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Un saggio basato sulla fluorescenza per la caratterizzazione e la quantificazione della formazione di gocciolini di lipidi negli organiidi intestinali umani

Published: October 13, 2019 doi: 10.3791/60150
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Division of Pediatrics, Department of Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 2Regenerative Medicine Center, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 3Science for Life Laboratory, Department of Medical Biochemistry and Microbiology, Uppsala University

Summary

Questo protocollo descrive un saggio per la caratterizzazione della formazione di goccioline lipidi (LD) negli organoidi intestinali umani dopo la stimolazione con acidi grassi. Discutiamo di come questo saggio viene utilizzato per la quantificazione della formazione di LD, e come può essere utilizzato per lo screening ad alta produttività per i farmaci che influenzano la formazione di LD.

Abstract

I lipidi dietetici sono assunti come acidi grassi liberi (FU) dall'epitelio intestinale. Queste FA sono convertite intracellulare in molecole di trigliceridi (TG), prima di essere confezionate in chylomicron per il trasporto alla linfa o in goccioline lipidiche citosoliche (LD) per lo stoccaggio intracellulare. Un passo cruciale per la formazione dei LD è l'attività catalitica degli acylglycerol acyltransferases (DGAT) nella fase finale della sintesi TG. Gli LD sono importanti per tamponare le specie di lipidi tossiche e regolare il metabolismo cellulare in diversi tipi di cellule. Poiché l'epitelio intestinale umano si confronta regolarmente con alte concentrazioni di lipidi, la formazione di LD è di grande importanza per regolare l'omeostasi. Qui descriviamo un semplice saggio per la caratterizzazione e la quantificazione della formazione di LD (LDF) sulla stimolazione con l'acido grasso insaturi più comune, l'acido oleico, negli organoidi intestinali umani. L'analisi LDF si basa sul colorante fluorescente LD LD, che consente la quantificazione degli LD mediante microscopia confocale, lettore di lastre fluorescenti o citometria a flusso. L'analisi LDF può essere utilizzata per caratterizzare la formazione di LD nelle cellule epiteliali intestinali umane, o per studiare disturbi umani (genetici) che influenzano il metabolismo dell'LD, come la carenza di DGAT1. Inoltre, questo saggio può essere utilizzato anche in una pipeline ad alta produttività per testare nuovi composti terapeutici, che ripristinano i difetti nella formazione di LD in intestinali o altri tipi di organoidi.

Introduction

I lipidi sono una componente cruciale della dieta umana e svolgono un ruolo importante nello stoccaggio e nel metabolismo dell'energia sistemica. Quando ingeriti, i lipidi dietetici vengono degradati in acidi grassi liberi (FFA) e monogliceridi (MG) da lipasi pancreatici. Questi substrati vengono poi assorbiti dagli enterociti dell'epitelio intestinale, dove vengono prima ri-esterismi a diglycerides (DG) da enzimi di aciltrasferidi monoglicetri (MGAT) e successivamente ai trigliceridi (TG) dal diacilglicerolo acyltransferase 1 (DGAT1)1. Infine, questi TG sono integrati in chilomicroni per l'esportazione nel sistema linfatico o goccioline lipidici citosoliche (LD) per l'immagazzinamento intracellulare2,3. Anche se i chilomicron sono necessari per distribuire i lipidi dietetici ad altri organi, l'importanza dell'immagazzinamento di grasso intracellulare nelle LD non è completamente chiara. Tuttavia, gli LD hanno dimostrato di svolgere una funzione regolatore nell'intestino, in quanto rilasciano lentamente i lipidi nella circolazione fino a 16 h dopo un pasto4. Inoltre, gli LD hanno dimostrato di proteggere contro le concentrazioni di acidi grassi tossici, come negli adipociti del topo durante le condizioni lipolisite5.

La proteina DGAT1 si trova sulla membrana del reticolo endoplasmico (ER) e svolge un ruolo cruciale nella formazione di LD nell'epitelio intestinale. Le mutazioni omozygose nel DGAT1 portano a diarrea grave e/o vomito, ipoalbuminemia e/o enteropatia (fatale) di proteine con insufficienza intestinale all'assunzione di grassi, illustrando l'importanza del DGAT1 nell'omeostasi lipidica dell'uomo epitelio intestinale6,7,8,9,10. Poiché il verificarsi di carenza di DGAT1 negli esseri umani è raro, l'accesso alle cellule primarie derivate dal paziente è stato scarso. Inoltre, la coltura a lungo termine delle cellule epiteliali intestinali è stata a lungo limitata alle linee cellulari derivate dal tumore che rappresentano la fisiologia normale solo in misura limitata. Pertanto, la formazione di LD mediata da DGAT1 è stata studiata principalmente nei fibroblasti o nelle linee cellulari di origine animale7,10,11,12. Come tale, è stato recentemente dimostrato che i fibroblasti derivati dal paziente Degrado di DGAT1 accumulano meno LD rispetto alle cellule di controllo sane dopo la stimolazione con acido oleico (OA)8.

In precedenza, sono stati stabiliti protocolli per coltura cellule staminali epiteliali da qualsiasi organo gastrointestinale sotto forma di organoidi tridimensionali (3D)13. Questi organoidi intestinali possono essere tenuti in coltura per un lungo periodo di tempo13, e consentire lo studio funzionale delle caratteristiche epiteliali specifiche del paziente e del luogo intestinale14. Sono geneticamente e fenotipicamente stabili e possono essere immagazzinati, consentendo l'espansione a lungo termine e il biobanking13.

Recentemente abbiamo dimostrato che la formazione di LD può essere facilmente misurata negli organoidi intestinali umani in un assaggioLD(LDF) 6 . Quando esposti a OA per 16 h, gli organoidi generano LD per proteggere le cellule dalla tossicità indotta dai lipidi. Quando le concentrazioni di OA sono troppo elevate, le cellule muoiono per apoptosi mediata dalla caspasi6. Il saggio LDF è stato precedentemente dimostrato essere in gran parte dipendente dal DGAT1 come indicato dagli organoidi derivati da pazienti mutanti DGAT1 e dall'uso di inibitori specifici di DGAT16.

Per il saggio LDF descritto in dettaglio qui, gli organoidi 3D sono coltivati da biopsie intestinali e vengono passati settimanalmente da interruzioni in singole cellule che formano facilmente nuovi organoidi. Per l'esecuzione del saggio LDF, 7.500 celle singole derivate da organoidi sono placcate in ogni pozzo di una piastra di 24 pozze. Gli organiidi si formano nel corso di diversi giorni, incubati durante la notte con 1 mM OA e macchiati con LD540, un coloranti fluorescente specifico per le cellule LD che facilita l'imaging. La formazione di LD viene quindi quantificata mediante microscopia confocale, lettore di piastre fluorescenti o citometria a flusso.

Scalando questo saggio di formazione LD in un formato di 96 pozzi, l'analisi può essere utilizzato anche per l'analisi ad alta velocità della formazione di LD per lo screening di nuovi farmaci che influenzano la formazione di LD nelle colture organoidi intestinali umane, o per studiare disturbi (genetici umani) che colpiscono metabolismo LD.

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Protocol

Tutte le sperimentazioni con tessuti umani qui descritti sono state approvate dal comitato etico dell'University Medical Center Utrecht (UMCU). Il consenso informato per la raccolta, la generazione, lo stoccaggio e l'uso degli organoidi è stato ottenuto dai pazienti presso l'Ospedale pediatrico Wilhelmina (WK) -UMCU.

1. Preparazione dei mezzi di coltura

NOT: Questo protocollo deve essere eseguito all'interno di un armadio di biosicurezza. Gli organoidi devono essere maneggiati secondo le linee guida standard per la coltura cellulare.

  1. Preparare il mezzo di coltura basale.
    NOTA:     il mezzo di coltura senza fattori di crescita è indicato come mezzo basale (BM).
    1. Aggiungere 5 mL di HEPES (1 M), 5 mL di L-glutamin (100x) e 5 mL di penicillina-streptomicina (5.000 U/mL) a 500 mL di mezzo Avanzato Aquila di Dulbecco modificato con la miscela nutritiva F-12 di Ham per preparare il mezzo nutritivo BM.
    2. Conservare il supporto BM preparato a 4 gradi centigradi e utilizzare per un massimo di 2 mesi.
  2. Preparare R-spondin e Noggin condizionato medio (CM) secondo il protocollo del produttore.
    1. In breve, far crescere le cellule fino alla quantità desiderata in iperflasks con 5 x 107 cellule in mezzo da 555 mL senza antibiotico selettivo per fiaschetta.
    2. Far crescere le cellule per 4 giorni fino a confluente.
    3. Sostituire il supporto con BM e la cultura per 8 giorni aggiuntivi.
    4. Dopo 8 giorni di coltura a 37 gradi centigradi, raccogliere il mezzo di coltura e centrifugare per 5 min a 450 x g per pellet eventuali cellule rimanenti.
    5. Filtro sterilizzare il supernatante, e memorizzare i negozi di R-spondin o Noggin CM a -20 gradi centigradi aliquota per un massimo di 6 mesi.
  3. Preparare il Wnt3A-CM secondo Boj etal.
    1. In breve, far crescere le cellule fino alla quantità desiderata in piatti da 145 mm con 2 x 106 cellule in mezzo da 20 mL senza antibiotico selettivo per piatto. Avvolgere ogni piatto con un foglio di plastica per evitare l'evaporazione del mezzo di coltura.
    2. Dopo 8 giorni di coltura a 37 gradi centigradi, raccogliere il mezzo di coltura e centrifugare per 5 min a 450 x g per pellet eventuali cellule rimanenti.
    3. Filtro sterilizzare il supernatante, e memorizzare i depositi del Wnt3A-CM a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 mesi aliquota.
  4. Preparare il mezzo di espansione organoide.
    NOTA:     Il piccolo mezzo di espansione organoide intestinale umano (vedi ricetta nella Tabella supplementare 1) è indicato come hSI-EM. I seguenti passaggi produrranno un volume finale di 1 L hSI-EM e possono essere scalati verso l'alto o verso il basso in base alle esigenze.
    1. Sciogliere 1,46 g di nicotinamide in 12 mL di salina con buffer di fosfato (PBS) di tipo coltura cellulare per creare una diluizione finale di 1 M.
    2. Sciogliere 245 mg di cisteina n-acetici in 3 mL di coltura cellulare grado PBS per creare una diluizione finale di 500 mM.
      NOT: Per accelerare la formazione di una soluzione, la cisteina di nicotinamide e n-acetil può essere incubata in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi. Entrambe le soluzioni possono essere preparate in batch, sottoposte a aliquota e conservate a -20 gradi centigradi per un uso futuro.
    3. Filtro sterilizzare entrambe le soluzioni attraverso un filtro 0,22 m in uno sterile tubo da 15 mL.
    4. Aggiungere 167 mL di BM a un fiaschetta medio di coltura sterile da 500 mL. Aggiungere 200 mL di R-Spondin-CM, 100 mL di noggin-CM e 100 l di mEGF ricombinante (500 g/mL) ad una concentrazione finale di 50 ng/mL.
    5. Aggiungere 10 mL della soluzione sterilizzata di nicotinamide e 2,5 mL della soluzione di cisteine n-acetile sterilizzata. Aggiungere 20 mL di supplemento B27 (50x).
      NOT: In questa fase, il mezzo è indicato come hSI-EM senza WAS (Wnt3A-CM, A83-01 e SB202190), e può essere macchiato e conservato a -20 gradi centigradi. Se il supporto è aliquota in volumi più piccoli, regolare di conseguenza le concentrazioni dei seguenti passaggi.
    6. A 500 mL di hSI-EM senza WAS, aggiungere 10 mL di Wnt3A-CM dell'ultimo lotto appena preparato e 10 mL di Wnt3A-CM del penultimo lotto per ridurre al minimo i cambiamenti di variabilità nelle condizioni di Wnt3A-CM.
    7. Aggiungere l'A83-01 ad una concentrazione finale di 500 nM, e SB202190 ad una concentrazione finale di 10 M.
    8. Conservare l'hSI-EM preparato (con WAS) a 4 gradi centigradi e utilizzare per un massimo di 2 settimane.
      NOT: Aggiungere ulteriore Y-27632 ad una concentrazione finale di 10 M (noto come hSI-EM-Y) quando le cripte o le singole cellule sono coltivate o gli organoidi vengono avviati dalla crioconservazione.
  5. Preparare il buffer di ordinamento delle celle attivate fluorescente (FACS).
    1. Aggiungere 10 mL di siero di vitello fetale (FCS) a 40 mL di PBS senza Ca2o/Mg2 per una concentrazione finale del 10% di FCS.
      NOT: L'FCS impedisce alle cellule di aderire al labware.

2. Procedure culturali per gli organiditi intestinali di piccole dimensioni umane

NOT: Questo protocollo deve essere eseguito all'interno di un armadio di biosicurezza. Gli organoidi devono essere maneggiati secondo le linee guida standard per la coltura cellulare. Quando si maneggiano organoidi o cellule derivate da organoidi, le cellule devono essere tenute sul ghiaccio quando possibile. Le cellule rimarranno vitali per alcune ore dopo la raccolta quando questo è assicurato. Gli organiidi devono essere coltivati in un'incubatrice a coltura cellulare standard a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2. Queste condizioni si applicano a tutte le fasi di incubazione con organoidi incorporati nella matrice della membrana seminterrato (BMM; cioè, Matrigel) in tutto questo protocollo. Gli autori hanno usato organoidi derivati da duodenum per questi saggi.

  1. Organoidi passaging
    nota    : ogni cultura organoide ha il suo tempo di raddoppio. Normalmente, piccoli organoidi intestinali possono essere passaggi 1:3,1:5 ogni 7/10 giorni. Quando si passa come singole celle, l'efficienza di passaggio può essere fino a 1:20, a seconda della densità cellulare. Per la creazione e la manutenzione, gli organoidi sono coltivati in piastre 24-pozzo; per il saggio LDF, in piatti da 24 o 96 pozze.
    1. preparazione
      1. Preriscaldare le lastre di coltura tissutale di24 pozze in un'incubatrice a 37 gradi centigradi, il 5 % di CO2 almeno durante la notte e preferibilmente con 5 giorni di anticipo.
        NOT: Pre-riscaldare le piastre di coltura dei tessuti nell'incubatrice di coltura cellulare garantisce una corretta formazione e attaccamento delle goccioline contenenti organoidi di BMM.
      2. Per ridurre il numero di cicli di congelamento-scongelamento, preparare 1 mL aliquote di BMM e conservare a -20 gradi centigradi. Scongelare una fiala di BMM sul ghiaccio almeno 30 min prima di iniziare la procedura di passaggio degli organoidi.
      3. Tenere un tubo da 50 mL di BM sul ghiaccio come mezzo di lavaggio.
      4. Preparare hSI-EM come descritto nella sezione 1.4 e preparare una quantità appropriata di hSI-EM-Y, ad esempio 15 mL per una piastra completa di 24 pozze.
    2. Raccogliere organoidi.
      1. Aspirare con attenzione il mezzo di coltura senza disturbare le goccioline di BMM.
      2. Aggiungere 500 - di BM freddo al primo pozzo di organoidi e rompere le goccioline BMM con organoidi pipettando delicatamente su e giù con un pipet P1000.
      3. Ripetere questa procedura con lo stesso mezzo nel successivo e come richiesto, ma non raccogliere più di 2 pozzi per 500 -L di BM.
      4. Raccogliere gli organoidi in un tubo di microcentrifuga a bassa legatura da 1,5 mL e ruotare verso il basso in una mini centrifuga da tavolo per 15-20 s (massimo 2.000 x g). Aspirare completamente il supernatante e rimuovere l'ultimo bit di mezzo con un pipet P200.
        NOT: Quando le colture di organoidi sembrano pulite al microscopio e non contengono cellule morte o altri detriti, le gocce di BMM possono essere raccolte direttamente in trypsin invece che bM al punto 2.1.2.2. Dopo il passaggio 2.1.2.3, procedere direttamente all'incubazione nel passaggio 2.1.3.1.
    3. Dissociare gli organoidi in singole cellule.
      1. Aggiungere 400 litri di prove ptopsina agli organoidi. Incubare gli organoidi a 37 gradi centigradi per 5 min in un bagno d'acqua.
      2. Interrompere gli aggregati rimanenti di cellule pipeting su e giù delicatamente con un pipet P200. Ancora una volta, incubare gli organoidi a 37 gradi centigradi per 5 min in un bagno d'acqua.
      3. Controllare l'avanzamento della dissociazione cellulare al microscopio utilizzando l'ingrandimento 4x. Ripetere la perturbazione manuale e l'incubazione quando rimangono grandi ciuffi di cellule.
      4. Quando rimangono solo celle singole, aggiungere 1 mL di BM e ruotare verso il basso le celle in una mini centrifuga da tavolo per 15-20 s.
      5. Aspirare completamente il super-attuoso. Risospendere le singole celle in 200 -L di hSI-EM fresco utilizzando un pipet P200. Aggiungete altri 800 l di hSI-EM.
      6. Contare il numero di celle in sospensione.
        NOT: Nel laboratorio degli autori, il conteggio manuale delle cellule organoidi dissociate produce risultati più affidabili rispetto a un contatore cellulare automatizzato. Quando si utilizza un contatore cellulare automatizzato, la densità delle cellule per le applicazioni a valle deve essere testata internamente e regolata se crescono troppo pochi o troppi organoidi.
    4. organoidi di semi per il mantenimento o il saggio di formazione delle goccioline lipidiche.
      1. Calcolare il volume delle celle che è necessario per la densità finale delle cellule.
        NOT: Circa 250 cellule/L è una densità appropriata. In una piastra di 24 pozze, più di 30 l viene seminato in ogni pozzo, mentre 5 l è semi in ogni pozzo di una piastra di 96 pozze.
      2. Estrarre il volume appropriato della sospensione e regolare la densità a 750 celle/L (o ruotare verso il basso e rispendere quando la densità è troppo bassa).
      3. Aggiungere BMM alla sospensione cellulare in un rapporto di 2:1. La densità cellulare finale in questa miscela è di 250 celle/l. Mescolare delicatamente le sospensioni pipettando, evitando con attenzione eventuali bolle.
      4. In una piastra preriscaldata di coltura tissutale, si esprimono tre goccioline da 10 lper pozzo in una piastra di 24 pozzetti o in una singola goccia di 5 luna per pozzo in una piastra di 96 pozzetti.
      5. Collocare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi centigradi, 5% di CO2 per 10-15 min per solidificare le goccioline di BMM. Nel frattempo, preriscaldare un'adeguata quantità di hSI-EM-Y in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
      6. Aggiungere con cura 500 l di hSI-EM-Y preriscaldato ad ogni pozzetto di una piastra di 24 pozzetti o 100 L a ciascun pozzo di una piastra di 96 pozze. Incubare le cellule in un'incubatrice a 37 gradi centigradi, il 5% di CO2 e dopo 2/3 giorni cambiare il mezzo in hSI-EM (senza Y) e rinfrescarsi 2/3 volte a settimana.
        NOT: Dopo 7-10 giorni, una coltura di mantenimento degli organoidi dovrebbe essere di nuovo accompagnata.

3. Saggio sulla formazione di gocciolini di lipidi

  1. Preparazione di coniugato di acido oleico
    NOTA:     Poiché l'acido oleico (OA) è idrofobico e non solubile in acqua, è coniugato all'albumina del siero bovino (BSA). BSA può legare più molecole di acidi grassi ed è in questo caso utilizzato in un rapporto 1:8 per rendere l'acido oleico accessibile alle cellule intestinali. Gli acidi grassi liberi e la BSA possono entrambi legarsi ai labware in plastica. Per garantire una corretta concentrazione finale, utilizzare fiale di vetro e pipet di vetro quando possibile.
    1. Pesare 0,2 g di acido oleico liquido a temperatura ambiente. Aggiungere 1,5 mL di PBS sterile di qualità coltura e riscaldare la miscela a 70 gradi centigradi per 1 h. Vortex ad intermittenza.
    2. Pesare 5,89 g di BSA privo di acidi grassi e sciogliere in 33,9 mL di PBS. Scaldare il composto in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi fino a completa dissoluzione della BSA.
    3. Vorticare nuovamente la miscela OA per creare un'emulsione di goccioline sottili e aggiungerla immediatamente alla soluzione BSA utilizzando un tubo di vetro. Mantenere la soluzione finale vicino a 37 gradi centigradi dopo l'aggiunta dell'OA. La miscela finale è composta da 20 mM OA in 2,5 mM BSA.
    4. Conservare il composto a 37 gradi centigradi per 30 min fino a quando non rimane una soluzione giallastra chiara.
    5. L'aliquota OA-BSA può essere congelata e congelata a -20 gradi centigradi per almeno 6 mesi. Al momento dello scongelamento di un'aliquota, incubarla a 37 gradi centigradi fino a quando la nuvolosità si dissolve e la miscela è di nuovo chiara.
      NOT: A causa dell'alto contenuto proteico e lipidico della soluzione finale, la miscela non può essere sterilizzata o autoclaved. Quando i componenti sono stati trattati con cura, in una cappa di flusso laminare quando possibile e utilizzando PBS sterile, gli autori non hanno avuto infezioni microbiche.
  2. LDF confocal assay
    1. Preparazione del campione
      1. Organoidi di passaggio come descritto nella sezione 2.1. Semina le singole cellule derivate da organoidi in una piastra nera chiara 96 po' di 96 pozze.
      2. Il sesto giorno della cultura su hSI-EM, sostituire il mezzo di coltura con hSI-EM contenente 1 mM di coniugazione OA-BSA.
      3. Incubare le cellule per 16-17 h (overnight) a 37 gradi centigradi in presenza o assenza di 0,1 M inibitore d'Enibitore d.M. Includere un controllo del veicolo di 2,5 mM BSA.
      4. Dopo 16-17 h, aspirare il mezzo senza disturbare le goccioline BMM. Fissare gli organoidi aggiungendo 100 luna del 4% di formaldeide tampone neutra ai pozzi per 30 min a temperatura ambiente.
        NOT: La formaldeide dissolverà parzialmente il BMM, mentre gli organoidi affondano sul fondo e aderiscono al fondo della piastra.
      5. Rimuovere delicatamente la formaldeide e lavare con cura i pozzetti con 150 gradi di PBS per pozzo.
      6. Macchiare le cellule per LD con 0.025 mg/mL LD540 e 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) in PBS per 15 min a temperatura ambiente al buio.
      7. Lavare i pozzi con attenzione con PBS.
        NOT: Il protocollo può essere sospeso qui quando necessario. Tenere i campioni coperti in PBS al buio a 4 gradi centigradi. La colorazione LD540 rimarrà stabile fino a una settimana. Questo saggio può essere eseguito anche con cellule vive, per monitorare la formazione di LD per un periodo di tempo. A tale scopo, la fissazione deve essere omessa dal protocollo e il DAPI deve essere sostituito con la colorazione Diviebbi. LD540 può macchiare I LD in cellule viventi nella stessa concentrazione descritta.
    2. Immagini confocali
      NOT: L'imaging può essere eseguito su campioni organoidi preparati nella piastra nera trasparente 96 po' di benrsa.
      1. Per una panoramica delle immagini di organiidi interi, utilizzare un obiettivo 40x adatto per l'imaging fluorescente confocale.
      2. Impostare il microscopio per l'immagine del canale DAPI a 405 nm eccitazione e c. 410-535 nm lunghezza d'onda di emissione. Per il tintura LD540, scegliere un laser di eccitazione a 540 nm (543 nm è ottimale) e impostare i filtri di emissione su 545-700 nm.
        NOT: In questo protocollo, è stato utilizzato un sistema confocale a scansione laser con laser a luce bianca, uno splitter acousto-ottico (AOBS), un obiettivo 10x/20x e un sistema di rilevamento spettrale. Ciò consente di regolare esattamente le lunghezze d'onda specifiche. Se non è disponibile un sistema comparabile, scegliere linee laser e filtri a passaggio corto/lungo vicino alle specifiche di cui sopra. Per l'imaging organoide intero, una risoluzione di 512 x 512 o 1024 x 1024 è sufficiente per l'analisi delle immagini a valle.
      3. Impostare la dimensione del foro stenopeico su 1 unità ariosa (AU) per una risoluzione sufficiente dell'asse z.
      4. Per immaginare la metà di un organoide sferico, impostare uno z-stack a circa 85 m.
    3. Analisi delle immagini
      NOT: Per l'analisi delle immagini, Fiji/ImageJ16,17 è stato utilizzato per generare il massimo delle proiezioni. L'analisi può essere eseguita con qualsiasi pacchetto software di analisi delle immagini che consenta la massima proiezione, la soglia manuale e l'analisi delle particelle.
      1. Utilizzando Fiji/ImageJ, trasformare lo z-stack di ogni organoide in una proiezione massima: Image Proprietà Stacks . Progetto z.
      2. Impostare la soglia della proiezione massima su un livello in cui non è visibile alcun segnale LD540 nel campione di controllo del veicolo BSA: Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Soglia. Utilizzare queste impostazioni per sogliere ogni immagine.
      3. Misurare l'area totale di fluorescenza per ogni proiezione massima utilizzando la funzione Analyze Analizzare le particelle.
        NOT: Anche se la risoluzione di analisi è migliore utilizzando un microscopio confocale, questo saggio può anche essere analizzato utilizzando un lettore di lamiere fluorescenti con filtri simili. Per normalizzare per il conteggio organoide per bene, il segnale LD540 deve essere diviso per il segnale DAPI. Infine, il segnale del controllo del veicolo BSA deve essere sottratto per normalizzare le misurazioni. Questo approccio consente di scalare il saggio verso un formato a lamiera da 96 pozze.
  3. Saggio citometrico del flusso LDF
    1. Preparazione del campione
      1. Organoidi di passaggio come descritto nella sezione 2.1. Semina le singole cellule derivate da organoidi in una piastra di coltura tissutale di 24 pozze. Due pozzetti per condizione sono sufficienti per la citometria di flusso.
      2. Il giorno 10 della cultura su hSI-EM, sostituire il mezzo di coltura con hSI-EM contenente 1 mM di coniugato OA-BSA.
        NOT: A differenza dell'analisi confocale, sono stati scelti 10 giorni di crescita nei mercati em per il saggio di citometria di flusso invece di 6 giorni. I 4 giorni supplementari di espansione si tradurranno in organoidi ottivamente sovrapposti che complicherebbero il saggio basato sulla microscopia. Tuttavia, il maggior numero di cellule facilita l'analisi della citometria di flusso.
      3. Incubare le cellule per 16-17 h (overnight) a 37 gradi centigradi in presenza o assenza di 0,1 M inibitore d'Enibitore d.M. Includere un controllo del veicolo di 2,5 mM BSA.
      4. Dopo 16-17 h, raccogliere gli organoidi come descritto nella sezione 2.1.2.
      5. Dissociare gli organoidi in singole cellule come descritto nella sezione 2.1.3.
        NOT: Anche se non è strettamente richiesto, si consiglia di controllare il numero di celle in ogni campione. Un numero totale di 10.000 celle per campione è il minimo assoluto richiesto per una risoluzione sufficiente. Per ottenere risultati ottimali, utilizzare 50.000-100.000 di celle.
      6. Girare verso il basso le cellule in una mini centrifuga da tavolo per 15-20 s.
      7. Macchiare ogni campione con 500 mg/mL L di 0,025 mg/mL LD540 e 1 G/mL Hoechst in PBS per 15 min a temperatura ambiente al buio.
      8. Girare le celle in una mini centrifuga da tavolo per 15-20 s e lavare 3x con PBS.
      9. Fissare le cellule rispendendole in 500 : L del 4% di formaldeide tampone neutra per 15 min a temperatura ambiente.
      10. Abbassare le cellule e lavare 3x con TACt.
      11. Pre-risciacquo tubi FACS con tampone FACS per evitare che le cellule si attacchino alla parete del tubo.
      12. Risospendere le cellule in 200 o l di TAC tampone e trasferire la sospensione cellulare ai tubi FACS pre-rinsioni.
    2. Analisi citometrica del flusso
      1. Impostare i parametri di gating per escludere le celle morte e i ciuffi di celle (vedere la sezione dei risultati rappresentativi).
      2. Nella popolazione recintata finale, misurare almeno 10.000 celle per risultati affidabili.
        NOT: Da questa popolazione, l'intensità media fluorescente (MFI) di LD540 e il segnale medio SSC-A forniscono insieme una misura del volume totale della formazione di LD per cellula.

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Representative Results

Per una corretta analisi della formazione di LD, gli organoidi non devono essere semipati troppo densamente prima della stimolazione con OA e successiva colorazione. Ciò è particolarmente importante per la lettura del lettore confocale e della piastra, poiché gli organoidi sovrapposti potrebbero interferire con la fluorescenza. Viene illustrato un esempio di corretta densità di seeding degli organididi ( Figura 1A) e di unacolturacon organoidi sovrapposti (Figura 1B). Per ridurre al minimo la variabilità nella stimolazione del campione con OA, la dimensione organoide e la densità di seeding dovrebbero essere comparabili tra i campioni all'interno di un esperimento. Questo è meglio controllato seminando un numero uguale di singole celle. Tuttavia, alcune regolazioni potrebbero essere necessarie se alcune linee organoidi mostrano costantemente una maggiore efficienza di ricostituzione e quindi un numero di organoidi costantemente superiore.

Dopo la stimolazione con 1 mM di OA durante la notte, la formazione di LD può essere visualizzata con un microscopio a campo luminoso invertito. L'accumulo di LD disperde la luce trasmessa, e quindi gli organoidi appaiono più scuri, mentre gli organoidi non stimolati hanno un aspetto traslucido (Figura 1C). Un esempio di formazione di LD come visto sotto un microscopio a campo luminoso è mostrato nella Figura 1D. Questo fenomeno può essere utilizzato per valutare le condizioni sperimentali prima della lettura di analisi fluorescente. Quando il campione di controllo positivo non è visivamente più scuro del campione di controllo negativo, o quando è evidente la morte estesa delle cellule, l'esperimento dovrebbe essere scartato. Poiché le FFA sono tossiche per le cellule in concentrazioni più elevate e la concentrazione letale differisce tra le specie di FFA, la concentrazione sublethal ottimale che induce la formazione di LD dovrebbe essere titolata per ogni applicazione.

Una volta che gli organoidi stimolati dall'OA sono fissati e macchiati secondo il protocollo, il LDF può essere visualizzato utilizzando un microscopio confocale. Poiché gli organoidi sono strutture 3D, un microscopio epifluorescente regolare non è adatto a causa del segnale di fondo fuori fuoco. Pertanto, abbiamo usato un (proiezione massima di a) z-stack confocal per caratterizzare LDF in organoidi. Figura 2A mostra un risultato rappresentativo della colorazione LD in organoidi di controllo sani che sono stati trattati con o senza un inibitore DGAT1. Sebbene la quantificazione di queste immagini sia laboriosa, l'analisi confocale serve principalmente come strumento di visualizzazione per verificare la formazione anomala di LD. La quantificazione dei campioni di microscopia confocale può essere eseguita anche utilizzando un lettore di lastre fluorescenti (Figura 2B), normalizzato al segnale fluorescente di Hoechst. Il test del lettore di placche indica una diminuzione significativa del segnale LD540 nelle cellule organoidi trattate con inibitore DGAT1 (D1i) rispetto agli organoidi non trattati.

La quantificazione della formazione di LD nelle singole cellule può essere ottenuta utilizzando il citometro di flusso. La strategia di gating utilizzata per gli organoidi intestinali umani dissociati è illustrata nella Figura 3A. Il primo passo di gating nel grafico FSC-A/SSC-A è una prima selezione di 'live' (quando fisso), singole celle. Per escludere ulteriormente doppietti, terzine o ciuffi cellulari più grandi, abbiamo incluso due ulteriori passaggi di gating su FSC-W/FSC-H e SSC-W/SSC-H. Infine, l'gating su FSC-A/Hoechst garantisce l'esclusione di tutte le cellule che erano morte o morenti prima della fissazione. Figura 3B,C mostra gli istogrammi sia del segnale SSC-A che del segnale LD540 della popolazione finale di cellule vive. LDF si tradurrà in un aumento di SSC-A a causa della formazione di goccioline lipidiche intracellulari. Inoltre, macchie LD540 per lipidi che sono memorizzati nelle LD e questo segnale aumenterà anche al momento dell'induzione LDF. Di conseguenza, la formazione di LD è misurata come spostamento nella MFI di SSC-A e LD540 (Figura 3D,E). Le FIM possono essere tracciate e utilizzate per eseguire analisi statistiche.

Figure 1
Figura 1: colture organoidi visualizzate dalla microscopia a campo luminoso. (A,B) Per i metodi di lettura della piastra confocale e fluorescente, è importante che gli organoidi non siano semiati in densità troppo elevata nella goccia BMM. (A) Gli organiidi sono seminati con una densità appropriata di 250 celle/L. (B) Gli organoidi sono stati seminati in una densità troppo elevata, causando la sovrapposizione di organoidi e la morte delle cellule. (C,D) Dopo la stimolazione notturna con OA, la formazione di LD può essere valutata visivamente. (C) Gli organiidi sono stati incubati durante la notte con il 12% di controllo del veicolo BSA. (D) Gli organoidi sono stati incubati durante la notte con 1 mM OA coniugato alla BSA, con conseguente aspetto scuro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Risultati rappresentativi della caratterizzazione LDF utilizzando l'imaging confocale e un lettore di lastre fluorescenti. Gli organiidi sani derivati dal controllo sono stati stimolati durante la notte con BSA, 1 mM OA, o 1 mM OA-D1i. (A) Proiezione massima di 85 em pile confocali macchiate per DAPI (ciano) e LD540 (giallo). Questa sottofigura è adattata da van Rijn et al.6. (B) Intensità di fluorescenza relativa di LD540 normalizzata al segnale DAPI nucleare misurata utilizzando un lettore di lamiere fluorescenti. La Media è tracciata per due repliche biologiche. La rilevanza statistica è stata determinata utilizzando un ANOVA a senso unico senza misure ripetute con il post-hoc post-hoc di Un Tukey. P < 0,05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Risultati rappresentativi della quantificazione LDF mediante citometria di flusso. Gli organiidi sani derivati dal controllo sono stati stimolati durante la notte con BSA, 1 mM OA, o 1 mM OA-D1i. (A) Strategia di Gating per selezionare per singole cellule derivate da organoidi. Da sinistra a destra, prima escludere i detriti gating per FSC-A/SSC-A. Quindi cancello su FSC-W/FSC-H e SSC-W/SSC-H per escludere doppietti, terzine, o ciuffi più grandi di cellule. Infine, cancello per FSC-A/ Hoechst per selezionare per le cellule vive. Entrambi i canali SSC-A e LD540 sono utilizzati per quantificare la formazione di LD. Gli istogrammi di questi parametri mostrano uno spostamento dell'intensità media della fluorescenza (MFI) di (B) SSC-A e(C)LD540 dopo la stimolazione con OA. (D,E) Le MEPer per campione possono essere tracciate in un grafico e utilizzate per eseguire analisi statistiche. La SD è tracciata per tre repliche biologiche. La rilevanza statistica è stata determinata utilizzando un ANOVA a senso unico senza misure ripetute con il post-hoc post-hoc di Un Tukey. P < 0,05; P < 0,01; , P < 0.001. Questa cifra è adattata da van Rijn et al.6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

chimico Solvente Concentrazione di scorte Concentrazione finale
WNt3a CM - 100% 50%
R-spondin-1 CM - 100% 20%
Noggin CM - 100% 10%
A83-01 (TGF-inh) Dmso 50mm 500 nM
B27 (in questo - 50x 1x (in modo non il
MEGF PBS/0,1% BSA 500 g/mL 50 ng/mL
N-acetil acqua 500 mM 1,25 mM
Nicotinammide Pbs 1 M 10 mM
Primocina
(utilizzare fino a quando MCB è in freezer)		 - 50 mg/mL 100 g/mL
SB202190 (P38 inh) Dmso 30 mM 10 M

Tabella supplementare 1: Ricetta per il mezzo di espansione organoide.

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Discussion

Qui, forniamo un protocollo per determinare la formazione di LD negli organoidi intestinali umani in caso di incubazione con acido oleico. Questo metodo si basa sul coloranti fluorescente LD54018specifico di LD, che consente la caratterizzazione e la quantificazione del volume totale delle goccioline lipidiche all'interno di una coltura organoide. Le procedure per stabilire e mantenere le colture organoide intestinali umane sono state pubblicate prima delle13,ed è disponibile anche una guida visiva di questo protocollo15.

I passi cruciali in questo protocollo sono la coltura degli organoidi intestinali umani e la corretta coniugazione tra OA e BSA. La coltura degli organoidi richiede una corretta formulazione del mezzo di coltura, poiché il mantenimento di una popolazione di cellule staminali è fortemente dipendente dal funzionamento Wnt3A-CM. Quando Wnt3A-CM viene realizzato internamente, si consiglia un flusso di lavoro altamente standardizzato e la produzione mensile di mezzi condizionati a causa del tempo di scadenza di circa 2 mesi. Inoltre, la miscelazione 1:1 di lotti consecutivi Wnt3A-CM si traduce in una cultura più costante a lungo termine, in quanto assicura che un lotto leggermente sub-ottimale non avrà un impatto importante sulla crescita degli organiidi.

Inoltre, il nostro BM è costituito da un mezzo DMEM/F12 avanzato, che contiene BSA ricchi di lipidi. Poiché il nostro controllo del veicolo (12% BSA/BM) non induce la formazione di LD negli organoidi, concludiamo che la quantità o il tipo di FFA in BM non è sufficiente a influenzare il saggio LDF.

La coniugazione di OA a BSA è un processo delicato che potrebbe richiedere una certa ottimizzazione. Abbiamo sperimentato che il protocollo qui descritto è più ottimale quando tutti i cambiamenti di temperatura sono seguiti meticolosamente e quando eseguita utilizzando labware di vetro.

In precedenti ricerche, i saggi di formazione LD sono stati utilizzati per caratterizzare le dimensioni e il numero di LD con alto ingrandimento8,12. Questi saggi sono stati per lo più eseguiti utilizzando boron-dipyrromethene (BODIPY) 493/503, che fornisce un'eccellente colorazione per gli LD con alto rapporto segnale-rumore. Tuttavia, lo spettro di emissione di BODIPY è piuttosto ampio e si sovrappone in gran parte allo spettro fluorescente dei coloranti derivati dalle proteine fluorescenti verdi (GFP). Anche se ci aspettiamo che l'attuale applicazione del saggio LDF funzionerebbe anche con BODIPY, la scelta per LD540 consente una più ampia gamma di immagini multicolore, tra cui la co-colorazione con le etichette GFP18. Abbiamo anche eseguito questo saggio utilizzando la macchia lipida Nile rosso (dati non mostrati). Tuttavia, poiché il rosso del Nilo tende a macchiare non solo l'LD ma anche i bistrati lipidici, abbiamo scoperto che il segnale di fondo più alto del rosso del Nilo riduce la capacità del nostro saggio di distinguere piccole differenze di formazione di LD. Per questi motivi, preferiamo usare LD540 in un saggio LDF basato su organoide.

Rispetto a studi precedenti che utilizzano saggi LDF ad alto ingrandimento, l'esempio che descriviamo qui consente la quantificazione ad alto throughput del volume totale di LD in una grande popolazione di cellule. Pertanto, in particolare la quantificazione del lettore di piastre fluorescenti, e potenzialmente l'analisi citometrica del flusso, può essere scalata per testare l'effetto dei farmaci sulla formazione di LD. Come abbiamo dimostrato che la formazione di LD dipende in gran parte da DGAT1, i pazienti derivati dal paziente o gli organoi-D1i, che rappresentano una chiara opportunità per l'applicazione di tale screening. Soprattutto per tali malattie rare, il saggio LDF combinato con organoidi derivati dal paziente potrebbe fornire una piattaforma per lo screening specifico del paziente per nuovi farmaci terapeutici.

Tuttavia, una conseguenza di un approccio ad alta velocità effettiva è che la potenza di caratterizzare i singoli LD viene persa. Mentre la visualizzazione microscopica o fluorescente ad alto ingrandimento degli elettroni microscopici o fluorescenti degli LD può essere utilizzata per studiare la dinamica delle dimensioni e del numero12diLD,19, l'approccio ad alta velocità effettiva non distingue tra più piccole o meno grandi LD e quindi non possono essere utilizzati per quantificare le differenze nel metabolismo LD dove il volume totale di LD rimane costante. Pertanto, nelle applicazioni in cui si sospetta che il numero o la dimensione degli LD siano di interesse, questo dovrebbe essere affrontato con una tecnica di ingrandimento più bassa e a bassa velocità effettiva. Inoltre, gli organoidi nel saggio corrente ricevono la stimolazione dei lipidi basolaterali mentre i lipidi dietetici sono tipicamente assorbiti dalla membrana apicale. È quindi necessaria una certa cautela se i risultati devono essere tradotti nella situazione fisiologica.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo B. Spee per aver generosamente fornito LD540. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO-eonMW; VIDI 016.146.353) a S.M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-028
B27 supplement  Gibco 17504-044
Basement membrane matrix (matrigel) BD Biosciences 356231
DAPI Sigma-Aldrich D9542-1MG
DGAT1 inhibitor (AZD 3988) Tocris Bioscience 4837/10
Fatty acid free BSA Sigma-Aldrich A7030
Formaldehyde Klinipath 4078-9001
Glutamin (GlutaMAX, 100x) Gibco 15630-056
HEPES (1 M) Gibco 15630-080
Laser scanning confocal microscope Leica SP8X
LD540 kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University
mEGF Peprotech 315-09_500ug
N-acetyl cysteine Sigma-Aldrich A9165-100G
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636-500G
Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Oleic acid Sigma-Aldrich O1008-5G
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) Sigma-Aldrich S7067-25MG
PBS Sigma-Aldrich D8662-500ML
PBS without Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537-500ML
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) Gibco 15070-063
R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) R&D systems 3710-001-01
TC-treated 24 well plates Greiner-One 662160
TC-treated black clear-bottom 96 well plates Corning Life Sciences 353219
TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)  Tocris Bioscience 2939/10
Trypsin (TrypLE Express) Life Technologies 12604021
WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) Abcam ab120129-10

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References

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Medicina Numero 152 organoidi intestinali umani coltura cellulare primaria biopsia goccioline di lipidi DGAT1 microscopia confocale
Un saggio basato sulla fluorescenza per la caratterizzazione e la quantificazione della formazione di gocciolini di lipidi negli organiidi intestinali umani
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van Rijn, J. M., van Hoesel, M., Middendorp, S. A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60150, doi:10.3791/60150 (2019).

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