ヒト腸オルガノイドにおける脂質液滴形成の特徴付けと定量化のための蛍光ベースアッセイ
Summary
このプロトコルは、脂肪酸による刺激時のヒト腸内オルガノイドにおける脂質液滴(LD)形成の特性評価に関するアッセイについて説明する。このアッセイがLD形成の定量にどのように使用され、LD形成に影響を与える薬剤の高スループットスクリーニングにどのように使用できるかについて議論する。
Abstract
食物脂質は、腸上皮によって遊離脂肪酸(FA)として取り上げられる。これらのFは、リンパへの輸送のためにキロミクロンに、または細胞内貯蔵のための細胞内貯蔵のための細胞内脂質液滴(LD)にパッケージ化される前に、細胞内トリグリセリド(TG)分子に変換されます。LDの形成のための重要なステップは、TG合成の最終ステップにおけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)の触媒活性である。LDは、有毒な脂質種をバッファーに入れ、異なる細胞タイプの細胞代謝を調節するために重要です。ヒト腸上皮は定期的に高濃度の脂質に直面しているので、LD形成は恒常性を調節することが非常に重要である。ここでは、ヒト腸内オルガノイドにおける最も一般的な不飽和脂肪酸、オレイン酸による刺激時のLD形成(LDF)の特徴付けと定量のための簡単なアッセイについて述べた。LDFアッセイはLD特異的蛍光色素LD540に基づいており、共焦点顕微鏡、蛍光板リーダー、またはフローサイトメトリーによるLDの定量を可能にします。LDFアッセイは、ヒト腸上皮細胞におけるLD形成を特徴付けたり、DGAT1欠乏症などのLD代謝に影響を与えるヒト(遺伝的)障害を研究するために使用することができる。さらに、このアッセイは、腸または他のタイプのオルガノイドにおけるLD形成の欠陥を復元する新規治療化合物を試験するためのハイスループットパイプラインで使用することもできる。
Introduction
脂質は、人間の食事の重要なコンポーネントであり、全身エネルギー貯蔵と代謝に重要な役割を果たしています。摂取すると、食物脂質は膵リパシスによって遊離脂肪酸(FFA)およびモノグリセリド(MG)に分解される。これらの基質は腸上皮の腸細胞によって取り込まれ、そこで最初にモノグリセリドアシルトランスフェラーゼ(MGAT)酵素によってジグリセリド(DG)に再エステル化され、次にジアシルグリセロールによってトリグリセリド(TG)に再エステル化される。アシルトランスフェラーゼ 1 (DGAT1)1.最後に、これらのTGは、リンパ系へのエクスポート用のチロミクロンまたは細胞内貯蔵用の細胞系脂質液滴(LD)のいずれかに統合され、細胞内貯蔵2、3。他の臓器に食物脂質を分配するにはチロミクロンが必要ですが、LDs中の細胞内脂肪貯蔵の重要性は完全には明らかではありません。しかし、腸内で調節機能を果たすように、腸内で調節機能を果たさなければ、食事4の後に脂質をゆっくりと16時間まで循環させることが示されている。さらに、LDは、脂肪分解条件5の間にマウス脂肪細胞のような有毒な脂肪酸濃度から保護することが示されている。
DGAT1タンパク質は、小プスミック網膜(ER)膜上に位置し、腸上皮におけるLD形成において重要な役割を果たしている。DGAT1におけるホモ接合突然変異は、早期発症の重度の下痢および/または嘔吐、低アルブミン血症、および/または(致命的な)脂肪摂取時の腸障害を伴うタンパク質失態性腸障害を引き起こし、ヒトの脂質恒常性におけるDGAT1の重要性を示す。腸上皮6,7,8,9,10.ヒトにおけるDGAT1欠乏症の発生はまれであるため、一次患者由来細胞へのアクセスは乏しい。さらに、腸上皮細胞の長期培養は、通常の生理学を表す腫瘍由来細胞株に限られた延長に限定されてきた。従って、DGAT1媒介性LD形成は、主に線維芽細胞または動物由来細胞株7、10、11、12で研究されている。このように、最近では、DGAT1欠損症患者由来線維芽細胞は、オレイン酸(OA)8による刺激後の健康な対照細胞と比較して、より少ないLDsを蓄積することが示された。
以前は、任意の消化器官から上皮幹細胞を3次元(3D)オルガノイド13の形で培養するプロトコルが確立されていた。これらの腸内オルガノイドは、長期間培養中に保たれ、患者および腸の位置特異的上皮特性14の機能的研究を可能にする。それらは遺伝的およびフェノ典型的に安定しており、保存することができ、長期的な拡張およびバイオバンキング13を可能にする。
我々は最近、LD形成(LDF)アッセイ6においてヒト腸オルガノイドにおいてLD形成を容易に測定できることを実証した。16時間OAにさらされると、オルガノイドは脂質誘発毒性から細胞を保護するためにLDを生成する。OA濃度が高すぎると、カスパーゼ媒介性アポトーシス6によって細胞が死ぬ。LDFアッセイは、DGAT1変異型患者に由来するオルガノイドおよびDGAT1特異的阻害剤6の使用によって示されるDGAT1に大きく依存することが以前に示された。
ここで詳しく説明するLDFアッセイでは、3Dオルガノイドは腸生検から培養され、新しいオルガノイドを容易に形成する単一細胞に破壊によって毎週通過する。LDFアッセイを実行するために、約7,500個のオルガノイド由来単一細胞を24ウェルプレートの各ウェルにめっきされる。オルガノイドは、数日間にわたって形成され、1mM OAで一晩インキュベートし、LD540、イメージングを容易にする蛍光細胞透過性LD特異的色素で染色する。次いで、LD形成は、共焦点顕微鏡、蛍光板リーダー、またはフローサイトメトリーによって定量される。
このLD形成アッセイを96ウェル形式にスケーリングすることにより、このアッセイは、ヒト腸内オルガノイド培養におけるLD形成に影響を与える新規薬物のスクリーニング、または影響を及ぼす(ヒト遺伝的)障害の研究にLD形成のハイスループット分析にも使用できます。LD代謝。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、オレイン酸をインキュベーションする際にヒト腸内オルガノイドにおけるLD形成を決定するプロトコルを提供する。この方法は、LD特異的蛍光色素LD54018に基づいており、オルガノイド培養内の脂質液滴の総体積の特徴付けおよび定量を可能にする。ヒト腸内臓器培養を確立し維持するための手順は13より前に公表されており、このプロトコルの視…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LD540を惜しまなく提供してくださったB.Speeに感謝します。この研究は、オランダ科学研究機構(NWO-ZonMW;VIDI 016.146.353) から S.M.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
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