Summary
이 프로토콜은 지방산으로 자극시 인간의 장 유기 체에서 지질 방울 (LD) 형성의 특성에 대한 분석서를 설명합니다. 우리는 이 분석제가 LD 형성의 정량화를 위해 어떻게 이용되는지, 그리고 어떻게 LD 대형에 영향을 미치는 약에 대한 높은 처리량 검열을 위해 사용될 수 있는지 토론합니다.
Abstract
식이 지질은 장 상피에 의해 자유 지방산 (FA)으로 채택됩니다. 이 FA는 세포내 트리글리세라이드(TG) 분자로 전환되며, 림프로 운반하기 위해 chylomicrons로 포장되기 전에 또는 세포내 저장을 위해 세포내 지질 방울(LDs)으로 운반됩니다. LDs의 형성을 위한 결정적인 단계는 TG 합성의 마지막 단계에서 디아실리세롤 아실트랜스퍼라제(DGAT)의 촉매 활성이다. LDs는 독성 지질 종을 버퍼링 하 고 다른 세포 유형에 세포 대사를 조절 하는 것이 중요 하다. 인간의 장 상피는 정기적으로 지질의 높은 농도 직면 하기 때문에, LD 형성항상성을 조절 하는 것이 매우 중요 하다. 여기에서 우리는 인간 장 오르가노이드에서 가장 일반적인 불포화 지방산, 올레산으로 자극시 LD 형성 (LDF)의 특성화 및 정량화에 대한 간단한 분석서를 설명합니다. LDF 분석법은 공초점 현미경, 형광 판 판독기 또는 유세포 측정에 의한 LD의 정량화를 허용하는 LD 특이적 형광 염료 LD540을 기반으로 합니다. LDF 분석실험은 인간 장 상피 세포에서 LD 형성을 특성화하거나 DGAT1 결핍과 같은 LD 대사에 영향을 미치는 인간(유전적) 장애를 연구하는 데 사용될 수 있다. 또한, 이 분석실험은 또한 장 내 또는 다른 유형의 오르가노이드에서 LD 형성의 결함을 복원하는 새로운 치료 화합물을 테스트하기 위해 높은 처리량 파이프 라인에서 사용될 수 있습니다.
Introduction
지질은 인간의 식단의 중요한 구성 요소이며 전신 에너지 저장 및 신진 대사에 중요한 역할을합니다. 섭취 할 때, 식이 지질은 췌장 리파스에 의해 자유 지방산 (FFAs) 및 모노 글리세라이드 (MGs)로 저하됩니다. 이 기질은 그 때 장 상피의 장세포에 의해 채택되고, 여기서 그(것)들은 단글리세라이드 acyltransferases (MGAT) 효소에 의해 diglycerides (DG)에 처음으로 재에스테르화되고 그 후에 diacyglycerol에 의해 트리글리세라이드 (TG)에 아실트랜스퍼라제 1 (DGAT1)1. 마지막으로, 이들 TGs는 세포내 저장을 위한 림프계 또는 세포질 지질 방울(LDs)으로 수출하기 위한 chylomicrons중하나에 통합되어2,3. 다른 장기에 식이 지질을 배포 하는 chylomicrons 필요 하지만, LDs에 세포 내 지방 저장의 중요성은 완전히 명확 하지 않습니다. 그러나, LDs는 식사 후 16 시간까지 순환으로 지질을 천천히 방출하기 때문에 장에서 조절 기능을 수행하는 것으로 나타났습니다4. 더욱이, LDs는지방분해조건5 동안 마우스 지방세포와 같은 독성 지방산 농도로부터 보호하는 것으로 나타났다.
DGAT1 단백질은 내구 성 망막 (ER) 막에 위치하고 장 상피에서 LD 형성에 중요한 역할을한다. DGAT1의 동형접합 돌연변이는 조기 발병 심한 설사 및 구토, 저알부민혈증 및/또는 (치명적인) 단백질 손실 장 부전으로 이어질 수 있으며, 인간의 지질 항상성에서 DGAT1의 중요성을 보여줍니다. 장 상피6,7,8,9,10. 인간에 있는 DGAT1 부족의 발생은 희소하기 때문에, 1 차적인 참을성 있는 파생한 세포에 접근은 부족했습니다. 더욱이, 장 상피 세포의 장기 배양은 정상 생리학을 나타내는 종양 유래 세포주로 오랫동안 제한되어 제한된 연장으로만 제한되어 왔다. 따라서, DGAT1-매개 LD 형성은 주로 섬유아세포 또는 동물 유래 세포주7,10,11,12에서연구되었다. 이와 같이, 최근 DGAT1 결핍 환자 유래 섬유아세포가 올레산(OA)을 사용하여 자극한 후 건강한 대조군 세포에 비해 LDs가 적게 축적되는 것으로 나타났다8.
이전에는 3차원(3D)오르가노이드(13)의형태로 임의의 위장관 기관으로부터 상피 줄기 세포를 배양하는 프로토콜이 확립되었다. 이러한 장내 오르가노이드는13시간동안 배양물에서 유지될 수 있으며, 환자 및 장위치특이적 상피특성(14)의 기능적 연구를 가능하게 한다. 그(것)들은 유전으로 그리고 현상전적으로 안정하고 저장될 수 있고, 장기 확장 및 biobanking13를허용하.
우리는 최근에 LD 대형이 LD 형성 (LDF) 분석실험에서 인간 장 오르가노이드에서쉽게 측정될 수 있다는 것을 입증했습니다. 16 시간 동안 OA에 노출되면, 오르가노이드는 지질 유발 독성으로부터 세포를 보호하기 위해 LDs를 생성합니다. OA 농도가 너무 높으면 카스파제 매개 세포사멸6에의해 세포가 죽습니다. LDF 분석결과는 이전에 DGAT1 돌연변이 환자로부터 유래된 오르가노이드및 DGAT1 특이적억제제6의사용에 의해 지시된 바와 같이 DGAT1에 크게 의존하는 것으로 나타났다.
여기에서 자세히 기술된 LDF 분석의 경우, 3D 오르가노이드는 장 생검에서 배양되며 새로운 오르가노이드를 쉽게 형성하는 단일 세포로의 중단에 의해 매주 통과됩니다. LDF 분석을 실행하기 위해, ~7,500 개의 오르가노이드 유래 단일 세포는 24 웰 플레이트의 각각의 웰에서 도금된다. 오르가노이드는 며칠에 걸쳐 형성되고, 1 mM OA로 밤새 배양되고, 화상 진찰을 용이하게 하는 형광 세포 투과성 LD 특이적 염료인 LD540으로 염색됩니다. LD 형성은 공초점 현미경 검사법, 형광 판 리더, 또는 유세포 측정에 의해 정량화됩니다.
이 LD 형성 분석을 96 웰 형식으로 스케일링함으로써, 분석은 또한 인간의 장 유기 체 형 에서 LD 형성에 영향을 미치는 새로운 약물을 선별하는 LD 형성의 높은 처리량 분석에 사용할 수 있습니다, 또는 연구 (인간 유전) 장애에 영향을 미치는 LD 신진 대사.
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Protocol
본 명세서에 기재된 인간 조직을 이용한 모든 실험은 대학 의료 센터 위트레흐트(UMCU)의 윤리위원회에 의해 승인되었다. 조직 수집, 생성, 저장 및 유기노이드 사용에 대한 사전 동의는 빌헬미나 어린이 병원 (WKZ)-UMCU의 환자로부터 얻어졌습니다.
1. 문화매체 준비
참고: 이 프로토콜은 생체 안전 캐비닛 내부에서 수행해야합니다. 오르가노이드는 표준 세포 배양 지침에 따라 취급되어야 합니다.
- 기초 배양 배지를 준비합니다.
참고: 성장 인자 없는 배양 배지는 기저 배지(BM)라고 합니다.- 5 mL의 HEPES (1 M), 5 mL의 L-글루타민 (100x) 및 5 mL의 페니실린-스트렙토마이신 (5,000 U/mL)을 500 mL의 고급 덜베코의 변형 된 독수리 배지와 햄의 영양 혼합물 F-12를 첨가하여 BM 배지를 준비합니다.
- 준비된 BM 배지를 4°C에서 저장하고 최대 2개월 동안 사용하십시오.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 R-spondin 및 Noggin 컨디셔닝 매체(CM)를 준비합니다.
- 간략하게, 플라스크 당 선택적 항생제 없이 5 x 107 세포를 555 mL 배지에서 하이퍼플라스크에서 원하는 양으로 성장시켰다.
- 세포가 부유할 때까지 4일 동안 성장시다.
- 배지를 BM 및 배양물로 8일 간 교체합니다.
- 37°C에서 8일간 배양한 후, 남은 세포를 펠렛에 450 x g에서 5분 동안 배양배지 및 원심분리기를 수집하였다.
- 상류자를 살균하고, R-spondin 또는 Noggin CM의 알리쿼트(aliquots)를 -20°C에서 최대 6개월 동안 저장한다.
- Boj 외15에따라 Wnt3A-CM을 준비하십시오.
- 간략하게, 접시당 선택적 항생제 없이 20 mL 배지에서 2 x 106 세포로 145 mm 접시에서 원하는 양으로 세포를 성장시다. 배양 배지의 증발을 피하기 위해 각 접시를 플라스틱 호일로 감싸.
- 37°C에서 8일간 배양한 후, 남은 세포를 펠렛에 450 x g에서 5분 동안 배양배지 및 원심분리기를 수집하였다.
- 상급체를 살균하고, 최대 2개월 동안 4°C에서 Wnt3A-CM의 알리쿼트들을 저장한다.
- 오르가노이드 팽창 배지를 준비합니다.
참고: 인간 소장 오르가노이드 팽창 배지(보충표 1의레시피 참조)를 hSI-EM이라고 합니다. 다음 단계는 1L hSI-EM의 최종 볼륨을 생성하며 필요에 따라 확장 또는 축소할 수 있습니다.- 1.46 g의 니코틴아미드를 세포 배양 등급인 인산완충식염수(PBS)에 12 mL에 용해시켜 1M의 최종 희석을 생성한다.
- 245 mg의 n-아세틸 시스테인을 3 mL의 세포 배양 등급 PBS에 용해시켜 500 mM의 최종 희석을 생성한다.
참고: 용액의 형성을 가속화하기 위해, 니코틴아미드 및 n-아세틸 시스테인은 37°C에서 수조에서 배양될 수 있다. 두 솔루션 모두 향후 사용을 위해 -20°C에서 일괄, aliquoted 및 저장방식으로 제조할 수 있습니다. - 0.22 μm 필터를 통해 두 솔루션을 멸균 된 15 mL 튜브로 살균하는 필터.
- 멸균 500 mL 배양 배지 플라스크에 BM 167 mL을 추가합니다. R-Spondin-CM 200 mL, 노긴-CM 100 mL, 재조합 mEGF(500 μg/mL)를 최종 농도 50 ng/mL에 추가합니다.
- 멸균된 니코틴아미드 용액 10 mL과 멸균된 n-아세틸 시스테인 용액의 2.5 mL를 첨가합니다. B27 보충제(50x)의 20mL를 추가하십시오.
참고: 이 단계에서, 배지는 WAS(Wnt3A-CM, A83-01 및 SB202190)가 없는 hSI-EM으로 지칭되며, -20°C에서 aliquoted 및 저장될 수 있다. 배지가 더 작은 부적으로 인가되는 경우, 그에 따라 다음 단계의 농도를 조정한다. - WAS가 없는 hSI-EM의 500 mL에, Wnt3A-CM 조건의 가변성 변화를 최소화하기 위해 마지막으로 새로 준비된 배치의 Wnt3A-CM 10 mL과 두 번째 마지막 배치의 Wnt3A-CM의 10 mL을 추가합니다.
- A83-01을 500 nM의 최종 농도에 추가하고 SB202190을 최종 농도 10 μM에 추가합니다.
- 준비된 hSI-EM(WAS 포함)을 4°C에서 저장하고 최대 2주 동안 사용하십시오.
참고: 토굴 또는 단일 세포가 배양되거나 유기노이드가 냉동 보존에서 시작될 때 10 μM(hSI-EM+Y라고 함)의 최종 농도에 Y-27632를 추가합니다.
- 형광 활성화 세포 선별 (FACS) 버퍼를 준비합니다.
- 10% FCS의 최종 농도에 대한 Ca2+ /Mg2+없이 40 mL의 PBS에 태아 송아지 혈청 (FCS) 10 mL를 추가하십시오.
참고: FCS는 세포가 실험실용품에 순조로되는 것을 방지합니다.
- 10% FCS의 최종 농도에 대한 Ca2+ /Mg2+없이 40 mL의 PBS에 태아 송아지 혈청 (FCS) 10 mL를 추가하십시오.
2. 인간 소장 오르가노이드에 대한 배양 절차
참고: 이 프로토콜은 생체 안전 캐비닛 내부에서 수행해야합니다. 오르가노이드는 표준 세포 배양 지침에 따라 취급되어야 합니다. 오르가노이드 또는 오르가노이드 유래 세포를 취급할 때, 세포는 가능하면 얼음에 보관되어야 합니다. 세포는 이것이 보장될 때 수확 후에 몇 시간 동안 실행 가능한 남아 있을 것입니다. 오가노이드는 37°C에서 5%CO2로표준 세포 배양 인큐베이터에서 배양되어야 한다. 이러한 조건은 이 프로토콜 전반에 걸쳐 지하 막 매트릭스(BMM; 즉, 마트립겔)에 내장된 오르가노이드가 있는 모든 인큐베이션 단계에 적용됩니다. 저자는 이 세포에 대한 십이지장 유래 오르가노이드를 사용했습니다.
- 패시징 오르가노이드
참고: 모든 오르가노이드 문화는 두 배로 많은 시간을 가지고 있습니다. 일반적으로 소장 오르가노이드는 7-10 일마다 1 :3-1 :5로 통과 될 수 있습니다. 단일 셀로 전달될 때, 통과 효율은 세포 밀도에 따라 최대 1:20일 수 있습니다. 설립 및 유지 보수를 위해, 오르가노이드는 24 웰 플레이트에서 배양됩니다. LDF 분석의 경우 24- 또는 96 웰 플레이트에서.- 준비
- 미리 온난 풀린 24웰 조직 배양플레이트를 37°C에서 인큐베이터에서, 5%CO2이상 하룻밤 및 바람직하게는 5일 전에 인큐베이터에 담는다.
참고: 세포 배양 인큐베이터에서 조직 배양 판을 미리 온난화하여 BMM의 유기노이드 함유 방울의 적절한 형성 및 부착을 보장한다. - 동결 해동 사이클의 수를 줄이려면 BMM의 1 mL aliquots를 준비하고 -20 °C에 보관하십시오. 유기성 통과 절차를 시작하기 전에 적어도 30 분 얼음에 BMM의 유리병을 해동.
- BM 50 mL 튜브를 세척 매체로 얼음에 보관하십시오.
- 섹션 1.4에 설명된 대로 hSI-EM을 준비하고, 전체 24웰 플레이트에 대해 적절한 양의 hSI-EM+Y를 준비하고, 예를 들어 15 mL을 준비한다.
- 미리 온난 풀린 24웰 조직 배양플레이트를 37°C에서 인큐베이터에서, 5%CO2이상 하룻밤 및 바람직하게는 5일 전에 인큐베이터에 담는다.
- 오르가노이드를 수집합니다.
- BMM의 물방울을 방해하지 않고 배양 배지를 조심스럽게 흡인합니다.
- 오가노이드의 첫 번째 우물에 500 μL의 차가운 BM을 추가하고 P1000 파이펫으로 부드럽게 위아래로 피펫을 피펫으로 피펫으로 하여 오르가노이드로 BMM 방울을 방해합니다.
- 필요에 따라 동일한 배지로 이 절차를 반복하지만 BM 500 μL당 2 개 이상의 우물을 수확하지 마십시오.
- 저결합 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에서 오르가노이드를 수집하고 15-20 s (최대. 2,000 x g)의미니 탁상 원심 분리기에서 아래로 돌십시오. 상급체를 완전히 흡인하고 P200 파이펫으로 마지막 배지비트를 제거합니다.
참고: 오르가노이드 배양이 현미경으로 깨끗하게 보이고 죽은 세포 또는 다른 파편을 포함하지 않는 경우, BMM 방울은 단계 2.1.2.2에서 BM 대신 트립신에서 직접 수확 될 수 있습니다. 단계 2.1.2.3 후, 단계 2.1.3.1에서 인큐베이션으로 직접 진행한다.
- 오르가노이드를 단일 세포로 해리시면 됩니다.
- 400 μL의 트립신을 오르가노이드 아래로 스펀다운하십시오. 수조에서 5 분 동안 37 °C에서 오르가노이드를 배양합니다.
- P200 파이펫으로 부드럽게 위아래로 파이펫팅하여 셀의 나머지 골재를 중단시면 됩니다. 다시, 수조에서 5 분 동안 37 °C에서 오르가노이드를 배양하십시오.
- 4배 배율을 사용하여 현미경으로 세포 해리의 진행 상황을 확인합니다. 세포의 큰 덩어리가 남아있을 때 수동 중단과 배양을 반복합니다.
- 단일 셀만 남아 있을 때, BM의 1 mL를 추가하고 15-20s에 대한 미니 탁상 원심 분리기에 세포를 스핀 다운.
- 상급을 완전히 흡인합니다. P200 파이펫을 사용하여 신선한 hSI-EM의 200 μL에서 단일 셀을 다시 중단합니다. 800 μL의 hSI-EM을 추가합니다.
- 현탁액의 셀 수를 계산합니다.
참고: 저자의 실험실에서, 해리 된 유기 성 세포의 수동 계산 자동화 된 세포 카운터 보다 더 신뢰할 수 있는 결과 산출. 자동화된 세포 카운터를 사용할 때, 다운스트림 응용을 위한 세포 밀도는 사내에서 시험되고 너무 적거나 너무 많은 오르가노이드가 자라나는 경우에 조정되어야 합니다.
- 유지 보수 또는 지질 방울 형성 분석분석용 종자 오르가노이드.
- 최종 셀 밀도에 필요한 셀의 부피를 계산합니다.
참고: 약 250 개의 세포 / μL은 적절한 밀도입니다. 24웰 플레이트에서 30 μL을 각 웰에 시드하고, 5 μL은 96웰 플레이트의 각 웰에 시드됩니다. - 적절한 양의 서스펜션을 꺼내서 밀도를 750셀/μL로 조정합니다(또는 밀도가 너무 낮으면 스핀다운 및 재중단).
- 2:1 비율로 셀 현탁액에 BMM을 추가합니다. 이 혼합물의 최종 세포 밀도는 250 셀 / μL. 부드럽게 조심스럽게 어떤 기포를 피하고, 파이펫팅에 의해 현탁액을 혼합.
- 미리 온난한 조직 배양 플레이트에서, 24웰 플레이트 또는 96웰 플레이트에서 웰당 10 μL 액적 3개를 시드합니다.
- 플레이트를 37°C, 5%CO2에서 10-15분 동안 인큐베이터에 놓고 BMM 방울을 고화시다. 한편, 37°C의 수조에서 적당량의 hSI-EM+Y를 미리 데운다.
- 미리 데운 hSI-EM+Y 500 μL을 24웰 플레이트의 각 웰에 조심스럽게 추가하거나 96웰 플레이트의 각 웰에 100 μL을 추가합니다. 세포를 37°C, 5%CO2에서 인큐베이터에서 배양하고 2-3일 후 배지를 hSI-EM(Y 제외)으로 변경하고 일주일에 2−3회 새로 고칩니다.
참고: 7-10 일 후에, 오르가노이드의 유지 보수 문화는 다시 통과되어야합니다.
- 최종 셀 밀도에 필요한 셀의 부피를 계산합니다.
- 준비
3. 지질 방울 형성 분석
- 올레산 컨쥬게이트 의 제조
참고 : 올레산 (OA)은 소수성이며 물에 용해되지 않기 때문에 소 혈청 알부민 (BSA)에 융합됩니다. BSA는 여러 지방산 분자를 결합할 수 있으며, 이 경우 장 세포에 올레산을 접근할 수 있도록 1:8 비율로 사용됩니다. 유리 지방산과 BSA는 모두 플라스틱 실험실용품에 결합 할 수 있습니다. 적절한 최종 농도를 보장하려면 가능하면 유리 바이알과 유리 파이프를 사용하십시오.- 실온에서 액체 올레산 0.2 g의 무게를 측정하십시오. 배양 등급의 멸균 PBS 1.5 mL를 추가하고 혼합물을 70 °C로 가열하여 1 시간 동안 소용돌이를 간헐적으로 가열합니다.
- 5.89 g의 지방산이 없는 BSA의 무게를 측정하고 33.9 mL의 PBS에 녹입니다. BSA가 완전히 용해될 때까지 37°C의 수조에서 혼합물을 데우다.
- OA 혼합물을 다시 소용돌이시켜 미세 한 방울의 에멀젼을 생성하고 유리 파이펫을 사용하여 BSA 용액에 즉시 첨가한다. OA를 첨가한 후 최종 용액을 37°C 가까이 유지합니다. 최종 혼합물은 2.5 mM BSA에서 20 mM OA로 구성됩니다.
- 투명한 황색 용액이 남아있을 때까지 혼합물을 37 °C에서 30 분 동안 유지하십시오.
- OA-BSA 컨쥬게이트는 적어도 6개월 동안 -20°C에서 aliquoted 및 동결될 수 있다. 알리쿼트가 해동되면, 흐림이 용해되고 혼합물이 다시 맑아질 때까지 37 °C에서 배양하십시오.
참고: 최종 용액의 높은 단백질 및 지질 함량 때문에 혼합물을 살균하거나 오토클레이브할 수 없습니다. 구성 요소를 주의하여 처리 했을 때, 가능 하면 층류 후드에 멸 균 PBS를 사용 하 여, 저자는 미생물 감염을 경험 하지 않았다.
- LDF 공초점 분석
- 샘플 준비
- 섹션 2.1에 기재된 대로 통로 오르가노이드. 검은 투명 하부 96 웰 플레이트에서 오르가노이드 유래 단일 세포를 시드.
- 6일째에 hSI-EM에 대한 배양배지를 1 mMM OA-BSA 컨쥬게이트를 함유하는 hSI-EM으로 대체한다.
- 0.1 μM DGAT1 억제제의 존재 또는 부재 상태에서 37°C에서 16-17 h(하룻밤)에 대한 세포를 배양한다. 2.5mM BSA의 차량 제어를 포함합니다.
- 16-17 시간 후, BMM 방울을 방해하지 않고 배지를 흡인한다. 실온에서 30 분 동안 우물에 4 % 중성 완충 포름알데히드 100 μL을 추가하여 오르가노이드를 고정시.
참고: 포름알데히드는 BMM을 부분적으로 용해시키고, 오르가노이드는 바닥으로 가라앉고 플레이트 의 바닥에 부착됩니다. - 포름알데히드를 부드럽게 제거하고 잘 당 150 μL의 PBS로 우물을 조심스럽게 씻으십시오.
- 0.025 mg/mL LD540 및 4′,6-디아미디노-2-페니린들레(DAPI)로 LDs의 세포를 PBS에서 15분 동안 어두운 실내 온도에서 얼룩지게 합니다.
- PBS로 우물을 조심스럽게 씻으하십시오.
참고: 필요한 경우 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 4 °C에서 어둠 속에서 PBS에 덮여 샘플을 유지합니다. LD540 염색은 최대 1주일 동안 안정적으로 유지됩니다. 이 분석은 또한 시간의 기간 동안 LD 형성을 모니터링하기 위해, 살아있는 세포와 함께 수행 될 수있다. 이를 위해 프로토콜에서 고정을 생략해야 하며 DAPI를 Hoechst 염색으로 바꿔야 합니다. LD540은 설명된 것과 동일한 농도로 살아있는 세포에서 LD를 염색할 수 있다.
- 공초점 이미징
참고: 이미징은 검은 색 투명 바닥 96 웰 플레이트에서 준비된 오르가노이드 샘플에서 수행 될 수 있습니다.- 전체 오르가노이드의 개요 이미지의 경우 공초점 형광 이미징에 적합한 40x 목표를 사용합니다.
- 현미경을 405 nm 여기 및 ca. 410−535 nm 방출 파장에서 DAPI 채널을 이미지화하도록 설정합니다. LD540 염료의 경우 540 nm (543 nm)에서 여기 레이저를 선택하고 방출 필터를 545-700 nm로 설정합니다.
참고: 이 프로토콜에서는 백색광 레이저, 아쿠스토 광학 빔 스플리터(AOBS), 10x/20x 대물렌즈 및 스펙트럼 검출 시스템을 갖춘 레이저 스캐닝 공초점 시스템이 사용되었습니다. 이를 통해 특정 파장에 대한 정확한 튜닝이 가능합니다. 유사한 시스템을 사용할 수 없는 경우 위의 사양에 가까운 레이저 라인 및 단거리/장거리 필터를 선택하십시오. 전체 오르가노이드 이미징의 경우 512 x 512 또는 1024 x 1024의 해상도는 다운스트림 이미지 분석에 충분합니다. - 충분한 z축 분해능을 위해 핀홀 크기를 1개의 통풍이 잘되는 장치(AU)로 설정합니다.
- 구형 오르가노이드의 절반을 이미지화하려면 z-stack을 약 85 μm로 설정합니다.
- 이미지 분석
참고: 이미지 분석을 위해, 피지/ImageJ16,17은 최대 투영을 생성하는 데 사용되었다. 최대 투영, 수동 임계값 및 입자 분석을 허용하는 모든 이미지 분석 소프트웨어 패키지로 분석을 수행할 수 있습니다.- 피지 /ImageJ를 사용하여, 최대 프로젝션에 각 오르가노이드의 z 스택을 변환 : 이미지 | 스택 | Z-프로젝트.
- 최대 투영 임계값을 BSA 차량 제어 샘플에 LD540 신호가 표시되지 않는 수준으로 설정합니다: 이미지 | 조정 | 임계값. 이러한 설정을 사용하여 각 이미지의 임계값을 설정합니다.
- 분석 함수를 사용하여 각 최대 투영에 대한 형광의 총 면적을 측정 | 입자를 분석합니다.
참고: 공초점 현미경을 사용하여 분석 해상도가 더 좋더라도, 이 분석제는 또한 유사한 필터를 가진 형광판 리더기를 사용하여 분석될 수 있습니다. 잘 당 오르가노이드 카운트를 정규화하려면 LD540 신호를 DAPI 신호로 나누어야 합니다. 마지막으로, BSA 차량 제어의 신호를 빼서 측정을 정규화해야 합니다. 이 방법을 사용하면 분석법을 96웰 플레이트 형식으로 확장할 수 있습니다.
- 샘플 준비
- LDF 유동 세포 측정 분석
- 샘플 준비
- 섹션 2.1에 기재된 대로 통로 오르가노이드. 24웰 조직 배양 판에서 오르가노이드 유래 단일 세포를 시드아웃한다. 조건당 두 개의 웰은 유세포 측정에 충분합니다.
- 10일째에 hSI-EM에 대한 배양배지를 1 mMM OA-BSA 컨쥬게이트를 함유하는 hSI-EM으로 대체한다.
참고: 공초점 분석과 는 대조적으로, EM에서의 10일간의 성장은 6일 대신유세포분석법을 선택하였습니다. 확장의 추가 4 일은 현미경 검사법 기지를 둔 분석결과를 복잡하게 할 광학적으로 중첩된 오르가노이드 귀착될 것입니다. 그러나, 세포의 큰 수는 유세포 분석분석을 용이하게 합니다. - 0.1 μM DGAT1 억제제의 존재 또는 부재 상태에서 37°C에서 16-17 h(하룻밤)에 대한 세포를 배양한다. 2.5mM BSA의 차량 제어를 포함합니다.
- 16-17시간 후, 섹션 2.1.2에 기재된 대로 오르가노이드를 수집한다.
- 섹션 2.1.3에 설명된 대로 오르가노이드를 단일 세포로 해리합니다.
참고: 반드시 필요한 것은 아니지만 각 샘플에서 셀 수를 확인하는 것이 좋습니다. 샘플당 총 10,000개의 셀수는 충분한 분해능에 필요한 절대 최소 셀입니다. 최적의 결과를 얻으려면 ca. 50,000-100,000 셀을 사용하십시오. - 15-20초 동안 미니 탁상 원심분리기에서 세포를 스핀다운합니다.
- 각 시료에 0.025 mg/mL LD540의 500 μL, 1 μg/mL Hoechst를 PBS에서 15분 동안 어두운 실내 온도에서 얼룩을 지습니다.
- 15-20s의 미니 탁상 원심분리기에서 세포를 회전시키고 PBS로 3x 세척합니다.
- 실온에서 15분 동안 4% 중성 완충 포름알데히드의 500 μL로 세포를 다시 정지시킴으로써 세포를 고정시.
- 세포를 스핀 다운하고 FACS 버퍼로 3x를 씻으소서.
- FACS 버퍼로 FACS 튜브를 미리 헹구어 세포가 튜브 벽에 달라붙는 것을 방지합니다.
- FACS 완충액의 200 μL에서 세포를 재중단하고 미리 헹구된 FACS 튜브로 세포 현탁액을 옮김을 옮김을 옮김.
- 유세포 분석
- 게이팅 매개변수를 설정하여 죽은 세포와 셀 덩어리를 제외합니다(대표 결과 섹션 참조).
- 최종 문이 닫힌 모집단에서 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 적어도 10,000개의 셀을 측정합니다.
참고: 이 집단으로부터, LD540의 평균 형광 강도(MFI)와 평균 SSC-A 신호는 함께 세포당 LD 형성의 총 부피의 측정값을 제공한다.
- 샘플 준비
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Representative Results
LD 형성의 적절 한 분석을 위해, 오르가노이드는 OA와 후속 염색으로 자극 하기 전에 너무 조밀 하 게 파종 해서는 안. 이것은 중첩된 오르가노이드가 형광을 방해할 수 있기 때문에 공초점 및 플레이트 판독기 판독에 특히 중요합니다. 적절한 오르가노이드 시드 밀도의예(도 1A)및 중첩된 오르가노이드를 가진 배양체(도1B)가도시된다. OA를 사용하여 샘플 자극의 가변성을 최소화하려면 하나의 실험 내에서 샘플 간에 유기체 크기 및 시드 밀도를 비교해야 합니다. 이것은 단일 세포의 동일한 수를 시드하여 가장 잘 제어됩니다. 그러나, 특정 organoid 라인이 일관되게 더 높은 재구성 효율성을 보여주고 그러므로 일관되게 더 높은 organoid 수를 보여주는 경우에 몇몇 조정이 필요할 지도 모릅니다.
하룻밤 동안 1 mM OA로 자극 한 후, LD 형성은 반전 된 밝은 필드 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. LDs의 축적은 전달된 빛을 산란시키고, 따라서 오르가노이드는 더 어둡게 나타나는 반면, 비자극된 오르가노이드는 반투명한 외관을 가지고 있다(그림 1C). 밝은 필드 현미경의 밑에 보인 것과 같은 LD 대형의 보기는 그림 1D에도시됩니다. 이러한 현상은 형광 분석 판독 전에 실험 조건을 평가하는 데 사용될 수 있다. 양성 대조군 샘플이 음성 대조군 샘플보다 시각적으로 어둡지 않거나 광범위한 세포 사멸이 명백한 경우 실험을 폐기해야 합니다. FFA는 높은 농도의 세포에 독성이 있고, 치명적인 농도는 FFA의 종 사이에서 다르기 때문에, LD 대형을 유도하는 최적 치명적인 농도는 각 응용 프로그램에 대해 적정되어야 합니다.
일단 OA 자극된 오르가노이드가 프로토콜에 따라 고정되고 염색되면, LDF는 공초점 현미경을 사용하여 가시화될 수 있다. 오르가노이드는 3D 구조이기 때문에, 일반 에피플루오닉 현미경은 초점이 벗어난 배경 신호 때문에 적합하지 않습니다. 따라서, 우리는 유기노이드에서 LDF를 특성화하기 위해 (a의 최대 투영) 공초점 z-stack을 사용했다. 도 2A는 DGAT1 억제제의 유무에 관계없이 처리된 건강한 대조군 오르가노이드에서 LD 염색의 대표적인 결과를 나타낸다. 이러한 이미지의 정량화는 힘들지만, 공초점 분석은 주로 비정상적인 LD 형성을 확인하는 시각화 도구로 작용합니다. 공초점 현미경 시료의 정량화는 또한 형광플레이트리더(도 2B)를사용하여 수행될 수 있으며, 형광 Hoechst 신호로 정규화된다. 플레이트 리더 분석은 치료되지 않은 오르가노이드에 비해 DGAT1 억제제(D1i)로 처리된 오르가노이드 세포에서 LD540 신호의 현저한 감소를 나타낸다.
개별 세포에서 LD 형성의 정량화는 유세포계를 사용하여 달성될 수 있다. 해리된 인간 장 오르가노이드에 사용되는 게이팅 전략은 그림 3A에나타내고 있다. FSC-A/SSC-A 플롯에서 게이팅의 첫 번째 단계는 '라이브'(고정된 경우) 단일 셀의 첫 번째 선택입니다. 이슬, 삼중항 또는 더 큰 세포 덩어리를 추가로 제외하기 위해 FSC-W/FSC-H 및 SSC-W/SSC-H에 두 개의 추가 게이팅 단계가 포함되었습니다. 마지막으로, FSC-A/Hoechst에 게이팅은 고정하기 전에 죽거나 죽은 세포의 배제를 보장합니다. 도 3B,C는 최종 라이브 셀 집단의 SSC-A 및 LD540 신호 둘 다의 히스토그램을 나타낸다. LDF는 세포내 지질 방울의 형성으로 인해 SSC-A의 증가를 초래할 것이다. 또한, LD540 LD540 LDDs에 저장 되는 지질에 대 한 얼룩및이 신호는 또한 LDF 유도 시 증가 할 것 이다. 이와 같이, LD 형성은 SSC-A 및 LD540 둘 다의 MFI의 변화로서 측정된다(도3D,E). MFI를 플롯하고 통계 분석을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1: 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 구상된 오르가노이드 배양. (A, B) 공초점 및 형광 플레이트 판독기 방법의 경우, 오르가노이드가 BMM 액적에서 너무 높은 밀도로 시드되지 않는 것이 중요하다. (a)오가노이드는 250개의 세포/μL의 적절한 밀도로 시드되고,(B)오르가노이드는 너무 높은 밀도로 시드되어 오르가노이드와 세포 사멸의 중첩을 일으켰다. (C, D) OA를 가진 하룻밤 자극 후에, LD 대형은 시각적으로 평가될 수 있습니다. (C)오가노이드를 12% BSA 비히클 대조군으로 밤새 배양하였다. (D)오가노이드를 BSA에 1 mMOA로 하룻밤 배양하여 어두운 외관을 초래하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 공초점 이미징 및 형광 플레이트 판독기를 사용하여 LDF 특성화의 대표적인 결과. 건강한 대조군 유래 오르가노이드는 BSA, 1 mM OA, 또는 1 mMM OA+D1i로 밤새 자극되었습니다. (A)DAPI(시안) 및 LD540(노란색)에 대해 염색된 85 μm 공초점 스택의 최대 투영. 이 하위 그림은 반 Rijn 외6에서적응된다 . (b)형광 플레이트 리더를 이용하여 측정된 바와 같이 핵 DAPI 신호로 정규화된 LD540의 상대형광 강도. 평균 ± SD는 2개의 생물학적 복제에 대해 플롯된다. 통계적 유의는 Tukey의 포스트호크를 사용한 반복적인 측정 없이 단방향 ANOVA를 사용하여 결정되었습니다. *, P < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 유세포측정을 이용한 LDF 정량화의 대표적인 결과. 건강한 대조군 유래 오르가노이드는 BSA, 1 mM OA, 또는 1 mMM OA+D1i로 밤새 자극되었습니다. (A)오가노이드 유래 단일 세포에 대해 선택하는 게이팅 전략. 왼쪽에서 오른쪽으로 먼저 FSC-A/SSC-A에 대한 게이팅을 통해 이물질을 제거합니다. 그런 다음 FSC-W/FSC-H 및 SSC-W/SSC-H의 게이트를 사용하여 이중, 삼중항 또는 더 큰 세포 덩어리를 제외합니다. 마지막으로, FSC-A/Hoechst가 라이브 셀을 선택할 수 있는 게이트입니다. SSC-A 와 LD540 채널은 모두 LD 형성을 정량화하는 데 사용됩니다. 이들 파라미터의 히스토그램은 OA를 가진 자극시(B)SSC-A 및(C)LD540의 평균 형광 강도(MFI)의 변화를 나타낸다. (D,E) 샘플당 MFI를 그래프로 플롯하여 통계 분석을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 평균 ± SD는 3개의 생물학적 복제에 대해 플롯된다. 통계적 유의는 Tukey의 포스트호크를 사용한 반복적인 측정 없이 단방향 ANOVA를 사용하여 결정되었습니다. *, P < 0.05; **, P & 0.01; , P < 0.001. 이 그림은 반 Rijn 외6에서적응 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 화학 | 용 매 | 재고 농도 | 최종 농도 |
| Wnt3a CM | - | 100% | 50% |
| R-스폰딘-1 CM | - | 100% | 20% |
| 노긴 CM | - | 100% | 10% |
| A83-01 (TGFβ-inh) | Dmso | 50 mM | 500 nM |
| B27 | - | 50x | 1x |
| mEGF | PBS/0.1% BSA | 500 μg/mL | 50 ng/mL |
| N-아세틸 | 물 | 500 mM | 1.25 mM |
| 니코틴아미드 | Pbs | 1 M | 10 mM |
| 프리모신 ()프리모신 (MCB가 냉동실에 보관될 때까지 사용) |
- | 50 mg/mL | 100 μg/mL |
| SB202190 (P38 inh) | Dmso | 30 mM | 10 μM |
보충 표 1: 오르가노이드 팽창 매체를 위한 조리법.
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Discussion
여기에서, 우리는 올레산으로 배양시 인간 장 오르가노이드에서 LD 형성을 결정하는 프로토콜을 제공한다. 이 방법은 LD 특이적 형광 염료 LD54018을기반으로 하며, 이는 오르가노이드 배양 내의 지질 방울의 총 부피의 특성화 및 정량화를 가능하게 한다. 인간의 장 내 오르가노이드 문화를 확립하고 유지하는 절차는13이전에 발표되었으며,이 프로토콜의 시각적 가이드도15.
이 프로토콜의 중요한 단계는 인간의 장 오르가노이드의 문화, 그리고 BSA에 OA의 적절한 융합이다. 오르가노이드의 배양은 줄기 세포 집단의 유지가 기능성 Wnt3A-CM에 크게 의존하기 때문에 배양 배지의 정확한 제형을 필요로 한다. Wnt3A-CM이 사내에서 제작되는 경우, 약 2개월의 만료 시간으로 인해 고도로 표준화된 워크플로우와 컨디셔닝 매체의 월별 생산을 권장합니다. 또한, 연속적인 Wnt3A-CM 배치의 1:1 혼합은 약간 최적 이하의 배치가 오르가노이드 성장에 큰 영향을 미치지 않도록 하기 때문에 보다 일정한 장기 배양을 초래합니다.
또한, 우리의 BM은 지질이 풍부한 BSA를 포함하는 고급 DMEM / F12 매체로 구성되어 있습니다. 우리의 비히클 제어 (12% BSA/BM)는 오르가노이드에서 LD 형성을 유도하지 않기 때문에, 우리는 BM에 있는 FFA의 양 또는 모형이 LDF 분석결과에 영향을 미치기 위하여 충분하지 않다는 결론을 내립니다.
BSA에 OA의 컨쥬게이션은 몇 가지 최적화를 필요로 할 수있는 섬세한 과정이다. 여기에 설명된 프로토콜이 모든 온도 변화를 꼼꼼하게 따르고 유리 실험실용품을 사용하여 수행할 때 가장 최적이라는 것을 경험했습니다.
이전 연구에서, LD 형성 성 검소 는 LD 크기와 높은 배율8,12숫자를 특성화 하는 데 사용 되었습니다. 이 분석법은 주로 붕소-디피로메테인(BODIPY) 493/503을 사용하여 수행되었으며, 이는 신호 대 잡음 비율이 높은 LD에 우수한 염색을 제공합니다. 그러나, BODIPY의 방출 스펙트럼은 매우 광범위하고, 녹색 형광 단백질 (GFP) 유래 염료의 형광 스펙트럼과 크게 겹칩니다. 우리는 LDF 분석법의 현재 응용 프로그램이 BODIPY와 함께 작동 할 것으로 예상하지만, LD540에 대한 선택은 GFP 레이블(18)와공동 염색을 포함하여 멀티 컬러 이미지의 넓은 범위를 허용합니다. 우리는 또한 지질 얼룩 나일 레드를 사용하여이 분석술을 수행했습니다 (데이터가 표시되지 않음). 그러나, 나일 강 빨강은 LDs 뿐만 아니라 지질 이중층을 얼룩하는 경향이 있기 때문에, 우리는 나일 강 빨강의 높은 배경 신호가 LD 형성의 작은 다름을 구별하기 위하여 우리의 분석실험의 수용량을 낮춥니다 것을 것을을 발견했습니다. 이러한 이유로, 우리는 유기성 기반 LDF 분석에서 LD540을 사용하는 것을 선호합니다.
고배율 LDF 분석기를 사용한 이전 연구에 비해, 여기서 설명하는 분석법은 많은 세포 집단에서 총 LD 부피의 높은 처리량 정량을 허용합니다. 따라서, 특히 형광판 판독기 의 정량화, 및 잠재적으로 유세포 분석, LD 형성에 대한 약물의 효과를 테스트하기 위해 스케일링될 수 있다. 우리가 보여 준 바와 같이 LD 형성은 크게 DGAT1 의존, DGAT1 결핍 환자 유래 또는 D1i 처리 된 오르가노이드는 이러한 스크리닝의 적용을위한 명확한 기회를 나타냅니다. 특히 이러한 희귀 질환의 경우, 환자 유래 오르가노이드와 결합된 LDF 분석법으로 새로운 치료 약물에 대한 환자 별 스크리닝을 위한 플랫폼을 제공할 수 있다.
그러나 처리량이 높은 접근 방식의 결과는 개별 LD를 특성화하는 힘이 손실된다는 것입니다. LD의 고배율 전자 현미경 또는 형광 시각화는 LD 크기와 숫자12,19의역학을 연구하는 데 사용될 수 있지만, 고처리량 접근법은 여러 개의 작거나 적은 것을 구별하지 않습니다. 큰 LDs 및 따라서 LD의 총 부피가 일정하게 남아 있는 LD 물질 대사에 있는 다름을 정량화하기 위하여 이용될 수 없습니다. 따라서 LD의 수 나 크기가 관심있는 것으로 의심되는 응용 프로그램에서는 처리량이 낮고 배율이 높은 기술로 해결해야합니다. 더욱이, 현재 분석에서 오르가노이드는 식이 지질이 전형적으로 정점 막에서 채택되는 동안 basolateral 지질 자극을 수신합니다. 따라서 결과 생리 적 상황으로 번역 하는 경우 몇 가지 주의 필요.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
LD540을 아낌없이 제공해 주신 B. Spee에게 감사드립니다. 이 작품은 과학 연구 보조금에 대한 네덜란드 조직에 의해 지원되었다 (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) - S.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100x) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
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