrónica de alta aumento de los LD se puede utilizar para estudiar la dinámica en tamaño LD y número12,19, el enfoque de alto rendimiento no distingue entre múltiples pequeños o menos grandes d.C. y, por lo tanto, no se pueden utilizar para cuantificar las diferencias en el metabolismo de la LD cuando el volumen total de los LD permanece constante. Por lo tanto, en aplicaciones donde se sospecha que el número o el tamaño de los D son de interés, esto debe abordarse con una técnica de aumento más alto y de menor rendimiento. Además, los organoides en el ensayo actual reciben estimulación lipídica basolateral, mientras que los lípidos dietéticos se toman típicamente en la membrana apical. Por lo tanto, se requiere cierta precaución si los resultados se traducen a la situación fisiológica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a B. Spee por proporcionar generosamente LD540. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Organización Neerlandesa de Investigación Científica (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) a S.M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-028
B27 supplement  Gibco 17504-044
Basement membrane matrix (matrigel) BD Biosciences 356231
DAPI Sigma-Aldrich D9542-1MG
DGAT1 inhibitor (AZD 3988) Tocris Bioscience 4837/10
Fatty acid free BSA Sigma-Aldrich A7030
Formaldehyde Klinipath 4078-9001
Glutamin (GlutaMAX, 100x) Gibco 15630-056
HEPES (1 M) Gibco 15630-080
Laser scanning confocal microscope Leica SP8X
LD540 kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University
mEGF Peprotech 315-09_500ug
N-acetyl cysteine Sigma-Aldrich A9165-100G
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636-500G
Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Oleic acid Sigma-Aldrich O1008-5G
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) Sigma-Aldrich S7067-25MG
PBS Sigma-Aldrich D8662-500ML
PBS without Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537-500ML
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) Gibco 15070-063
R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) R&D systems 3710-001-01
TC-treated 24 well plates Greiner-One 662160
TC-treated black clear-bottom 96 well plates Corning Life Sciences 353219
TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)  Tocris Bioscience 2939/10
Trypsin (TrypLE Express) Life Technologies 12604021
WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) Abcam ab120129-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
  2. Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
  3. D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
  4. Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
  5. Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
  6. van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
  7. Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
  8. Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
  9. Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
  10. Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
  11. Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
  12. Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
  13. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  14. Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
  15. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  18. Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
  19. Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).

Tags

Medicina Número 152 organoides intestinales humanos cultivo celular primario biopsia gotas de lípidos DGAT1 microscopía confocal
Un ensayo basado en fluorescencia para la caracterización y cuantificación de la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van Rijn, J. M., van Hoesel, M.,… More

van Rijn, J. M., van Hoesel, M., Middendorp, S. A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60150, doi:10.3791/60150 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter