Summary
Detta protokoll beskriver en analys för karakterisering av lipid DROPP (LD) formation i mänskliga intestinal organoider vid stimulering med fettsyror. Vi diskuterar hur denna analys används för kvantifiering av LD-bildning, och hur den kan användas för hög genomströmning screening för läkemedel som påverkar LD-bildning.
Abstract
Dietary lipider tas upp som fria fettsyror (FAs) av intestinal epitel. Dessa fas är intracellulärt omvandlas till triglycerid (TG) molekyler, innan de förpackas i kylomikroner för transport till lymfa eller i cytosoliska lipiddroppar (LDs) för intracellulär lagring. Ett avgörande steg för bildandet av LDs är den katalytiska aktiviteten av diacylglycerolacyltransferaser (DGAT) i det sista steget i TG-syntesen. LDs är viktiga för att buffra giftiga lipidarter och reglera cellulär metabolism i olika celltyper. Eftersom den mänskliga intestinal epitel regelbundet konfronteras med höga koncentrationer av lipider, LD formation är av stor betydelse för att reglera homeostas. Här beskriver vi en enkel analys för karakterisering och kvantifiering av LD formation (LDF) vid stimulering med de vanligaste omättade fettsyror, oljesyra, i mänskliga intestinal organoider. LDF-analysen är baserad på det LD-specifika fluorescerande färgämnet LD540, som möjliggör kvantifiering av LDs genom konfokalmikroskopi, fluorescerande Plattläsare eller flödescytometri. LDF-analysen kan användas för att karakterisera LD-bildningen i humana intestinala epitelceller, eller för att studera mänskliga (genetiska) sjukdomar som påverkar LD-metabolism, såsom DGAT1-brist. Dessutom kan denna analys också användas i en hög genomströmning pipeline för att testa nya terapeutiska föreningar, som återställer defekter i LD-bildning i tarm eller andra typer av organoider.
Introduction
Lipider är en viktig del av den mänskliga kosten och spelar en stor roll i systemisk energilagring och metabolism. När intas, Dietary lipider bryts ned till fria fettsyror (FFAs) och monoglycerider (MGS) av pankreaslipaser. Dessa substrat tas sedan upp av enterocyterna i tarmens epitel, där de först återförestrades till diglycerider (DG) av monoglyceride acyltransferaser (mgat) enzymer och därefter till triglycerider (TG) av diglyceridolja acyltransferas 1 (DGAT1)1. Slutligen är dessa TGS integreras i antingen kylomikroner för export till lymfsystemet eller cytosoliska lipid droppar (LDs) för intracellulär lagring2,3. Även om kylomikroner behövs för att distribuera kosten lipider till andra organ, är vikten av intracellulär fett lagring i LDs inte helt klart. Emellertid, LDs har visat sig utföra en reglerande funktion i tarmen, som de långsamt släpper lipider i cirkulationen upp till 16 h efter en måltid4. Dessutom har LDs visats skydda mot giftiga fettsyra koncentrationer, såsom i mus adipocyter under lipolytiska förhållanden5.
Den DGAT1 proteinet är lokaliserat på det endoplasmatiska nätmagen (er) membran och leker en avgörande roll i LD bildning inne om intestinal epitel. Homozygot mutationer i DGAT1 leda till tidig debut svår diarré och/eller kräkningar, hypoalbuminemi, och/eller (dödlig) protein-Losing enteropati med intestinal misslyckande vid fettintag, illustrerar vikten av DGAT1 i lipidhomeostas av den mänskliga intestinal epitel6,7,8,9,10. Eftersom förekomsten av DGAT1-brist hos människor är sällsynt, tillgång till primära patient-härledda celler har varit knappa. Vidare, den långsiktiga kulturen av intestinal epitelceller har länge begränsats till tumör-härledda cellinjer som representerar den normala fysiologin endast till en begränsad utvidga. Därför, DGAT1-medierad LD formation har mestadels studerats i fibroblaster eller djur-härledda cellinjer7,10,11,12. Som sådan, det visades nyligen att DGAT1-bristfällig patient-derived fibroblaster ackumuleras mindre LDs jämfört med friska kontrollceller efter stimulering med oljesyra (OA)8.
Tidigare, protokoll upprättades för att kulturen epiteliala stamceller från alla gastrointestinala organ i form av tredimensionella (3D) organoider13. Dessa intestinala organoider kan hållas i kulturen under en lång tidsperiod13, och möjliggöra funktionell studie av patient-och tarm platsspecifika epiteliala egenskaper14. De är genetiskt och fenotypiskt stabila och kan lagras, vilket möjliggör långsiktig expansion och biobankning13.
Vi har nyligen visat att LD formation lätt kan mätas i mänskliga intestinala organoider i en LD formation (LDF) assay6. När organoider exponeras för OA under 16 timmar, genererar de LDs för att skydda cellerna från lipidinducerad toxicitet. När OA koncentrationer är för höga, cellerna dör av kaspas-medierad apoptos6. LDF-analysen har tidigare visat sig vara i hög grad beroende av DGAT1, vilket indikeras av organoider som härrör från DGAT1-muterade patienter och genom användning av DGAT1-specifika hämmare6.
För LDF-analysen som beskrivs i detalj här, är 3D-organoider odlade från intestinal biopsier och är framryckt varje vecka genom störningar i enskilda celler som lätt bildar nya organoider. För att köra LDF-analysen, ~ 7 500 Organoid-härledda enskilda celler är klädd i varje brunn av en 24-brunn tallrik. Organoider bildas under flera dagar, inkuberas över natten med 1 mM OA och färgas med LD540, en fluorescerande cell-permeable LD-specifik färg som underlättar avbildning. LD-bildningen kvantifieras sedan genom konfokalmikroskopi, fluorescerande Plattläsare eller flödescytometri.
Genom att skala denna LD formation assay till en 96-väl format, kan analysen också användas för hög genomströmning analys av LD formation till Screen för nya läkemedel som påverkar LD formation i mänskliga intestinala Organoid kulturer, eller att studera (mänskliga genetiska) störningar som påverkar LD metabolism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment med mänsklig vävnad som beskrivs häri godkändes av etikkommittén vid University Medical Center Utrecht (UMCU). Informerat samtycke till vävnads insamling, generering, lagring och användning av organoider erhölls från patienter på Wilhelmina Children ' s Hospital (WKZ)-UMCU.
1. förberedelse av odlingsmedier
Anmärkning: Detta protokoll bör utföras i ett biosäkerhetsskåp. Organoider ska hanteras enligt standardriktlinjer för cellodling.
- Förbered basala odlingssubstrat.
Anm.: odlingssubstrat utan tillväxtfaktorer kallas bas medium (BM).- Tillsätt 5 mL HEPES (1 M), 5 mL L-glutamin (100x) och 5 mL penicillin-streptomycin (5 000 U/mL) till 500 mL av avancerad Dulbecco ' s modifierade Eagle medium med Hams näringsämne blandning F-12 för att förbereda BM medium.
- Förvara det beredda BM-mediet vid 4 ° c och Använd det i högst 2 månader.
- Förbered R-spondin och noggin betingat medium (CM) enligt tillverkarens protokoll.
- Kort, växa upp cellerna till önskad kvantitet i hyperkolvar med 5 x 107 celler i 555 ml medium utan selektiv antibiotika per kolv.
- Odla cellerna i 4 dagar tills confluent.
- Ersätt mediet med BM och kultur för 8 ytterligare dagar.
- Efter 8 dagar av kultur vid 37 ° c, samla odlingsmediet och centrifugera för 5 min på 450 x g till pellets eventuella kvarvarande celler.
- Filter sterilisera supernatanten, och lagra alikvoter av R-spondin eller noggin CM vid-20 ° c i högst 6 månader.
- Förbered Wnt3A-CM enligt boj et al.15.
- Kort, växa upp cellerna till önskad mängd i 145 mm rätter med 2 x 106 celler i 20 ml medium utan selektiv antibiotika per maträtt. Linda varje maträtt med plastfolie för att undvika avdunstning av odlingsmediet.
- Efter 8 dagar av kultur vid 37 ° c, samla odlingsmediet och centrifugera för 5 min på 450 x g till pellets eventuella kvarvarande celler.
- Filter sterilisera supernatanten, och lagra alikvoter av Wnt3A-CM vid 4 ° c i högst 2 månader.
- Förbered Organoid expansions medium.
Obs: humant litet intestinal Organoid expansions medium (se recept i kompletterande tabell 1) kallas HSI-EM. Följande steg kommer att ge en slutlig volym på 1 L hSI-EM, och kan skalas upp eller ner efter behov.- Lös upp 1,46 g nikotinamid i 12 mL cell odlings grad fosfat-buffrad saltlösning (PBS) för att skapa en slutlig utspädning på 1 M.
- Lös 245 mg n-acetylcystein i 3 mL cellkultur kvalitet PBS för att skapa en slutlig utspädning av 500 mM.
Anmärkning: För att påskynda bildandet av en lösning, nikotinamid och n-acetylcystein kan inkuberas i ett vattenbad vid 37 ° c. Båda lösningarna kan förberedas i sats, aliciteras och lagras vid-20 ° c för framtida bruk. - Filter sterilisera båda lösningarna genom ett 0,22 μm-filter till ett sterilt 15 mL-rör.
- Tillsätt 167 mL av BM till en steril 500 mL odlings medels flaska. Tillsätt 200 mL R-Spondin-CM, 100 mL noggin-CM och 100 μL rekombinant mEGF (500 μg/mL) till en slutlig koncentration på 50 ng/mL.
- Tillsätt 10 mL av den steriliserade nikotinamid-lösningen och 2,5 mL av den steriliserade n-acetylcystein-lösningen. Tillsätt 20 mL av B27 tillägg (50x).
Anmärkning: I detta skede kallas mediet hSI-EM utan WAS (Wnt3A-CM, A83-01 och SB202190), och kan vara aliciterat och lagrat vid-20 ° c. Om mediet är aliciterat i mindre volymer, justera koncentrationerna av följande steg i enlighet med detta. - Till 500 mL hSI-EM utan var, tillsätt 10 mL Wnt3A-CM av den sista nyligen beredda satsen och 10 mL Wnt3A-CM av den näst sista omgången för att minimera variationer förändringar i Wnt3A CM förhållanden.
- Tillsätt A83-01 till en slutlig koncentration på 500 nM och SB202190 till en slutlig koncentration på 10 μM.
- Förvara den beredda hSI-EM (med WAS) vid 4 ° c och Använd i högst 2 veckor.
Anmärkning: Tillsätt ytterligare Y-27632 till en slutlig koncentration av 10 μM (kallas hSI-EM + Y) när kryptor eller enstaka celler odlas eller organoider startas från cryopreservation.
- Förbered fluorescerande aktiverad cell sortering (FACS) buffert.
- Tillsätt 10 mL fetalt kalv serum (FCS) till 40 mL PBS utan ca2 +/mg2 + för en slutlig koncentration på 10% FCS.
Anmärkning: FCS hindrar celler från att ansluta sig till LabWare.
- Tillsätt 10 mL fetalt kalv serum (FCS) till 40 mL PBS utan ca2 +/mg2 + för en slutlig koncentration på 10% FCS.
2. odlings procedurer för humana små Organoider
Anmärkning: Detta protokoll bör utföras i ett biosäkerhetsskåp. Organoider ska hanteras enligt standardriktlinjer för cellodling. Vid hantering av organoider eller Organoid-härledda celler, bör cellerna hållas på is när det är möjligt. Cellerna kommer att förbli livskraftiga i några timmar efter skörd när detta säkerställs. Organoider bör odlas i en standard cellodling inkubator vid 37 ° c med 5% CO2. Dessa villkor gäller för alla inkubations steg med organoider inbäddade i basalmembran matris (BMM; dvs. Matrigel) i hela detta protokoll. Författarna har använt duodenum härledda organoider för dessa analyser.
- Passaging organoider
Observera: Varje Organoid kultur har sin egen fördubbling tid. Normalt kan små intestinala organoider vara blint 1:3 − 1:5 varje 7 − 10 dagar. När blint som enstaka celler, passaging effektivitet kan vara upp till 1:20, beroende på celltäthet. För etablering och underhåll, är organoider odlade i 24-brunn tallrikar; för LDF-analysen, i antingen 24-eller 96-brunetter.- Förberedelse
- Pre-Warm uppackade 24-well vävnadsodling tallrikar i en inkubator vid 37 ° c, 5% CO2 minst över natten och helst 5 dagar i förväg.
Anmärkning: Förvärmning av vävnadskulturer plattorna i cellkulturen inkubator säkerställer korrekt bildning och fastsättning av Organoid-innehållande droppar av BMM. - För att minska antalet frysnings cykler, Förbered 1 mL alikvoter av BMM och förvara vid-20 ° c. Tina en injektionsflaska med BMM på isen minst 30 min innan du påbörjar Organoid passaging förfarande.
- Håll en 50 mL tub med BM på isen som tvättmedel.
- Förbered hSI-EM som beskrivs i avsnitt 1,4, och Förbered en lämplig mängd hSI-EM + Y, till exempel, 15 mL för en full 24-brunn tallrik.
- Pre-Warm uppackade 24-well vävnadsodling tallrikar i en inkubator vid 37 ° c, 5% CO2 minst över natten och helst 5 dagar i förväg.
- Samla organoider.
- Sug försiktigt upp odlingsmediet utan att störa BMM: s droppar.
- Tillsätt 500 μL kallt BM till den första brunnen av organoider och störa BMM-dropparna med organoider genom att Pipettera försiktigt upp och ner med ett P1000 pipet.
- Upprepa denna procedur med samma medium i nästa brunn som krävs, men inte skörda mer än 2 brunnar per 500 μL av BM.
- Samla in organoider i ett lågbindande 1,5 mL microcentrifugerör och snurra ner i en mini-bordscentrifug för 15 − 20 s (max. 2 000 x g). Aspirera supernatanten helt och ta bort den sista biten av medium med en P200 pipet.
Anmärkning: När organoider kulturer ser ren under ett mikroskop och inte innehåller några döda celler eller annat skräp, kan BMM droppar skördas direkt i trypsin istället för BM i steg 2.1.2.2. Efter steg 2.1.2.3, Fortsätt direkt till inkubering i steg 2.1.3.1.
- Separera organoiderna i enskilda celler.
- Tillsätt 400 μL trypsin till snurrade ner organoider. Inkubera organoider vid 37 ° c i 5 min i ett vattenbad.
- Störa kvarvarande aggregat av celler genom Pipettera upp och ner försiktigt med en P200 pipet. Återigen, inkubera organoider vid 37 ° c i 5 min i ett vattenbad.
- Kontrollera förloppet för cell dissociation under ett Mikroskop med 4x förstoring. Upprepa manuella störningar och inkubering när stora klumpar av celler kvarstår.
- När endast enstaka celler återstår, tillsätt 1 mL BM och snurra ner cellerna i en mini-tablettcentrifug för 15 − 20 s.
- Aspirera supernatanten helt. Omsuspendera enstaka celler i 200 μL färsk hSI-EM med hjälp av en P200 pipet. Tillsätt ytterligare 800 μL hSI-EM.
- Räkna antalet celler i suspensionen.
Anmärkning: I författarnas labb, manuell inventering av separerade Organoid celler ger mer tillförlitliga resultat än en automatiserad cell räknare. När en automatiserad cell räknare används, bör CELLTÄTHETEN för nedströms applikationer testas in-House och justeras om för lite eller för många organoider växa ut.
- Utsäde organoider för underhåll eller lipid dropp formation analys.
- Beräkna mängden celler som behövs för den slutliga CELLTÄTHETEN.
Anmärkning: Ungefär 250 celler/μL är en lämplig densitet. I en 24-bra tallrik, 30 μL är seedade i varje brunn, medan 5 μL är seedade i varje brunn av en 96-brunn tallrik. - Ta ut lämplig volym av fjädring och justera densiteten till 750 celler/μL (eller snurra ner och Omsuspendera när densiteten är för låg).
- Tillsätt BMM till cellsuspensionen i förhållandet 2:1. Den slutliga CELLTÄTHETEN i denna blandning är 250 celler/μL. Blanda försiktigt suspensionen genom att Pipettera, försiktigt undvika eventuella bubblor.
- I en pre-värmde vävnadsodling plattan, utsäde ut 3 10 μL droppar per brunn i en 24-brunn tallrik eller en enda 5 μL droppe per brunn i en 96-brunn tallrik.
- Placera plattan i en inkubator vid 37 ° c, 5% CO2 i 10 − 15 min för att STELNA BMM-dropparna. Under tiden förvärma en lämplig mängd hSI-EM + Y i ett vattenbad vid 37 ° c.
- Tillsätt försiktigt 500 μL förvärmda hSI-EM + Y till varje brunn på en 24-brunn platta eller 100 μL till varje brunn på en 96-brunn tallrik. Inkubera cellerna i en inkubator vid 37 ° c, 5% CO2 och efter 2 − 3 dagar ändra mediet till HSI-EM (utan Y) och uppdatera 2 − 3 gånger i veckan.
Anmärkning: Efter 7 − 10 dagar, en underhålls kultur av organoider bör blint igen.
- Beräkna mängden celler som behövs för den slutliga CELLTÄTHETEN.
- Förberedelse
3. analys av lipiddroppar
- Beredning av oljesyra konjugat
Anmärkning: eftersom oljesyra (OA) är hydrofoba och inte lösligt i vatten, är det konjugerat till bovint serum albumin (BSA). BSA kan binda flera fettsyror molekyler och är i detta fall används i en 1:8 förhållande att göra oljesyra tillgängliga för tarmcellerna. Fria fettsyror och BSA kan både binda till plast LabWare. För att säkerställa en korrekt slutkoncentration, Använd glasflaskor och glas glaspipetter när det är möjligt.- Väg 0,2 g flytande oljesyra i rumstemperatur. Tillsätt 1,5 mL steril PBS av kultur kvalitet och värm blandningen till 70 ° c i 1 h. virvel intermittent.
- Väg upp 5,89 g fettsyra fritt BSA och lös upp i 33,9 mL PBS. Värm blandningen i ett vattenbad vid 37 ° c tills BSA är helt upplöst.
- Vortex OA blandningen igen för att skapa en emulsion av fina droppar och omedelbart lägga till den BSA lösning med hjälp av ett glas pipet. Förvara den slutliga lösningen nära 37 ° c efter tillsats av OA. Den slutliga blandningen består av 20 mM OA i 2,5 mM BSA.
- Håll blandningen vid 37 ° c i 30 min tills en klar, gulaktig lösning återstår.
- Konjugaten OA-BSA kan aliciteras och frysas vid-20 ° c i minst 6 månader. Vid upptinning en alikvot, inkubera den vid 37 ° c tills grumlighet löses upp och blandningen är klar igen.
Anmärkning: På grund av den höga protein-och lipidhalten i den slutliga lösningen, kan blandningen inte vara filtersteriliserad eller autoklav. När komponenterna hanterades med försiktighet, i en laminär Flow Hood när det är möjligt och med hjälp av steril PBS, författarna inte upplever mikrobiella infektioner.
- LDF-konfokalanalys
- Provberedning
- Passage organoider enligt beskrivningen i avsnitt 2,1. Frö ut de Organoid-härledda singelcellerna i en svart klar-botten 96-brunn pläterar.
- På dag 6 av kulturen på hSI-EM, ersätta odlingssubstrat med hSI-EM som innehåller 1 mM OA-BSA konjugat.
- Inkubera cellerna i 16 − 17 h (över natten) vid 37 ° c i närvaro eller frånvaro av 0,1 μM DGAT1-hämmare. Innehålla en fordonskontroll på 2,5 mM BSA.
- Efter 16 − 17 h, aspirera mediet utan att störa BMM-dropparna. Fixera organoiderna genom att tillsätta 100 μL 4% neutral buffrad formaldehyd till brunnarna i 30 minuter vid rumstemperatur.
Anmärkning: Den formaldehyd kommer delvis att lösa upp BMM, medan organoider sjunker till botten och hålla sig till botten av plattan. - Ta försiktigt bort formaldehyden och tvätta försiktigt brunnarna med 150 μL PBS per brunn.
- Fläcken cellerna för LDs med 0,025 mg/mL LD540 och 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i PBS för 15 min vid rumstemperatur i mörker.
- Tvätta brunnarna noggrant med PBS.
Anmärkning: Protokollet kan pausas här när det behövs. Förvara proverna som täcks i PBS i mörker vid 4 ° c. Den LD540 färgning kommer att förbli stabil i upp till en vecka. Denna analys kan också utföras med levande celler, att övervaka LD formation under en tidsperiod. För detta måste fixering utelämnas från protokollet, och DAPI bör ersättas med Hoechst färgning. LD540 kan färga LDs i levande celler i samma koncentration som beskrivs.
- Konfokal avbildning
Anmärkning: Bildbehandling kan utföras på preparerade Organoid prover i den svarta klar-botten 96-brunn plattan.- För översiktsbilder av hela organoider, Använd ett 40x-objektiv som lämpar sig för konfokal fluorescerande avbildning.
- Ställ in mikroskopet till bild DAPI-kanalen på 405 nm excitation och ca. 410 − 535 nm emission våglängd. För LD540 färg välja en excitation laser vid 540 nm (543 Nm är optimalt) och ställa in utsläppen filter till 545 − 700 nm.
Anmärkning: I detta protokoll användes ett laserscanning-konfokalsystem med vit ljus laser, acousto-optisk beam splitter (AOBS), 10X/20x objektiv och spektraldetekterings system. Detta möjliggör exakt inställning av de specifika våglängderna. Om ett jämförbart system inte är tillgängligt, Välj laserlinjer och kort-/Long-pass-filter nära specifikationerna ovan. För hela-Organoid avbildning, är en upplösning på 512 x 512 eller 1024 x 1024 tillräcklig för nedströms bildanalys. - Ställ in hålstorleken på 1 luftig enhet (AU) för tillräcklig upplösning av z-axeln.
- Till bild en halva av en sfärisk Organoid, sätta en z-stack till ca 85 μm.
- Bildanalys
Anmärkning: För bildanalys användes Fiji/imagej16,17 för att generera maximala projektioner. Analysen kan utföras med alla bildanalys mjukvarupaket som möjliggör maximal projektion, manuella tröskel, och Partikelanalys.- Med Fiji/ImageJ, omvandla z-stacken av varje Organoid till en maximal projektion: bild | Stackar | Z-projektet.
- Ställ in tröskelvärdet för den maximala projektionen till en nivå där det inte finns någon LD540 signal synlig i kontrollprovet för BSA-fordon: bild | Justera | Tröskelvärde. Använd dessa inställningar för att tröskelvärde varje bild.
- Mät den totala arean av fluorescens för varje maximal projektion med hjälp av funktionen analysera | Analysera partiklar.
Anmärkning: Även om analysen upplösningen är bättre med hjälp av en konfokal Mikroskop, kan denna analys också analyseras med hjälp av en fluorescerande Plattläsare med liknande filter. För att normalisera för Organoid antal per brunn, den LD540 signalen ska divideras med DAPI signalen. Slutligen bör signalen från fordonets BSA-kontroll dras ifrån för att normalisera mätningarna. Detta tillvägagångssätt gör att analysen kan skalas mot en 96-bra plåtformat.
- Provberedning
- LDF flödescytometriskt test
- Provberedning
- Passage organoider enligt beskrivningen i avsnitt 2,1. Utsäde ut Organoid-härledda enskilda celler i en 24-brunn vävnadsodling plattan. Två brunnar per tillstånd är tillräcklig för flödescytometri.
- På dag 10 av kulturen på hSI-EM, ersätta odlingssubstrat med hSI-EM som innehåller 1 mM OA-BSA konjugat.
Anmärkning: I motsats till den konfokala analysen, 10 dagar av tillväxt i EM valdes för flödet flödescytometrianalys analysen i stället för 6 dagar. Den extra 4 dagars expansion kommer att resultera i optiskt överlappande organoider som skulle komplicera den mikroskopi-baserade analysen. Emellertid, det större antalet celler underlättar flödescytometri analys. - Inkubera cellerna i 16 − 17 h (över natten) vid 37 ° c i närvaro eller frånvaro av 0,1 μM DGAT1-hämmare. Innehålla en fordonskontroll på 2,5 mM BSA.
- Efter 16 − 17 h, samla in organoider enligt beskrivningen i avsnitt 2.1.2.
- Separera organoiderna i enskilda celler enligt beskrivningen i avsnitt 2.1.3.
Anmärkning: Även om det inte strikt krävs, rekommenderas att kontrollera antalet celler i varje prov. Ett totalt antal 10 000 celler per prov är det absoluta minimum som krävs för tillräcklig upplösning. För optimala resultat använd ca. 50000 − 100000 celler. - Snurra ner cellerna i en mini-bordcentrifug i 15 − 20 s.
- Fläcka varje prov med 500 μL av 0,025 mg/mL LD540 och 1 μg/mL Hoechst i PBS i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Snurra ner cellerna i en mini-bordcentrifug i 15 − 20 s och tvätta 3x med PBS.
- Fixera cellerna genom att omlägga dem i 500 μL 4% neutral buffrad formaldehyd i 15 min vid rumstemperatur.
- Snurra ner cellerna och tvätta 3x med FACS buffert.
- Pre-skölj FACS rör med FACS buffert för att förhindra att celler fastnar på röret väggen.
- Omsuspendera cellerna i 200 μL av FACS-bufferten och överför cellsuspensionen till de försköljas FACS-rören.
- Flödescytometrisk analys
- Ange parametrarna för gating för att utesluta döda celler och klumpar av celler (se avsnittet representativa resultat).
- I den slutliga gated population, mäta minst 10 000 celler för tillförlitliga resultat.
Anmärkning: Från denna population ger den genomsnittliga fluorescerande intensiteten (MFI) av LD540 och den genomsnittliga SSC-A signalen tillsammans ett mått på den totala volymen av LD-bildning per cell.
- Provberedning
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För korrekt analys av LD-bildningen bör organoiderna inte seedas för tätt före stimulering med OA och efterföljande färgning. Detta är särskilt viktigt för den konfokala och Plattläsare avläsning, eftersom överlappande organoider kan störa fluorescensen. Ett exempel på korrekt Organoid sådd täthet (figur 1A) och en kultur med överlappande Organoider visas (figur 1B). För att minimera variationen i provet stimulering med OA, Organoid storlek och sådd densitet bör vara jämförbar mellan prover inom ett experiment. Detta är bäst kontrolleras genom att sådd ut ett lika många enstaka celler. Emellertid, vissa justeringar kan vara nödvändigt om vissa Organoid linjer konsekvent visar en högre upplösning effektivitet och därmed en genomgående högre Organoid räkna.
Efter stimulering med 1 mM OA över natten, LD formation kan visualiseras med en inverterad brightfield Mikroskop. Ansamling av LDs sprider genomlysnings ljus, och därför verkar organoiderna mörkare, medan icke-stimulerade organoider har ett genomskinligt utseende (figur 1C). Ett exempel på LD-formation som ses i ett brightfield-Mikroskop visas i figur 1D. Detta fenomen kan användas för att bedöma de experimentella förhållandena före fluorescerande analys avläsning. När det positiva kontrollprovet inte är visuellt mörkare än det negativa kontrollprovet, eller när omfattande celldöd är uppenbar, ska försöket kasseras. Eftersom FFAs är giftiga för celler i högre koncentrationer, och den dödliga koncentrationen skiljer sig mellan arter av FFAs, bör den optimala subletala koncentrationen som inducerar LD-bildningen titreras för varje applicering.
När OA-stimulerade organoider är fasta och färgade enligt protokollet, LDF kan visualiseras med hjälp av ett konfokala Mikroskop. Eftersom organoider är 3D-strukturer, är en vanlig epilys Mikroskop inte lämplig på grund av den out-of-Focus bakgrunds signalen. Därför använde vi en (maximal projektion av a) konfokalmikroskopi z-stack för att karakterisera LDF i organoider. Figur 2a visar ett representativt resultat av LD-färgning i friska kontrollorganoider som behandlades med eller utan en DGAT1-hämmare. Även om kvantifiering av dessa bilder är mödosam, fungerar konfokalmikroskopi analys främst som ett visualiseringsverktyg för att kontrollera onormal LD formation. Kvantifiering av konfokalmikroskopiproverna kan också utföras med en fluorescerande Plattläsare (figur 2B), normaliserad till den fluorescerande Hoechst signalen. Plattan Reader-analysen indikerar en signifikant minskning av LD540 signalen i organoida celler som behandlats med DGAT1-hämmare (D1i) jämfört med obehandlade organoider.
Kvantifiering av LD-bildningen i enskilda celler kan uppnås med hjälp av flödescytometern. Den gating strategi som används för dissocierade mänskliga intestinala organoider visas i figur 3A. Det första steget i gating i FSC-A/SSC-A Plot är ett första urval av "Live" (när fast), enstaka celler. För att ytterligare utesluta dubbletter, trillingar, eller större cell klumpar, inkluderade vi två ytterligare gating steg på FSC-W/FSC-H och SSC-W/SSC-H. Slutligen, den gating på FSC-A/Hoechst garanterar uteslutning av alla celler som var döda eller döende före fixering. Figur 3B, C visar histogrammen för både SSC-A och LD540-signalen från den slutliga levande cellpopulationen. LDF kommer att resultera i en ökning av SSC-A på grund av bildandet av intracellulära lipiddroppar. Dessutom, LD540 fläckar för lipider som lagras i LDs och denna signal kommer också att öka på LDF induktion. Som sådan mäts LD formation som en förskjutning i MFI i både SSC-A och LD540 (figur 3D, E). MFI kan plottas och användas för att utföra statistisk analys.
Figur 1: Organoid kulturer visualiseras av brightfield mikroskopi. (a, B) För den konfokala och fluorescerande plattan läsare metoder, är det viktigt att organoider inte seedade i alltför hög densitet i BMM droplet. A) organoider är seedade i en lämplig densitet av 250 celler/μl.Borganoider har seedats i en alltför hög densitet och orsakat överlappning av organoider och celldöd. (C, D) Efter övernattning stimulering med OA, LD formation kan bedömas visuellt. (C) organoider inkuberades över natten med 12% BSA-fordonskontroll. (D) organoider inkuberades över natten med 1 mm OA konjugerat till BSA, vilket resulterade i ett mörkt utseende. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa resultat av LDF-karakteriseringen genom att använda konfokal avbildning och en fluorescerande Plattläsare. Friska kontroll-härledda-organoider stimulerades över natten med BSA, 1 mM OA, eller 1 mM OA + D1i. (A) maximal projektion på 85 μm konfokalstaplar som är färgade för DAPI (cyan) och LD540 (gul). Denna subfigur är anpassad från van Rijn et al.6. (B) relativ fluorescensintensitet på LD540 normaliserad till den nukleära DAPI-signalen mätt med en fluorescerande Plattläsare. Medelvärdet ± SD ritas för två biologiska replikat. Statistisk signifikans fastställdes med hjälp av en enkelriktad ANOVA utan upprepade åtgärder med en Tukey ' s post-hoc. *, S < 0,05. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa resultat av LDF-kvantifiering med flödescytometri. Friska kontroll-härledda-organoider stimulerades över natten med BSA, 1 mM OA, eller 1 mM OA + D1i. (A) gating strategi för att välja för Organoid-härledda enskilda celler. Från vänster till höger, först utesluta skräp genom gating för FSC-A/SSC-A. Sedan utfärda utegångsförbud för på FSC-W/FSC-H och SSC-W/SSC-H att utesluta doublets, trillingar, eller större klumpar av celler. Slutligen, grind för FSC-A/Hoechst att välja för levande celler. Både SSC-A och LD540-kanalerna används för att kvantifiera LD-bildningen. Histogrammen av dessa parametrar visar en förskjutning av medelfluorescensintensiteten (MFI) i (B) SSC-a och (C) LD540 vid stimulering med OA. (D, E) MFI per prov kan plottas i ett diagram och används för att utföra statistisk analys. Medelvärde ± SD är plottas för tre biologiska replikat. Statistisk signifikans fastställdes med hjälp av en enkelriktad ANOVA utan upprepade åtgärder med en Tukey ' s post-hoc. *, S < 0,05; * *, P < 0,01; , S < 0,001. Denna siffra är anpassad från van Rijn et al.6. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Kemiska | Lösningsmedel | Lager koncentration | Slutliga koncentrationen |
| Wnt3a CM | - | 100% | 50% |
| R-spondin-1 CM | - | 100% | 20 |
| Noggin CM | - | 100% | 10 |
| A83-01 (TGFβ-INH) | Dmso | 50 mM | 500 nM |
| B27 | - | 50x | 1x |
| mEGF | PBS/0,1% BSA | 500 μg/mL | 50 ng/mL |
| N-acetyl | Vatten | 500 mM | 1,25 mM |
| Nikotinamid | Pbs | 1 M | 10 mM |
| Primocin (Använd tills MCB är i frys) |
- | 50 mg/mL | 100 μg/mL |
| SB202190 (P38 INH) | Dmso | 30 mM | 10 μM |
Kompletterande tabell 1: recept för Organoid expansions medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här ger vi ett protokoll för att bestämma LD formation i mänskliga intestinal organoider vid inkubering med oljesyra. Denna metod är baserad på LD-specifika fluorescerande färgämne LD54018, vilket möjliggör karakterisering och kvantifiering av den totala volymen av lipiddroppar inom en Organoid kultur. Förfarandena för att etablera och underhålla humana intestinala Organoid kulturer har publicerats före13, och en visuell guide till detta protokoll finns också15.
De avgörande stegen i detta protokoll är kulturen av mänskliga intestinala organoider, och korrekt konjugering av OA till BSA. Kulturen av organoider kräver en korrekt formulering av odlingsmediet, eftersom upprätthållandet av en stamcells population är mycket beroende av funktionell Wnt3A-CM. När Wnt3A-CM är gjort i-hus, rekommenderar vi ett mycket standardiserat arbetsflöde och månatlig produktion av konditionerade medium på grund av förfallotiden på ca 2 månader. Dessutom, 1:1 blandning av på varandra följande Wnt3A CM partier resulterar i en mer konstant långsiktig kultur, eftersom det säkerställer att en något suboptimal parti inte kommer att ha en stor inverkan på Organoid tillväxt.
Dessutom består vår BM av Advanced DMEM/F12 medium, som innehåller lipid-rika BSA. Eftersom vår fordonskontroll (12% BSA/BM) inte inducerar LD-bildning i organoider, drar vi slutsatsen att mängden eller typen av FFA i BM inte är tillräcklig för att påverka LDF-analysen.
Konjugering av OA till BSA är en delikat process som kan kräva viss optimering. Vi upplevde att det protokoll som beskrivs här är mest optimalt när alla temperaturförändringar följs minutiöst och när de utförs med hjälp av glas LabWare.
I tidigare forskning, LD formation analyser har använts för att karakterisera LD storlek och nummer med hög förstoring8,12. Dessa analyser utfördes mestadels med Boron-dipyrromethene (BODIPY) 493/503, vilket ger en utmärkt färgning för LDs med hög signal-brus-förhållande. Emellertid, utsläppet spektrum av BODIPY är ganska bred, och i stor utsträckning överlappar med fluorescerande spektrum av grönt fluorescerande protein (GFP)-härledda färgämnen. Även om vi förväntar oss att den nuvarande tillämpningen av LDF-analysen skulle fungera med BODIPY också, valet för LD540 möjliggör ett bredare spektrum av Multicolor bilder, inklusive Co-färgning med GFP-etiketter18. Vi har också utfört denna analys med hjälp av lipid fläcken Nile röd (data visas inte). Men eftersom Nile Red tenderar att färga inte bara LDs utan även lipidbilayers, fann vi att den högre bakgrunds signalen av Nilen röd sänker kapaciteten i vår analys för att skilja små skillnader i LD formation. Av dessa skäl föredrar vi att använda LD540 i ett Organoid-baserat LDF-test.
Jämfört med tidigare studier med hög förstoring LDF-analyser, det test som vi beskriver här tillåter hög genomströmning kvantifiering av totala LD volym i en stor population av celler. Därför, särskilt fluorescerande plattan läsare kvantifiering, och potentiellt flödescytometriska analysen, kan skalas för att testa effekten av droger på LD formation. Som vi har visat att LD formation är till stor del DGAT1 beroende, DGAT1-bristfällig patient-derived eller D1i-behandlade organoider utgör en tydlig möjlighet för tillämpning av en sådan screening. Särskilt för sådana sällsynta sjukdomar skulle LDF-analysen i kombination med patient-härledda organoider kunna utgöra en plattform för patientspecifik screening för nya terapeutiska läkemedel.
En konsekvens av ett högt dataflöde är dock att kraften att karakterisera enskilda LDs går förlorad. Även om hög förstoring elektron mikroskopiska eller fluorescerande visualisering av LDs kan användas för att studera dynamiken i LD storlek och nummer12,19, den höga genomflödet inte skilja mellan flera små eller färre stora LDs och kan därför inte användas för att kvantifiera skillnader i LD-metabolism där den totala volymen av LDs förblir konstant. Därför, i tillämpningar där antal eller storlek på LDs misstänks vara av intresse, bör detta åtgärdas med en lägre genomströmning, högre förstorings teknik. Dessutom, organoider i den aktuella analysen får basolateral lipid stimulering medan kosten lipider normalt tas upp på apikala membranet. Viss försiktighet krävs därför om resultaten ska översättas till den fysiologiska situationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar B. Spee för generöst tillhandahålla LD540. Detta arbete stöddes av en nederländsk organisation för vetenskapligt forskningsbidrag (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) till Swen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100x) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
- D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
- Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
- Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
- van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
- Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
- Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
- Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
- Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
- Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
- Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
- Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).
