Summary
Этот протокол описывает анализ для характеристики липидных капель (LD) формирования в человеческих кишечных органоидов при стимуляции жирными кислотами. Мы обсуждаем, как этот анализ используется для количественной оценки образования ЛД, и как он может быть использован для высокой пропускной связи скрининга на наркотики, которые влияют на образование ЛД.
Abstract
Диетические липиды принимаются в качестве свободных жирных кислот (ФА) кишечным эпителием. Эти FAs внутриклеточные преобразуются в молекулы триглицеридов (TG), прежде чем они упакованы в chylomicrons для транспортировки в лимфу или в цитосолитовые липидные капли (ЛД) для внутриклеточного хранения. Решающим шагом для формирования ЛД является каталитическая активность диацилглицерола ацилтрансферазы (DGAT) в заключительном этапе синтеза TG. LDs важны для буфера токсичных видов липидов и регулировать клеточный метаболизм в различных типах клеток. Так как человеческий кишечный эпителий регулярно сталкивается с высокой концентрацией липидов, образование ЛД имеет большое значение для регулирования гомеостаза. Здесь мы описываем простой анализ для характеристики и количественной оценки образования ЛД (ЛДФ) при стимуляции с наиболее распространенными ненасыщенными жирными кислотами, олеиновой кислотой, в кишечных органоидах человека. Анализ LDF основан на LD-специфическом флуоресцентном красителе LD540, который позволяет количественно оценивать LDs конфокальной микроскопией, флуоресцентным считыванием пластин, или цитометрией потока. Анализ LDF может быть использован для характеристики образования ЛД в кишечных эпителиальных клетках человека, или для изучения человеческих (генетических) расстройств, которые влияют на метаболизм ЛД, таких как дефицит DGAT1. Кроме того, этот анализ может также быть использован в высокой пропускной связи для тестирования новых терапевтических соединений, которые восстанавливают дефекты в образовании ЛД в кишечнике или других типах органоидов.
Introduction
Липиды являются важнейшим компонентом рациона человека и играют важную роль в системном хранении энергии и обмене веществ. При попавании, диетические липиды деградируют в свободные жирные кислоты (FFAs) и моноглицериды (MGs) поджелудочной липасы. Эти субстраты затем принимаются энтероцитов кишечного эпителия, где они впервые повторно эстерикрины диглицеридов (DG) моноглицерид acyltransferases (MGAT) ферментов, а затем триглицеридов (TG) по диацилглицерола ацилтрансфераза 1 (DGAT1)1. Наконец, эти TGs интегрированы в либо хиломикроны для экспорта в лимфодренаж или цитосолико липидных капель (LDs) для внутриклеточного хранения2,3. Хотя хиломикроны необходимы для распространения диетических липидов в другие органы, важность внутриклеточного хранения жира в ЛД не совсем ясно. Тем не менее, LDs было показано, чтобы выполнять регулятивные функции в кишечнике, так как они медленно высвобождают липиды в циркуляцию до 16 ч после еды4. Кроме того, Было показано, что ЛД защищают от токсичных концентраций жирных кислот, таких как адипоциты мыши во время липолицовых состояний5.
Белок DGAT1 расположен на эндоплазмической мембране ретикулума (ER) и играет решающую роль в формировании ЛД в эпителии кишечника. Гомозиготные мутации в DGAT1 приводят к раннему началу тяжелой диареи и/или рвоты, гипоальбуминемии и/или (смертельной) белково-терпящей энтеропатии с кишечной недостаточностью при жировом наедевидеи, иллюстрируя важность DGAT1 в липидном гомеостазах человека кишечный эпителий6,7,8,9,10. Поскольку возникновение дефицита DGAT1 у людей встречается редко, доступ к первичным клеткам, полученным пациентом, был скудным. Кроме того, долгосрочная культура кишечных эпителиальных клеток уже давно ограничивается опухолевыми клеточными линиями, которые представляют нормальную физиологию только в ограниченном плане. Таким образом, DGAT1-опосредованного образования ЛД в основном были изучены в фибробластов или животных полученных клеточных линий7,10,11,12. Таким образом, недавно было показано, что DGAT1-дефицитных пациента полученных фибробластов накапливаются меньше LDs по сравнению со здоровыми контрольными клетками после стимуляции с олеиновой кислотой (ОА)8.
Ранее были установлены протоколы для культуры эпителиальных стволовых клеток из любого желудочно-кишечного органа в виде трехмерных (3D) органоидов13. Эти кишечные органоиды могут храниться в культуре в течение длительного периода времени13, и позволяют функциональное исследование пациента и кишечного расположения конкретных эпителиальных характеристик14. Они генетически и фенотипически стабильны и могут храниться, что позволяет долгосрочное расширение и биобанкинг13.
Недавно мы показали, что образование ЛД может быть легко измерено в кишечных органоидов человека в формировании ЛД (LDF) анализ6. При воздействии ОА в течение 16 ч органоиды генерируют ЛД для защиты клеток от липидной токсичности. Когда концентрации ОА слишком высоки, клетки умирают от каспасопо-опосредованного апоптоза6. Ранее было показано, что ассси LDF в значительной степени зависит от DGAT1, о чем свидетельствуют органоиды, полученные от пациентов DGAT1-мутантов и использование ингибиторов DGAT1-специфических6.
Для анализа LDF, подробно описанного здесь, 3D органоиды культивируются из кишечной биопсии и проходят еженедельно путем нарушения в одиночных клетках, которые легко образуют новые органоиды. Для выполнения dF-ассссса, 7500 одиночных клеток, полученных от органоидов, покрываются в каждом колодце 24-колодца пластины. Органоиды образуются в течение нескольких дней, инкубируется на ночь с 1 мМ ОА и окрашенных LD540, флуоресцентные клетки проницаемой LD-специфический краситель, который облегчает визуализацию. Формирование ЛД затем количественно конфокальной микроскопии, флуоресцентные пластины читателя, или поток цитометрии.
Путем масштабировать это испытание образования LD к формату 96-наилучшим образом, анализ можно также использовать для высокопроемного анализа образования LD для того чтобы экранировать для новых снадобиь которые влияют на образование LD в людских кишечных органоидных культурах, или изучить (людской генетические) разлады которые влияют на Метаболизм ЛД.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с использованием человеческих тканей, описанных в данном случае, были одобрены комитетом по этике в Университетском медицинском центре Утрехта (UMCU). Информированное согласие на сбор тканей, генерацию, хранение и использование органоидов было получено от пациентов Вильгельминской детской больницы (ВКЗ) -УМКУ.
1. Подготовка культурных сми
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол должен выполняться внутри шкафа биобезопасности. Органоиды должны быть обработаны в соответствии со стандартными руководящими принципами клеточной культуры.
- Подготовка базальной среды культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Культура среды без факторов роста называется базальной среде (BM).- Добавьте 5 мл HEPES (1 М), 5 мл L-глутамина (100x) и 5 мл пенициллина-стрептомицина (5000 U/mL) до 500 мл передовой среды Dulbecco Eagle с питательной смесью ветчины F-12 для подготовки БМ среды.
- Храните подготовленный БМ-среду при 4 градусах По Цельсию и используйте максимум 2 месяца.
- Подготовка R-спондин и Noggin кондиционированных средних (CM) в соответствии с протоколом производителя.
- Кратко, вырастите вверх клетки к пожеланное количество в hyperflasks с 5 x 107 клетками в среде 555 mL без селективного антибиотика в колбу.
- Выращивайте клетки в течение 4 дней до слияния.
- Замените средство БМ и культуры на 8 дополнительных дней.
- После 8 дней культуры при 37 градусах Цельсия, соберите среду культуры и центрифугу в течение 5 минут при 450 х г, чтобы гранулировать все оставшиеся клетки.
- Фильтр стерилизовать супернатант, и хранить aliquots из R-спондин или Noggin CM на -20 градусов по Цельсию в течение максимум 6 месяцев.
- Подготовка Wnt3A-CM в соответствии с Boj и др.15.
- Кратко, вырастите вверх клетки до нужного количества в тарелках 145 mm с 2 x 106 клетками в среде 20 mL без селективного антибиотика в тарелку. Оберните каждое блюдо с пластиковой фольгой, чтобы избежать испарения культуры среды.
- После 8 дней культуры при 37 градусах Цельсия, соберите среду культуры и центрифугу в течение 5 минут при 450 х г, чтобы гранулировать все оставшиеся клетки.
- Фильтр стерилизовать супернатант, и хранить aliquots Wnt3A-CM на 4 кв с в течение максимум 2 месяцев.
- Подготовка органоидного расширения среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Человек малых кишечных органоидов среды расширения (см. рецепт в дополнительной таблице 1) называется hSI-EM. Следующие шаги будут производить окончательный объем 1 L hSI-EM, и могут быть масштабированы вверх или вниз по мере необходимости.- Растворите 1,46 г никотинамида в 12 мл фосфатно-буферного соления (PBS) софосфатного соления (PBS) для окончательного разбавления 1 М.
- Растворите 245 мг n-ацетилциана в 3 мл класса клеточной культуры PBS, чтобы создать окончательное разбавление 500 мМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для ускорения формирования раствора никотинамид и n-ацетил цистеин можно инкубировать на водяной бане при 37 градусах Цельсия. Оба решения могут быть подготовлены в пакете, aliquoted, и храниться при -20 градусов по Цельсию для будущего использования. - Фильтр стерилизовать оба раствора через фильтр 0,22 мкм в стерильную трубку 15 мл.
- Добавьте 167 мл БМ в стерильную культурную среду 500 мл. Добавьте 200 мл R-Spondin-CM, 100 мл noggin-CM и 100 л рекомбинантных mEGF (500 мкг/мл) к конечной концентрации 50 нг/мл.
- Добавьте 10 мл стерилизованного раствора никотинамида и 2,5 мл стерилизованного n-ацетилциена. Добавьте 20 мл дополнения B27 (50x).
ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе среда называется hSI-EM без WAS (Wnt3A-CM, A83-01 и SB202190), и может быть алицитирована и храниться при -20 градусов по Цельсию. Если среда отодвинется на меньшие объемы, соответствующим образом отрегулируйте концентрации следующих шагов. - До 500 мл hSI-EM без WAS, добавить 10 мл Wnt3A-CM последней свежеподготовленной партии и 10 мл Wnt3A-CM второй последней партии, чтобы свести к минимуму изменения изменчивости в условиях Wnt3A-CM.
- Добавьте A83-01 к конечной концентрации 500 нм, а SB202190 — к конечной концентрации в 10 мкм.
- Храните готовый hSI-EM (с WAS) при 4 градусах по Цельсию и используйте в течение максимум 2 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте дополнительные Y-27632 к конечной концентрации 10 мкм (называемой hSI-EM-Y), когда крипты или одиночные клетки культивируются или органоиды начинаются с криоконсервации.
- Подготовьте флуоресцентный активированный сортировку клеток (FACS).
- Добавьте 10 мл сыворотки плода икры (FCS) до 40 мл PBS без Ca2 "/Mg2" для окончательной концентрации 10% FCS.
ПРИМЕЧАНИЕ: FCS предотвращает примыкания клеток к лабораторным программам.
- Добавьте 10 мл сыворотки плода икры (FCS) до 40 мл PBS без Ca2 "/Mg2" для окончательной концентрации 10% FCS.
2. Культурные процедуры для малых кишечных органоидов человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол должен выполняться внутри шкафа биобезопасности. Органоиды должны быть обработаны в соответствии со стандартными руководящими принципами клеточной культуры. При обращении с органоидами или органоидными клетками клетки должны быть сохранены на льду, когда это возможно. Клетки будут оставаться жизнеспособными в течение нескольких часов после сбора урожая, когда это будет обеспечено. Органоиды должны быть культивированы в стандартном инкубаторе культуры клеток при 37 градусах Цельсия с 5% CO2. Эти условия применяются ко всем инкубационным шагам с органоидами, встроенными в мембранную матрицу подвала (BMM; т.е. Matrigel) на протяжении всего этого протокола. Авторы использовали duodenum полученных органоидов для этих анализов.
- Пассивные органоиды
Примечание: Каждая органоидная культура имеет свое собственное время удвоения. Как правило, небольшие кишечные органоиды могут просажещеться по 1:3–1:5 каждые 7–10 дней. При прохождении в качестве одиночных ячеек, пропускная способность может быть до 1:20, в зависимости от плотности клеток. Для создания и обслуживания органоиды культивируются в 24-колодцах; для ldF асссе, в 24- или 96-колодец пластин.- Подготовка
- Предварительно разогреваемые 24-ну хорошо ткани культуры пластин в инкубаторе на 37 градусов по Цельсию, 5 % CO2 по крайней мере на ночь и желательно 5 дней вперед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное потепление тканевых культурных пластин в инкубаторе клеточной культуры обеспечивает правильное образование и привязку органоидносодержащих капель БММ. - Чтобы уменьшить количество циклов заморозки оттепели, приготовьте 1 мл аликвот БММ и храните при -20 градусов по Цельсию. Оттепель флакон БММ на льду не менее 30 минут до начала процедуры пропуска органоидов.
- Держите 50 мл трубки БМ на льду, как стиральная среда.
- Подготовьте hSI-EM, как описано в разделе 1.4, и подготовьте соответствующее количество hSI-EM-Y, например, 15 мл для полной 24-хорошей пластины.
- Предварительно разогреваемые 24-ну хорошо ткани культуры пластин в инкубаторе на 37 градусов по Цельсию, 5 % CO2 по крайней мере на ночь и желательно 5 дней вперед.
- Собирайте органоиды.
- Тщательно аспирируйте культурную среду, не нарушая капель БММ.
- Добавьте 500 л холодного БМ к первому колодцу органоидов и нарушить капли БММ с помощью органоидов, мягко прокладывая вверх и вниз с помощью трубки P1000.
- Повторите эту процедуру с той же среде в следующем хорошо, как требуется, но не урожай более 2 скважин на 500 Л. БМ.
- Соберите органоиды в низкосвязывающей 1,5 мл микроцентрифуговой трубки и вращайтесь в мини-центрифуге столешницы на 15–20 с (максимум 2000 х г). Аспирируйте супернатант полностью и удалить последний бит среды с P200 pipet.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда культуры органоидов выглядят чистыми под микроскопом и не содержат мертвых клеток или другого мусора, капли БММ могут быть собраны непосредственно в трипсине вместо БМ в шаге 2.1.2.2. После шага 2.1.2.3 приступай непосредственно к инкубации в шаге 2.1.3.1.
- Диссоциатив органоидов на одиночные клетки.
- Добавьте 400 зл трипсина в закрученные органоиды. Инкубировать органоиды при 37 градусах по Цельсию в течение 5 минут в водяной бане.
- Нарушить остальные агрегаты клеток путем pipetting вверх и вниз осторожно с P200 pipet. Опять же, инкубировать органоиды при 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут в водяной бане.
- Проверьте ход диссоциации клеток под микроскопом с помощью 4x увеличения. Повторите ручной сбой и инкубацию при сохранении больших скоплений клеток.
- Когда остаются только одиночные клетки, добавьте 1 мл БМ и вращайте клетки в мини-центрифуге столешницы на 15–20 с.
- Аспирируй супернатант полностью. Повторное использование одиночных ячеек в 200 л свежих hSI-EM с помощью трубки P200. Добавьте еще 800 л hSI-EM.
- Подсчитайте количество клеток в подвеске.
ПРИМЕЧАНИЕ: В лаборатории авторов ручной подсчет разъединенных органоидных клеток дает более надежные результаты, чем автоматизированный счетчик клеток. При использовании автоматизированного счетчика клеток плотность клеток для приложений ниже по течению должна быть протестирована в доме и скорректирована, если слишком мало или слишком много органоидов вырастают.
- Органоиды семян для поддержания или липидного образования капель.
- Рассчитайте объем клеток, который необходим для конечной плотности клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 250 ячеек/Л является соответствующей плотностью. В 24-колодской пластине, 30 qL посеяны в каждую скважину, в то время как 5 qL посеяны в каждый колодец из 96-хорошо пластины. - Выняйте соответствующий объем подвески и отрегулируйте плотность до 750 ячеек/ЗЛ (или вращайтесь вниз и приостанавливайте, когда плотность слишком низкая).
- Добавьте BMM к подвеске ячейки в соотношении 2:1. Окончательная плотность клеток в этой смеси составляет 250 ячеек/ЗЛ. Аккуратно смешать подвеску путем пипетки, тщательно избегая пузырьков.
- В предварительно разогретой пластине культуры тканей, семена из трех капель 10 л на хорошо в 24-хорошо пластины или одной капли 5 л на хорошо в 96-хорошо пластины.
- Поместите пластину в инкубатор при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 на 10-15 мин, чтобы укрепить капли БММ. Между тем, предварительно разогреть соответствующее количество hSI-EM-Y в водяной бане при 37 градусах Цельсия.
- Аккуратно добавляйте 500 л предварительно разогретого hSI-EM-Y к каждой скважине из 24-ну хорошей пластины или 100 л к каждой скважине из 96-хорошей пластины. Инкубировать клетки в инкубаторе при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 и через 2-3 дня меняют среду на hSI-EM (без Y) и обновляют 2–3 раза в неделю.
ПРИМЕЧАНИЕ: После 7-10 дней, культура обслуживания органоидов должна быть пройдена снова.
- Рассчитайте объем клеток, который необходим для конечной плотности клеток.
- Подготовка
3. Липид капли Формирование Асса
- Приготовление конъюгированной олеиновой кислоты
ПРИМЕЧАНИЕ: Так как олеиновая кислота (ОА) является гидрофобной и не растворимый в воде, она спрятана с бычьим сывороточным альбумином (BSA). BSA может связывать несколько молекул жирных кислот и в этом случае используется в соотношении 1:8, чтобы сделать олеиновой кислоты доступными для кишечных клеток. Свободные жирные кислоты и BSA могут как связываться с пластиковой лабораторной посуды. Для обеспечения надлежащей конечной концентрации, используйте стеклянные флаконы и стеклянные пипетки, когда это возможно.- Взвешивание 0,2 г жидкой олеиновой кислоты при комнатной температуре. Добавьте 1,5 мл культурно-классового стерильного PBS и нагрейте смесь до 70 градусов по Цельсию в течение 1 ч. Vortex с перерывами.
- Взвесить 5,89 г безжирной кислоты BSA и растворить в 33,9 мл PBS. Разогрейте смесь на водяной бане при 37 градусах Цельсия до полного растворения BSA.
- Vortex ОА смесь снова создать эмульсию мелких капель и сразу же добавить его в раствор BSA с помощью стеклянного пифета. Держите окончательное решение близко к 37 градусов по Цельсию после добавления ОА. Конечная смесь состоит из 20 мм ОА в 2,5 мм BSA.
- Держите смесь при 37 градусах По цельсии в течение 30 мин до тех пор, пока не останется прозрачный желтоватый раствор.
- Конъюгированный OA-BSA может быть алицитирован и заморожен при -20 градусов по Цельсию в течение не менее 6 месяцев. При оттаивании аликота, инкубировать его при 37 градусах Цельсия, пока облачность не растворится и смесь снова не станет прозрачной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за высокого содержания белка и липидов конечного раствора смесь не может быть стерилизована или аутоклавирована. Когда компоненты были обработаны с осторожностью, в ламинарном капоте потока, когда это возможно и с использованием стерильных PBS, авторы не испытывали микробных инфекций.
- LDF конфокальный ассси
- Подготовка образцов
- Органоиды прохода, описанные в разделе 2.1. Семя из органоидов полученных одиночных клеток в черной ясной нижней 96-колой пластины.
- На 6-й день культуры на hSI-EM замените культурную среду на hSI-EM, содержащую 1 мМ ОА-БСА.
- Инкубировать клетки в течение 16-17 ч (ночь) при 37 градусах Цельсия при наличии или отсутствии ингибитора 0,1 ММ DGAT1. Включите управление транспортным средством 2,5 мМ BSA.
- После 16-17 ч, аспирируй среду, не нарушая капли БММ. Зафиксировать органоиды, добавив 100 qL 4% нейтрального буферного формальдегида в скважины в течение 30 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Формальдегид частично растворит БММ, а органоиды опустятся на дно и прилипают к нижней части пластины. - Снимите формальдегид осторожно, и тщательно промыть колодцы с 150 Л Л PBS в скважине.
- Пятно клеток для LDs с 0,025 мг/мл LD540 и 4 ",6-диамидино-2-фенилинол (DAPI) в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте.
- Тщательно вымойте колодцы с помощью PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь, когда это необходимо. Держите образцы покрыты PBS в темноте при 4 градусах Цельсия. Окрашивание LD540 будет оставаться стабильным в течение недели. Этот ассес также может быть выполнен с живыми клетками, чтобы контролировать образование ЛД в течение определенного периода времени. Для этого фиксация должна быть исключена из протокола, а DAPI должна быть заменена окрашиванием Hoechst. LD540 может окрашивать ЛД в живых клетках в той же концентрации, что описано.
- Конфокальная визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение может быть выполнено на подготовленных образцах органоидов в черной прозрачной пластине 96-ну колодца.- Для обзора изображений целых органоидов используйте 40-разную цель, подходящую для конфокальной флуоресцентной визуализации.
- Установите микроскоп для изображения канала DAPI на 405 нм возбуждения и около 410-535 нм длины эмиссии волны. Для красителя LD540 выбирайте возбуждающего лазер ат-энм на 540 нм (543 нм оптимально) и устанавливайте фильтры выбросов до 545-700 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе была использована лазерно-сканирующая конфокальная система с белым световым лазером, акусо-оптическим сплиттером (AOBS), целью 10x/20x и системой спектрального обнаружения. Это позволяет точно подставить на определенные длины волн. Если сопоставимая система недоступна, выберите лазерные линии и фильтры с коротким/длинным проходом, близкие к вышеуказанным спецификациям. Для цельно-органоидной визуализации достаточно разрешения 512 x 512 или 1024 x 1024 для анализа изображений ниже по течению. - Установите размер пинхола до 1 воздушного блока (AU) для достаточного разрешения z-оси.
- Чтобы собразить половину сферического органоида, установите z-стек примерно до 85 мкм.
- Анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа изображений, Фиджи / ImageJ16,17 был использован для создания максимальных прогнозов. Анализ может быть выполнен с любым пакетом программного обеспечения для анализа изображений, который позволяет максимально проекции, ручного порога и анализа частиц.- Используя Фиджи/ImageJ, преобразуйте z-стек каждого органоида в максимальную проекцию: Изображение Стеки З-проект.
- Установите порог максимальной проекции до уровня, на котором в образе управления транспортным средством BSA не виден сигнал LD540: Изображение Отрегулируйте (англ.) Пороговый . Используйте эти настройки для порога каждого изображения.
- Измерьте общую площадь флуоресценции для каждой максимальной проекции с помощью функции Анализ Анализ частиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя разрешение анализа лучше использовать конфокальный микроскоп, этот анализ также может быть проанализирован с помощью флуоресцентного считывателя пластин с аналогичными фильтрами. Чтобы нормализовать для количества органоидов в скважине, сигнал LD540 должен быть разделен сигналом DAPI. Наконец, сигнал управления транспортным средством BSA должен быть вычтен для нормализации измерений. Такой подход позволяет масштабировать ассеидов в 96-ну хорошо формат пластины.
- Подготовка образцов
- Цитометрический ассс лДФ
- Подготовка образцов
- Органоиды прохода, описанные в разделе 2.1. Семя из органоидов полученных одиночных клеток в 24-хорошо ткани культуры пластины. Две скважины на состояние достаточно для цитометрии потока.
- На 10-й день культуры на hSI-EM замените культурную среду на hSI-EM, содержащую 1 мМ ОА-БСА.
ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от конфокального анализа, 10 дней роста в EM был выбран для анализа цитометрии потока вместо 6 дней. Дополнительные 4 дня расширения приведет к оптически перекрывающихся органоидов, которые осложнят микроскопии на основе анализ. Однако, большее количество клеток облегчает анализ цитометрии потока. - Инкубировать клетки в течение 16-17 ч (ночь) при 37 градусах Цельсия при наличии или отсутствии ингибитора 0,1 ММ DGAT1. Включите управление транспортным средством 2,5 мМ BSA.
- После 16–17 ч соберите органоиды, как описано в разделе 2.1.2.
- Диссоциатив органоидов на одиночные клетки, как описано в разделе 2.1.3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это и не требуется строго, рекомендуется проверить количество клеток в каждом образце. Общее количество 10 000 ячеек на образец является абсолютным минимумом, необходимым для достаточного разрешения. Для достижения оптимальных результатов используйте около 50 000-100 000 ячеек. - Спин вниз клетки в мини столешница центрифуги для 15'20 s.
- Пятно каждого образца с 500 л 0,025 мг/мл LD540 и 1 мкг /мл Hoechst в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте.
- Спин вниз клетки в мини столешница центрифуги для 15'20 s и мыть 3x с PBS.
- Зафиксировать клетки, приостановив их в 500 л 4% нейтрального буферизированного формальдегида в течение 15 минут при комнатной температуре.
- Спин вниз клетки и мыть 3x с FACS буфера.
- Предварительно промыть трубки FACS с буфером FACS, чтобы предотвратить клетки, прилипающие к трубной стенке.
- Повторное увеличение количества ячеек в 200 кЛ буфера FACS и перенос яточной подвески на предварительно промытые трубки FACS.
- Цитометрический анализ потока
- Установите параметры gating, чтобы исключить мертвые клетки и скопления клеток (см. раздел репрезентативных результатов).
- В окончательной закрытой популяции, мера по крайней мере 10000 клеток для надежных результатов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из этой популяции средняя интенсивность флуоресцентных (МФО) LD540 и средний сигнал SSC-A вместе обеспечивают измерение общего объема образования ЛД на клетку.
- Подготовка образцов
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для правильного анализа образования ЛД органоиды не должны быть засеяны слишком плотно до стимуляции с ОА и последующего окрашивания. Это особенно важно для считывателя конфокальных и пластин, так как перекрывающиеся органоиды могут мешать флуоресценции. Показан пример правильной плотности органоида(рисунок 1А)и культуры с перекрывающимися органоидами(рисунок 1B). Чтобы свести к минимуму изменчивость стимуляции образца с помощью ОА, размер органида и плотность посева должны быть сопоставимы между образцами в рамках одного эксперимента. Это лучше всего контролировать путем посева равное количество одиночных клеток. Тем не менее, некоторые корректировки могут быть необходимы, если определенные органоидные линии последовательно показывают более высокую эффективность восстановления и, таким образом, последовательно более высокое количество органоидов.
После стимуляции с 1 мМ ОА ночь, образование ЛД может быть визуализирована с перевернутым ярким полем микроскопа. Накопление ЛД рассеивает передаваемый свет, и поэтому органоиды кажутся более темными, в то время как нестимулированные органоиды имеют полупрозрачный вид(рисунок 1С). Пример образования ЛД, показанный под ярким полевым микроскопом, показан на рисунке 1D. Это явление может быть использовано для оценки экспериментальных условий до флуоресцентного считывателя. Когда положительный контрольный образец не является визуально темнее отрицательного контрольного образца, или когда очевидна гибель обширных клеток, эксперимент следует отказаться. Поскольку FFAS токсичны для клеток в более высоких концентрациях, а смертельная концентрация отличается между видами FFAs, оптимальная субсмертельная концентрация, которая вызывает образование ЛД, должна быть титрами для каждого применения.
После того, как ОА стимулировали органоиды фиксированной и окрашенных в соответствии с протоколом, LDF может быть визуализирована с помощью конфокального микроскопа. Поскольку органоиды являются 3D структурами, регулярный эпифлуоресцентный микроскоп не подходит из-за фонового сигнала, не сфокусируемого. Поэтому мы использовали (максимальную проекцию а) конфокальный z-стек для характеристики LDF в органоидах. На рисунке 2показан репрезентативный результат ld окрашивания в здоровых органоидов контроля, которые лечились с ингибитором DGAT1 или без нее. Хотя количественная оценка этих изображений является трудоемкой, конфокальный анализ служит главным образом в качестве инструмента визуализации для проверки ненормального образования ЛД. Количественная оценка образцов конфокальной микроскопии также может быть выполнена с помощью флуоресцентного считывателя пластин(рисунок 2B),нормализованного к флуоресцентному сигналу Hoechst. Анализ считывателя пластин указывает на значительное снижение сигнала LD540 в клетках органоидов, обработанных ингибитором DGAT1 (D1i) по сравнению с необработанными органоидами.
Количественная оценка образования ЛД в отдельных клетках может быть достигнута с помощью цитометра потока. Стратегия gating, используемая для диссоциированных кишечных органоидов человека показана на рисунке 3A. Первым шагом gating в FSC-A/SSC-A участок является первый выбор "живой" (когда фиксированной), одиночные ячейки. Чтобы дополнительно исключить дублеты, тройни или большие сгустки клеток, мы включили два дополнительных шага gating на FSC-W/FSC-H и SSC-W/SSC-H. Наконец, gating на FSC-A / Hoechst обеспечивает исключение любых клеток, которые были мертвы или умирают до фиксации. На рисунке 3B,C показаны гистограммы как SSC-A, так и сигнала LD540 окончательной популяции живых клеток. LDF приведет к увеличению SSC-A за счет образования внутриклеточных липидных капель. Кроме того, LD540 пятна для липидов, которые хранятся в LDs и этот сигнал будет также увеличиваться после индукции LDF. Таким образом, образование ЛД измеряется как сдвиг в МФО как SSC-A и LD540(Рисунок 3D, E). МФО могут быть построены и использованы для проведения статистического анализа.
Рисунок 1: Органоидные культуры, визуализированные с помощью яркой микроскопии поля. (A, B) Для методов считывателя конфокальных и флуоресцентных пластин важно, чтобы органоиды не были посеяны в слишком высокой плотности в капельке БММ. (A) Органоиды посеяны в соответствующей плотности 250 клеток / Л. (B) Органоиды были посеяны в слишком высокой плотности, вызывая перекрытия органоидов и клеточной смерти. (C,D) После ночной стимуляции с ОА, образование ЛД может быть оценено визуально. (C) Органоиды были инкубированы ночь с 12% УПРАВЛЕНИЯ транспортным средством BSA. (D) Органоиды были инкубированы ночь с 1 мМ ОА сопряжены с BSA, в результате чего темный вид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные результаты характеристикLD с помощью конфокальной визуализации и флуоресцентного считывателя пластин. Здоровые контрольные органоиды стимулировались в одночасье с BSA, 1 мМ ОА, или 1 мМ ОАЗ1i. (A) Максимальная проекция 85 мкм конфокальные стеки окрашенных для DAPI (циан) и LD540 (желтый). Эта подфигура адаптирована из ван Rijn и др.6. (B) Относительная интенсивность флуоресценции LD540 нормализована к ядерному сигналу DAPI, измеренному с помощью флуоресцентного считывателя пластин. Среднее SD построено для двух биологических репликаток. Статистическая значимость определялась с помощью односторонней ANOVA без повторных мер с пост-специальной Туки. К, П Злт; 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Репрезентативные результаты количественной оценки LDF с использованием цитометрии потока. Здоровые контрольные органоиды стимулировались в одночасье с BSA, 1 мМ ОА, или 1 мМ ОАЗ1i. (A) Стратегия Gating для того чтобы выбрать для органоид-производной одиночных клеток. Слева направо, сначала исключить мусор путем gating для FSC-A/SSC-A. Затем ворота на FSC-W/FSC-H и SSC-W/SSC-H, чтобы исключить дублеты, тройни или большие скопления клеток. Наконец, ворота для FSC-A/Hoechst, чтобы выбрать для живых клеток. Для количественной оценки формирования ЛД используются каналы SSC-A и LD540. Гистограммы этих параметров показывают сдвиг в средней интенсивности флуоресценции (МФИ)(B) SSC-A и (C)LD540 при стимуляции с ОА. (D,E) МФО на выборку можно нарисовать на графике и использовать для проведения статистического анализа. Среднее SD построено для трех биологических репликаток. Статистическая значимость определялась с помощью односторонней ANOVA без повторных мер с пост-специальной Туки. К, П Злт; 0,05; - П.Злт; 0,01; , P Злт; 0.001. Эта цифра адаптирована из ван Райн и др.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Химических | Растворителя | Концентрация запасов | Окончательная концентрация |
| Wnt3a CM | - | 100% | 50% |
| R-спондин-1 СМ | - | 100% | 20% |
| Ноггин СМ | - | 100% | 10% |
| A83-01 (TGF-inh) | Дмсо | 50 мМ | 500 нм |
| B27 | - | 50x | 1x |
| mEGF | PBS/0.1% BSA | 500 мкг/мл | 50 нг/мл |
| N-ацетил | Воды | 500 мМ | 1,25 мМ |
| Никотинамид | Pbs | 1 M | 10 мМ |
| Примоцин (использовать до тех пор, пока MCB не будет в морозильной камере) |
- | 50 мг/мл | 100 мкг/мл |
| SB202190 (P38 inh) | Дмсо | 30 мМ | 10 км |
Дополнительная таблица 1: Рецепт для среды расширения органоидов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы предоставляем протокол для определения образования ЛД в кишечных органоидах человека при инкубации олеиновой кислотой. Этот метод основан на LD-специфическом флуоресцентном красителе LD54018, который позволяет охарактеризовать и количественно определить общий объем липидных капель в органоидной культуре. Процедуры по установлению и поддержанию человеческих кишечных органоидных культур были опубликованы до13, и визуальное руководство этого протокола доступна также15.
Ключевыми шагами в этом протоколе являются культура кишечных органоидов человека и правильное спряжение ОА к БСА. Культура органоидов требует правильной формулировки среды культуры, так как содержание популяции стволовых клеток сильно зависит от функционального Wnt3A-CM. Когда Wnt3A-CM производится в доме, мы рекомендуем высоко стандартизированный рабочий процесс и ежемесячное производство условного носителя в связи со сроком годности около 2 месяцев. Кроме того, 1:1 смешивание последовательных партий Wnt3A-CM приводит к более постоянной долгосрочной культуре, так как гарантирует, что немного неоптимальная партия не окажет существенного влияния на рост органоидов.
Кроме того, наш БМ состоит из передовых DMEM / F12 среды, которая содержит богатые липидов BSA. Поскольку наш контроль над транспортным средством (12% BSA/BM) не вызывает образование ЛД в органоидах, мы пришли к выводу, что количество или тип FFA в БМ не достаточно, чтобы повлиять на анализ LDF.
Спряжение ОА к БСА является деликатным процессом, который может потребовать некоторой оптимизации. Мы испытали, что описанный здесь протокол является наиболее оптимальным, когда все изменения температуры соблюдаются скрупулезно и при выполнении с использованием стеклянной лаборанты.
В предыдущих исследованиях, LD формирования анализы были использованы для характеристики размера ИТ и числа с высоким увеличением8,12. Эти анализы в основном проводились с использованием бор-дипиррометена (BODIPY) 493/503, что обеспечивает отличное окрашивание для ЛД с высоким соотношением сигнала к шуму. Тем не менее, спектр выбросов BODIPY довольно широк, и в значительной степени перекрывается с флуоресцентным спектром зеленого флуоресцентного белка (GFP) полученных красителей. Хотя мы ожидаем, что текущее применение LDF анализ будет работать с BODIPY, а также, выбор для LD540 позволяет более широкий спектр многоцветных изображений, в том числе совместное окрашивание с GFP этикетки18. Мы также выполнили этот анализ с помощью липидного пятна Нила красный (данные не показаны). Однако, так как красный Нил имеет тенденцию пятно не только LDs, но и липидных двухслойных, мы обнаружили, что более высокий фоновый сигнал Красного Нила снижает способность нашего анализа различать небольшие различия образования ЛД. По этим причинам мы предпочитаем использовать LD540 в органоидном ldF-аналитическом центре.
По сравнению с более ранними исследованиями с использованием высокой суммы LDF анализ, анализ мы описываем здесь позволяет высокой пропускной сложности общего объема ЛД в большой популяции клеток. Таким образом, особенно флуоресцентные пластины читателя количественной оценки, и, возможно, поток цитометрического анализа, могут быть масштабированы для тестирования влияния препаратов на образование ЛД. Как мы показали, что образование ЛД в значительной степени DGAT1 зависит, DGAT1-дефицитных пациента полученных или D1i-обработанных органоидов представляют собой четкую возможность для применения такого скрининга. Специально для таких редких случаев заболевания, анализ LDF совмещенный с пациента-производными органоидами смог л.с.
Однако следствием подхода с высокой пропускной способностью является то, что теряется способность охарактеризовать отдельные ЛД. В то время как высокоувеличивательная электронная микроскопическая или флуоресцентная визуализация ЛД может быть использована для изучения динамики в размере ЛД и число12,19, высокопроизводительный подход не проводит различия между несколькими малыми или менее большие LDs и поэтому не могут быть использованы для количественной оценки различий в метаболизме ЛД, где общий объем ЛД остается постоянным. Поэтому в приложениях, где, как предполагается, представляет интерес количество или размер ЫТ, это следует решать с помощью метода более низкого пропускной связи, более высокого увеличения. Кроме того, органоиды в текущем ассиде получают базолотеральной липидной стимуляции в то время как диетические липиды, как правило, занимают на апикальной мембране. Поэтому требуется определенная осторожность, если результаты должны быть переведены на физиологическую ситуацию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим B. Spee за щедрое предоставление LD540. Эта работа была поддержана Нидерландской организацией по научным исследованиям гранта (НВО-ЗонМ; VIDI 016.146.353) до S.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100x) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
- D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
- Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
- Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
- van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
- Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
- Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
- Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
- Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
- Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
- Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
- Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).
