Этот протокол описывает анализ для характеристики липидных капель (LD) формирования в человеческих кишечных органоидов при стимуляции жирными кислотами. Мы обсуждаем, как этот анализ используется для количественной оценки образования ЛД, и как он может быть использован для высокой пропускной связи скрининга на наркотики, которые влияют на образование ЛД.
Диетические липиды принимаются в качестве свободных жирных кислот (ФА) кишечным эпителием. Эти FAs внутриклеточные преобразуются в молекулы триглицеридов (TG), прежде чем они упакованы в chylomicrons для транспортировки в лимфу или в цитосолитовые липидные капли (ЛД) для внутриклеточного хранения. Решающим шагом для формирования ЛД является каталитическая активность диацилглицерола ацилтрансферазы (DGAT) в заключительном этапе синтеза TG. LDs важны для буфера токсичных видов липидов и регулировать клеточный метаболизм в различных типах клеток. Так как человеческий кишечный эпителий регулярно сталкивается с высокой концентрацией липидов, образование ЛД имеет большое значение для регулирования гомеостаза. Здесь мы описываем простой анализ для характеристики и количественной оценки образования ЛД (ЛДФ) при стимуляции с наиболее распространенными ненасыщенными жирными кислотами, олеиновой кислотой, в кишечных органоидах человека. Анализ LDF основан на LD-специфическом флуоресцентном красителе LD540, который позволяет количественно оценивать LDs конфокальной микроскопией, флуоресцентным считыванием пластин, или цитометрией потока. Анализ LDF может быть использован для характеристики образования ЛД в кишечных эпителиальных клетках человека, или для изучения человеческих (генетических) расстройств, которые влияют на метаболизм ЛД, таких как дефицит DGAT1. Кроме того, этот анализ может также быть использован в высокой пропускной связи для тестирования новых терапевтических соединений, которые восстанавливают дефекты в образовании ЛД в кишечнике или других типах органоидов.
Липиды являются важнейшим компонентом рациона человека и играют важную роль в системном хранении энергии и обмене веществ. При попавании, диетические липиды деградируют в свободные жирные кислоты (FFAs) и моноглицериды (MGs) поджелудочной липасы. Эти субстраты затем принимаются энтероцитов кишечного эпителия, где они впервые повторно эстерикрины диглицеридов (DG) моноглицерид acyltransferases (MGAT) ферментов, а затем триглицеридов (TG) по диацилглицерола ацилтрансфераза 1 (DGAT1)1. Наконец, эти TGs интегрированы в либо хиломикроны для экспорта в лимфодренаж или цитосолико липидных капель (LDs) для внутриклеточного хранения2,3. Хотя хиломикроны необходимы для распространения диетических липидов в другие органы, важность внутриклеточного хранения жира в ЛД не совсем ясно. Тем не менее, LDs было показано, чтобы выполнять регулятивные функции в кишечнике, так как они медленно высвобождают липиды в циркуляцию до 16 ч после еды4. Кроме того, Было показано, что ЛД защищают от токсичных концентраций жирных кислот, таких как адипоциты мыши во время липолицовых состояний5.
Белок DGAT1 расположен на эндоплазмической мембране ретикулума (ER) и играет решающую роль в формировании ЛД в эпителии кишечника. Гомозиготные мутации в DGAT1 приводят к раннему началу тяжелой диареи и/или рвоты, гипоальбуминемии и/или (смертельной) белково-терпящей энтеропатии с кишечной недостаточностью при жировом наедевидеи, иллюстрируя важность DGAT1 в липидном гомеостазах человека кишечный эпителий6,7,8,9,10. Поскольку возникновение дефицита DGAT1 у людей встречается редко, доступ к первичным клеткам, полученным пациентом, был скудным. Кроме того, долгосрочная культура кишечных эпителиальных клеток уже давно ограничивается опухолевыми клеточными линиями, которые представляют нормальную физиологию только в ограниченном плане. Таким образом, DGAT1-опосредованного образования ЛД в основном были изучены в фибробластов или животных полученных клеточных линий7,10,11,12. Таким образом, недавно было показано, что DGAT1-дефицитных пациента полученных фибробластов накапливаются меньше LDs по сравнению со здоровыми контрольными клетками после стимуляции с олеиновой кислотой (ОА)8.
Ранее были установлены протоколы для культуры эпителиальных стволовых клеток из любого желудочно-кишечного органа в виде трехмерных (3D) органоидов13. Эти кишечные органоиды могут храниться в культуре в течение длительного периода времени13, и позволяют функциональное исследование пациента и кишечного расположения конкретных эпителиальных характеристик14. Они генетически и фенотипически стабильны и могут храниться, что позволяет долгосрочное расширение и биобанкинг13.
Недавно мы показали, что образование ЛД может быть легко измерено в кишечных органоидов человека в формировании ЛД (LDF) анализ6. При воздействии ОА в течение 16 ч органоиды генерируют ЛД для защиты клеток от липидной токсичности. Когда концентрации ОА слишком высоки, клетки умирают от каспасопо-опосредованного апоптоза6. Ранее было показано, что ассси LDF в значительной степени зависит от DGAT1, о чем свидетельствуют органоиды, полученные от пациентов DGAT1-мутантов и использование ингибиторов DGAT1-специфических6.
Для анализа LDF, подробно описанного здесь, 3D органоиды культивируются из кишечной биопсии и проходят еженедельно путем нарушения в одиночных клетках, которые легко образуют новые органоиды. Для выполнения dF-ассссса, 7500 одиночных клеток, полученных от органоидов, покрываются в каждом колодце 24-колодца пластины. Органоиды образуются в течение нескольких дней, инкубируется на ночь с 1 мМ ОА и окрашенных LD540, флуоресцентные клетки проницаемой LD-специфический краситель, который облегчает визуализацию. Формирование ЛД затем количественно конфокальной микроскопии, флуоресцентные пластины читателя, или поток цитометрии.
Путем масштабировать это испытание образования LD к формату 96-наилучшим образом, анализ можно также использовать для высокопроемного анализа образования LD для того чтобы экранировать для новых снадобиь которые влияют на образование LD в людских кишечных органоидных культурах, или изучить (людской генетические) разлады которые влияют на Метаболизм ЛД.
Здесь мы предоставляем протокол для определения образования ЛД в кишечных органоидах человека при инкубации олеиновой кислотой. Этот метод основан на LD-специфическом флуоресцентном красителе LD54018, который позволяет охарактеризовать и количественно определить общий объ?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим B. Spee за щедрое предоставление LD540. Эта работа была поддержана Нидерландской организацией по научным исследованиям гранта (НВО-ЗонМ; VIDI 016.146.353) до S.M.
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |