Een op fluorescentie gebaseerde assay voor de karakterisering en kwantificering van de vorming van lipiden druppeltjes in humane intestinale Organoïden
Summary
Dit protocol beschrijft een assay voor de karakterisering van lipide druppel (LD) vorming in humane intestinale organoïden bij stimulatie met vetzuren. We bespreken hoe deze assay wordt gebruikt voor de kwantificering van LD-vorming, en hoe het kan worden gebruikt voor screening met hoge doorvoer voor geneesmiddelen die de LD-vorming beïnvloeden.
Abstract
Dieet lipiden worden ingenomen als vrije vetzuren (FAs) door het intestinale epitheel. Deze FAS zijn intracellulair omgezet in triglyceriden (TG) moleculen, voordat ze worden verpakt in chylomicronen voor transport naar de lymfe of in cytosolische lipide druppels (LDS) voor intracellulaire opslag. Een cruciale stap voor de vorming van LDs is de katalytische werking van diacylglycerolacyltransferases (DGAT) in de laatste stap van TG-synthese. LDs zijn belangrijk voor de buffer van toxische lipiden soorten en reguleren van cellulaire metabolisme in verschillende celtypen. Omdat het menselijke darm epitheel regelmatig wordt geconfronteerd met hoge concentraties van lipiden, is LD-vorming van groot belang om homeostase te reguleren. Hier beschrijven we een eenvoudige assay voor de karakterisering en kwantificering van LD-vorming (LDF) bij stimulatie met het meest voorkomende onverzadigde vetzuren, oliezuur, in humane intestinale organoïden. De LDF-test is gebaseerd op de LD-specifieke fluorescerende kleurstof LD540, die het mogelijk maakt om LDs te kwantificeren met confocale microscopie, fluorescerende plaat lezer of flow-cytometrie. De LDF-test kan worden gebruikt om LD-vorming in menselijke intestinale epitheelcellen te karakteriseren, of om menselijke (genetische) aandoeningen te bestuderen die het LD-metabolisme beïnvloeden, zoals DGAT1-deficiëntie. Bovendien kan deze test ook worden gebruikt in een pijpleiding met hoge doorvoer om nieuwe therapeutische verbindingen te testen, die defecten in LD-vorming in intestinale of andere soorten organoïden herstellen.
Introduction
Lipiden zijn een cruciaal onderdeel van het menselijk dieet en spelen een belangrijke rol in de systemische energieopslag en metabolisme. Wanneer geconsumeerd, dieet lipiden worden afgebroken in vrije vetzuren (FFAS) en monoglyceriden (MGS) door alvleesklier lipases. Deze substraten worden vervolgens ingenomen door de enterocyten van het intestinale epitheel, waar ze voor het eerst opnieuw veresterd worden naar diglyceriden (DG) door monoglyceriden acyltransferases (MGAT)-enzymen en vervolgens naar triglyceriden (TG) door diacylglycerol acyltransferase 1 (DGAT1)1. Tot slot, deze TGS zijn geïntegreerd in ofwel chylomicronen voor export naar het lymfestelsel of cytosolische lipide druppeltjes (LDS) voor intracellulaire opslag2,3. Hoewel chylomicronen nodig zijn om voedings lipiden naar andere organen te verdelen, is het belang van intracellulaire vetopslag in LDS niet helemaal duidelijk. Echter, LDs is aangetoond dat het uitvoeren van een regelgevende functie in de darm, als ze langzaam vrijkomen lipiden in de circulatie tot 16 h na een maaltijd4. Bovendien heeft LDs aangetoond dat het beschermt tegen toxische vetzuur concentraties, zoals bij muizen met de lipolytische condities5.
Het DGAT1 eiwit bevindt zich op het endoplasmisch reticulum (ER) membraan en speelt een cruciale rol in de LD-formatie in het intestinale epitheel. Homozygoot mutaties in DGAT1 leiden tot vroegtijdige ernstige diarree en/of braken, hypoalbuminemie en/of (fatale) proteïne-verliezen enteropathie met intestinale insufficiëntie bij vetopslag, ter illustratie van het belang van DGAT1 in lipide homeostase van de menselijke intestinale epitheel6,7,8,9,10. Sinds het optreden van DGAT1-deficiëntie bij de mens is zeldzaam, toegang tot primaire patiënt-afgeleide cellen is schaars. Bovendien, de lange-termijn cultuur van intestinale epitheliale cellen is al lange tijd beperkt tot tumor-afgeleide cellijnen die de normale fysiologie alleen voor een beperkte uitbreiding vertegenwoordigen. Daarom is DGAT1-gemedieerde LD-formatie meestal bestudeerd in fibroblasten of dierlijke cellijnen7,10,11,12. Als zodanig werd onlangs aangetoond dat DGAT1-deficiënte door patiënten afgeleide fibroblasten minder LDs accumuleren in vergelijking met gezonde controle cellen na stimulatie met oliezuur (OA)8.
Voorheen werden protocollen vastgesteld voor de kweek van epitheliale stamcellen uit elk gastro-intestinaal orgaan in de vorm van driedimensionale (3D) organoïden13. Deze intestinale organoïden kunnen worden bewaard in cultuur voor een lange periode van tijd13, en laat de functionele studie van patiënt-en intestinale locatie-specifieke epitheliale kenmerken14. Ze zijn genetisch en fenotypisch stabiel en kunnen worden opgeslagen, waardoor lange termijn expansie en biobankingen13.
We hebben onlangs aangetoond dat LD-vorming gemakkelijk kan worden gemeten in humane intestinale organoïden in een LD-formatie (LDF)-assay6. Bij blootstelling aan OA voor 16 uur genereren organoïden LDs om de cellen te beschermen tegen lipide-geïnduceerde toxiciteit. Wanneer OA concentraties te hoog zijn, sterven de cellen door caspase-gemedieerde apoptosis6. De LDF-test werd eerder aangetoond grotendeels afhankelijk te zijn van DGAT1, zoals aangegeven door organoïden afgeleid van DGAT1-Mutant patiënten en door het gebruik van DGAT1-specifieke remmers6.
Voor de in detail beschreven LDF-assay worden 3D-organoïden gekweekt uit intestinale biopsieën en worden wekelijks door een verstoring in afzonderlijke cellen geprikt die gemakkelijk nieuwe organoïden vormen. Voor het uitvoeren van de LDF-assay worden ~ 7.500 organoid-afgeleide enkelvoudige cellen in elk goed van een 24-put plaat verguld. Organoïden worden gevormd gedurende meerdere dagen, gebroed met een nacht met 1 mM OA en gekleurd met LD540, een fluorescerende cel-permeabele LD-specifieke kleurstof die Imaging vergemakkelijkt. De LD-formatie wordt vervolgens gekwantificeerd door confocale microscopie, fluorescerende plaat lezer of flow-cytometrie.
Door deze LD-formatie test te schalen naar een 96-well-indeling, kan de assay ook worden gebruikt voor analyses met een hoge doorvoer van LD-vorming naar het scherm voor nieuwe geneesmiddelen die de LD-vorming beïnvloeden in humane intestinale organoïde culturen, of om (menselijke genetische) aandoeningen te bestuderen die invloed hebben op LD metabolisme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier bieden we een protocol om LD-vorming in humane intestinale organoïden te bepalen bij incubatie met oliezuur. Deze methode is gebaseerd op de LD-specifieke fluorescerende kleurstof LD54018, die de karakterisering en kwantificering van het totale volume van lipide druppeltjes binnen een organoïde cultuur mogelijk maakt. De procedures voor het vaststellen en handhaven van humane intestinale organoïde culturen zijn gepubliceerd vóór13, en een visuele gids van dit prot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken B. Spee voor het royaal verstrekken van LD540. Dit werk werd gesteund door een Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek subsidie (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) naar S.M.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
- D’Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
- Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
- Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
- van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
- Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
- Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
- Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
- Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
- Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
- Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
- Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).
