Summary
Hierin presenteren we een gedetailleerd protocol voor het screenen van kleine peptiden die binden aan FGFR2 met behulp van een faag display peptide Library. Verder analyseren we de affiniteit van de geselecteerde peptiden naar FGFR2 in vitro en het vermogen om celproliferatie te onderdrukken.
Abstract
De humane fibroblast growth factor receptor (FGFR) familie bestaat uit vier leden, namelijk FGFR1, FGFR2, FGFR3 en FGFR4, die betrokken zijn bij verschillende biologische activiteiten, waaronder celproliferatie, overleving, migratie en differentiatie. Verschillende aberraties in het FGFR-signalerings traject, als gevolg van mutaties of genamplificatie gebeurtenissen, zijn geïdentificeerd in verschillende soorten kankers. Daarom is recent onderzoek gericht op het ontwikkelen van strategieën met betrekking tot therapeutische targeting van FGFRs. huidige FGFR-remmers in verschillende stadia van pre-klinische en klinische ontwikkeling omvatten ofwel kleine molecuul remmers van tyrosine kinases of monoklonale antilichamen, met slechts enkele peptide-gebaseerde remmers in de pijpleiding. Hier bieden we een protocol met behulp van faag display technologie om kleine peptiden te schermen als antagonisten van FGFR2. Kort, een bibliotheek van phage-getoonde peptiden werd geïncubeerd in een plaat bedekt met FGFR2. Vervolgens werd ongebonden faag afgespoeld door TBST (TBS + 0,1% [v/v] tween-20), en gebonden faag werd geeleerd met 0,2 M glycine-HCL buffer (pH 2,2). De befaamde faag werd verder versterkt en gebruikt als input voor de volgende biopanning. Na drie rondes biopanning werden de peptide sequenties van individuele faag klonen geïdentificeerd door DNA-sequencing. Tot slot, de afgeschermde peptiden werden gesynthetiseerd en geanalyseerd voor affiniteit en biologische activiteit.
Introduction
Fibroblast groeifactor receptoren (FGFRs) spelen belangrijke rollen in celproliferatie, wondgenezing en angiogenese in vivo1. Afwijkende activering van fgfr-signalering waargenomen in een verscheidenheid van tumoren2,3,4,5 omvat genamplificatie, genmutaties, chromosomale afwijkingen en overmatige ligand secretie6 . Veel remmers gericht FGFRs hebben veelbelovende therapeutische effecten aangetoond in klinische proeven en zijn voornamelijk ingedeeld in drie soorten: (1) kleine molecuul kinase remmers, die binden aan het intracellulaire domein van FGFR, (2) antagonisten gericht op de extracellulair segment, en (3) FGF ligand traps6. Hoewel verscheidene van de kleine molecuul kinase remmers goede therapeutische effecten zowel in vitro en in vivo7, de meeste van hen hebben slechte doel specificiteit en vertonen nadelige effecten zoals hypertensie8. De meerderheid van de antagonisten zijn monoklonale antilichamen9,10 en poly peptides11. Peptiden hebben voordelen ten opzichte van kleine moleculen als gevolg van hun specificiteit en lagere bijwerkingen. Ze behouden ook de permeabiliteit van de cel en accumuleren niet in specifieke organen in vergelijking met eiwit drugs12. Vandaar, gerichte kleine peptiden zijn zowel effectieve en potentiële therapeutische agenten.
Phage display technologie is een eenvoudig maar krachtig hulpmiddel voor het identificeren van kleine peptiden die kunnen binden aan een bepaald molecuul13,14,15. We gebruikten een faag display peptide bibliotheek die is gebaseerd op een eenvoudige M13 faag met meer dan 109 verschillende peptide sequenties weergegeven aan de staart voor binding aan het doelwit molecuul (Zie tabel van de materialen)16. Vanwege de hoge affiniteit van Fagen naar het gegeven molecuul, kunnen ongebonden Fagen weggewassen worden, en alleen strak gebonden Fagen met de gewenste korte peptiden blijven behouden. De gegeven moleculaire doelen kunnen worden geïmmobiliseerd eiwitten17,18, koolhydraten, gekweekte cellen, of zelfs anorganische materialen19,20. Een spannende zaak werd gerapporteerd waar Orgaanspecifieke peptiden werden geselecteerd in vivo met behulp van faag Display Technology21. De voordelen van faag display technologie zijn onder andere een hoge doorvoer, bedieningsgemak, lage kosten en een breed scala aan toepassingen22.
In deze studie bieden we een gedetailleerd protocol voor het screenen van kleine peptiden binding aan het geïmmobiliseerde eiwit (FGFR2) met behulp van een faag display Library. De werkzaamheid van de technologie wordt ook onderzocht door het meten van de affiniteit van de verkregen peptide naar FGFR2 door isothermische titratie calorimetrie (ITC), en de biologische activiteit door een celproliferatie test. De methode kan worden uitgebreid voor het screenen van kleine peptiden die binden aan koolhydraten, gekweekte cellen, of zelfs anorganische materialen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van het reagens
- LB (lysogeny Bouillon) medium: Los 1 g Tryptone, 0,5 g gistextract en 0,5 g NaCl op in 100 mL H2O. autoclaaf en bewaar bij 4 °c.
- Tetracycline voorraad: bereid 20 mg/mL in 1:1 ethanol: H2O. bewaren bij-20 °c, en Vortex voor gebruik.
- IPTG/X-gal oplossing: Meng 0,5 g IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) en 0,4 g van X-Gal (5-broom-4-Chloro-3-indolyl β-D-galactoside) in 10 mL DMF (dimethyl formamide). De oplossing kan gedurende één jaar bij-20 °C in het donker worden bewaard.
- LB + tetracycline (tet) platen: Dissove 1 g bacto-Tryptone, 0,5 g gistextract, 0,5 g NaCl en 1,5 g agar in 100 mL H2O. autoclaaf en koel tot ≪ 70 °c. Voeg 100 μL van de tetracycline kolf toe en giet de platen. Bewaar de platen bij 4 °C in het donker.
- LB + IPTG/X-gal platen: Los 1 g bacto-Tryptone op, 0,5 g gistextract, 0,5 g NaCl en 1,5 g agar in 100 mL H2O. autoclaaf en koel tot ≪ 70 °c. Voeg 100 μL van de IPTG/X-gal oplossing toe en giet platen. Bewaar de platen bij 4 °C in het donker.
- Glycine-HCI-buffer (0,2 M): Los 1,5014 g Glycine en 100 mg BSA (runderserum albumine) op in 100 mL H2O en stel de pH in op 2,2 met HCL. Filtreer de oplossing met een filter van 0,22 μm en bewaar deze bij 4 °c.
- Tris-HCl-buffer (1 M): Los 12,11 g tris (tris (hydroxymethyl) aminomethaan) op in 100 mL H2O en pas de pH op 9,1 aan met HCL. autoclaaf en bewaar bij 4 °c.
- Coating buffer (0,1 M): Los 1,68 g NaHCO3 op in 200 ml H2O en stel de pH in op 8,6 met NaOH. Filter de oplossing met een 0,22 μm filter en bewaar bij 4 °C.
- Blokkerende buffer: bereid 0,1 M NaHCO3 (pH 8,6) met 5 mg/ml BSA. Filter de oplossing met een 0,22 μm filter en bewaar bij 4 °C.
- TBS: bereid 50 mM tris-HCl (pH 7,5) met 150 mM NaCl. Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur.
- 0,05%, 0,1% of 0,5% TBST: Maak TBS met 0,05%, 0,1% of 0,5% (v/v) Tween-20. Filter met een 0,22 μm filter en bewaar op kamertemperatuur.
- PEG/NaCl: bereid 20% (w/v) polyethyleenglycol – 8000 met 2,5 M NaCl. Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur.
- TE oplossing: Meng 1 mL van 1 M Tris-HCl (pH 8.0) en 2 mL 50 mM EDTA (pH 8,0) en stel het volume in op 100 mL met H2O. autoclaaf en bewaar bij kamertemperatuur.
- Jodide buffer: Los 30 g NaI op in 50 mL TE, pH 8,0. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur in het donker.
- Topagar: Los 1 g Tryptone, 0,5 g gistextract, 0,5 g NaCl en 0,7 g agarin op in 100 mL H2O. autoclaaf en verdeel in 15 ml aliquots. Bij kamertemperatuur bewaren voor gebruik.
2. eerste ronde van biopanning: screening van faag klonen die binden aan het extracellulaire domein van FGFR2
Let op: gebruik aërosolbestendige pipetpunten en draag handschoenen voor alle protocollen om besmetting met milieu-bacterfagen te minimaliseren.
- Bereid een 10 μg/mL FGFR2 (zuiverheid > 97%; Zie tabel van de materialen) oplossing in coating buffer. Voeg 1 mL van de bereide oplossing toe aan een schotel van 35 cm2 en draai herhaaldelijk totdat het oppervlak volledig nat is. Inbroed 's nachts bij 4 °C met schudden.
Opmerking: om selectie van Decoy doel binders te voorkomen, moet het doeleiwit zeer gezuiverd zijn. - Inoculeren 5 mL LB + Tet medium met Escherichia coli (E. coli) ER2738 gedurende 5 – 10 uur bij 37 °c met schudden. De versterkte ER2738 cellen zullen worden gebruikt voor titratie in stap 3,3.
- Giet de coating oplossing uit de schaal (de overtollige oplossing moet worden verwijderd) en voeg de blokkerende oplossing toe. Incuberen bij 4 °C gedurende ten minste 1 uur.
- Gooi de blokkerende oplossing weg en was 6 keer snel met TBST (TBS + 0,05% (v/v] tween-20). Vermijd het uitdrogen van het gerecht.
- Reconstitueer de originele faag Library in 1 ml TBST [eindconcentratie van 1011 plaquevormende eenheden (Pfu)], voeg toe aan de gecoate schaal en rots zachtjes voor 2 uur op een shaker bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatant weg en was het gerecht 10x met TBST (TBS + 0,05% (v/v) Tween-20), zoals uitgevoerd in stap 2,4.
Opmerking: de ongebonden Fagen moeten grondig worden verwijderd door krachtig wassen. - Elute de gebonden faag door 1 ml 0,2 M glycine-HCL buffer (pH 2,2) toe te voegen aan de schaal en zachtjes te schommelen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Breng het eluaat over in een gesteriliseerde microfugebuis buis en neutraliseer het met 100 μL van 1 M Tris-HCl, pH 9,1.
Notes: in stap 2,6, verwijder de ongebonden faag zoveel mogelijk door het gerecht 10x krachtig te wassen. Dit is een cruciale stap. De opgeweemde faag kan gedurende één week bij 4 °C worden bewaard. Het is echter het beste om zo snel mogelijk door te gaan naar de volgende stap.
3. titerbepaling van de eluteerde Fagen
- Pre-warme LB + IPTG/X-gal platen voor ten minste 1 uur bij 37 °C voor gebruik.
- Bereid 100 μL 10-voudige seriële verdunningen (d.w.z. 101, 102, 103 en 104) van het eluaat uit stap 2,8 in lb. gebruik tips met filter cartridges om verontreiniging te voorkomen.
- Laat de cultuur uit stap 2,2 de mid-log-fase bereiken (OD600 ≈ 0,5). Verdeel 200 μL van de kweek in gesteriliseerde microfugebuis buizen, één voor elke eluaat verdunning.
- Om de infectie te initiëren, voeg 10 μL van elke verdunning van stap 3,2 toe aan individuele microfugebuis buizen met de E. coli ER2738 cultuur uit stap 3,3. Vortex snel en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Vacht 90 μL van het mengsel van stap 3,4 in de LB + IPTG/X-gal platen met coating stokken.
- Eventueel smelt topagar in een magnetron, Doseer 3 mL in steriele kweek buizen, één voor elke eluaat verdunning, en onderhoud de buizen bij 45 °C. Breng het mengsel over van stap 3,4 naar cultuur buizen met 45 °C topagar. Meng snel en giet de cultuur onmiddellijk op een voorverwarmde LB/IPTG/X-gal plaat. Kantel en draai de plaat zachtjes om de bovenste agar gelijkmatig te verdelen.
- Na 5 min, inverteren en inincuberen van platen 's nachts bij 37 °C.
- Tel plaques op platen met ongeveer 100 plaques. Vermenigvuldig elk getal met de verdunningsfactor voor die plaat om de faag titer in Pfu per 10 μL te krijgen.
- Inoculeren nog eens 5 ml lb + Tet medium met E. coli ER2738 bij 37 °c 's nachts met schudden voor faag amplificatie.
Opmerking: gebruik de cultuur van ER2738 in de mid-log-fase (OD600 ≈ 0,5) voor faag titer. Als de meeste plaques wit zijn op X-gal/iptg-platen, betekent dit dat de pool van faag is verontreinigd met wilde bacteriofagen. Als er verontreiniging optreedt, is het noodzakelijk om opnieuw te beginnen met de pannen stappen van de ongecontamineerde faag stockoplossing.
4. Phage versterking
- Verdun (1:100) de nachtelijke kweek van stap 3,8 in 20 mL LB in een erlenmeyer van 250 mL. Voeg het onversterkte eluaat toe en incuberen met krachtig schudden voor 4,5 uur bij 37 °C.
- Breng de cultuur over naar een centrifugebuis en centrifugeer 10 min bij 12.000 x g bij 4 °c. Breng de supernatant over naar een frisse buis, centrifugeer opnieuw en gooi de pellet weg.
- Breng de bovenste 80% van de supernatant over naar een frisse buis en voeg hieraan toe 1/6 volume van 20% PEG/2.5 M NaCl. Laat de faag neer slaan bij 4 °C 's nachts.
Opmerking: Meng de kweek supernatant met PEG/2.5 M NaCl well. - Centrifugeer het neergeprecipiteerde faag bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant weg, centrifugeer opnieuw en verwijder het resterende supernatant met een pipet.
- Regeert de pellet in 1 mL TBS en breng de supernatant over naar een microfugebuis Tube. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
- Breng de supernatant over naar een nieuw microfugebuis buisje en precipitaat opnieuw door 1/6 volume van 20% PEG/2.5 M NaCl toe te voegen. Incuberen op ijs gedurende 15 – 60 minuten Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Gooi de supernatant weg, draai opnieuw en verwijder het resterende supernatant met een pipet.
- Rebreng de pellet in 200 μL TBS en centrifugeer een extra minuut om onzuiverheden te verwijderen. Breng het supernatant over naar een nieuw microfugebuis buisje om het versterkte eluaat te verkrijgen.
- Titer de versterkte faag zoals beschreven in punt 3.
NB: de verdunning van het versterkte eluaat is hoger in vergelijking met het onversterkte eluaat; seriële verdunningen van 108– 1011 worden meestal gesuggereerd.
5. tweede ronde van biopanning
- Herhaal de secties 2 tot en met 4.
- Titer de tweede ronde van het versterkte eluaat op LB + IPTG/X-gal platen, zoals beschreven in punt 3.
NB: Verminder de coating concentratie van FGFR2 eiwit tot 5 μg/mL. Gebruik de versterkte faag uit stap 4,7 als de ingang en houd de titer hetzelfde als in de eerste ronde (1011 Pfu). Verkort de incubatietijd van faag en FGFR2-Coated schaal tot 1 uur en verhoog de tween-concentratie naar 0,1% (v/v) in de wasstappen.
6. derde ronde biopanning
- Herhaal stap 2.1-2.6.
- Elute de gebonden faag door 1 ml 20 μM bFGF-oplossing (een ligand voor FGFR2) toe te voegen aan het gerecht en zachtjes te schommelen gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
- Herhaal stap 3.1-3.7.
NB: Verminder de coating concentratie van het FGFR2-eiwit tot 2,5 μg/mL. Gebruik de tweede ronde van versterkte faag uit sectie 5 als de ingang en houd de titer hetzelfde als in de eerste ronde (1011 Pfu). Verkort de incubatietijd van faag en FGFR2-Coated schaal tot 30 min en verhoog de tween-concentratie naar 0,5% (v/v) in de wasstappen.
7. verwerving van plaque-DNA voor sequentiëren
- Plaque-versterking
- Verdun (1:100) een nachtelijke cultuur van ER2738 in LB. Doseer 1 mL verdunde cultuur in een buis van 2 mL, één voor elke kloon die wordt gekarakteriseerd.
- Gebruik een pipetpunt om een goed gescheiden blauw gekleurde plaque te kiezen uit een titer plaat uit sectie 6 en over te brengen naar de buis met de verdunde cultuur. Kies een totaal van 15 plaques.
Opmerking: platen moeten worden < 1 – 3 dagen oud, bewaard bij 4 °C, en hebben < 100 plaques. - Inbroed de buisjes met krachtig schudden voor 4,5 uur bij 37 °C.
- Breng de culturen over naar centrifugebuizen en centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 30 sec. Breng de supernatant over naar een frisse buis en centrifugeer opnieuw.
- Gebruik een pipet en breng de bovenste 80% van de supernatant over naar een frisse buis. Label dit als de versterkte faag voorraad.
Opmerking: Verdun de versterkte faag met een gelijk volume van 100% steriele glycerol en bewaar bij-80 °C voor later gebruik.
- Extractie van plaque-DNA
- Breng 500 μL van de versterkte faag over in een nieuw microfugebuis buisje en voeg een 1/6 volume van 20% PEG/2.5 M NaCl toe. Inverteer om te mengen en laat het 10 – 20 minuten bij kamertemperatuur staan.
- Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c en giet vervolgens het supernatant af.
Opmerking: Phage pellet is mogelijk niet zichtbaar. - Opnieuw te centrifugeren. Verwijder voorzichtig alle overgebleven supernatant.
- Breng de pellet grondig onder in 100 μL van de jodide-buffer door krachtig op de buis te tikken.
- Voeg 250 μL 100% ethanol toe en inincuberen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c en verwijder het supernatant. Was de pellet met 0,5 mL 70% ethanol, centrifugeer snel opnieuw, verwijder het supernatant en droog de pellet kort af.
- Respendeer de pellet in 30 μL TE buffer en gebruik dit voor sequencing.
Opmerking: pre-cool de 70% ethanol bij-20 °C voorafgaand aan stap 7.2.6. De faag pellet moet grondig worden geresuspendeerd in de jodide buffer voorafgaand aan de toevoeging van ethanol.
8. identificatie van de peptide sequentie
- Gebruik de-96 gIII sequencing primer (5 ́-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG – 3 ́) voor sequencing.
- Analyseer de peptide sequenties die op de faag worden weergegeven op basis van de DNA-sequentie resultaten.
- Synthetiseren kleine peptiden en analyseren door High-Performance vloeibare chromatografie (HPLC) en massaspectrometrie om hun zuiverheid te bevestigen (≥ 98%).
9. herkenning van de affiniteit van het verkregen kleine peptide en extracellulair eiwit van FGFR2 door ITC
- Degas steriel water met behulp van een ultrasoon instrument. Los het kleine peptide en het FGFR2 extracellulaire eiwit op in steriel water. Centrifugeer deze monsters om rest precipitaat te verwijderen.
- Voer de ITC-titratie-experimenten uit bij 25 °C. Ticaat 40 μM kleine peptide in de cel met 1,5 μM FGFR2 proteïne uit de spuit, met een roersnelheid van 750 rpm. Voeg het FGFR2-eiwit toe in 2 μL aliquots (voor een totaal van 19 injecties) met intervallen van 5 minuten.
- Analyseer de ITC-gegevens met behulp van een binding model met één site.
Opmerking: steriel water moet worden ontgast en alle monsters moeten worden gecentrifugeerd om luchtbellen en rest onzuiverheden te verwijderen. Het experiment moet worden uitgevoerd bij een constante temperatuur van 25 °C.
10. controle van de biologische activiteit van het verkregen kleine peptide met behulp van een celproliferatie test
- Zaad BALB/c 3T3 cellen (3,0 × 103 cellen/put, 100 μL) in een 96-goed bord met Dulbecco's gemodificeerde adelaar medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) 's nachts bij 37 °c en 5% Co2.
- Vervang de supernatant met verse DMEM met 0,5% FBS en verhongeren de cellen voor 12 uur.
- Maak seriële verdunningen van de kleine peptide (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 en 100 μM) met verse DMEM aangevuld met 0,5% FBS (6 dubbele putjes/concentratie). Verwijder de supernatant van de 96-goed plaat en voeg 100 μL van de kleine peptide oplossing per put toe. Inincuberen voor 48 uur bij 37 °C en 5% CO2.
- Vervang de supernatant met verse DMEM met 10% cell counting Kit (CCK)-8 oplossing en inincubatie voor 2 h.
- Meet de extinctie van elke put bij 450 nm met een microplaat lezer en analyseer de levensvatbaarheid van de cel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het verkrijgen van een high Affinity Small peptide targeting FGFR2.
Voor het scherm phages targeting FGFR2, een Ph.D.-7 bibliotheek werd gebruikt in deze studie. Een schematische weergave van de workflow wordt weergegeven in Figuur 1. In dit proces werd het aantal faag input (Pfu) onveranderd gehouden, terwijl de coating concentratie van FGFR2 proteïne geleidelijk werd verlaagd. De resultaten van de faag titer suggereerden dat het aantal herstelde Fagen geleidelijk toenam, en na 3 rondes was er een 65-voudige toename in vergelijking met die van de eerste ronde (tabel 1).
Vervolgens kozen we faag klonen willekeurig na de derde ronde en haalden we het faag DNA uit voor sequencing. Een representatieve peptide (WRARVPL) verkregen door screening heette SP1. Het werd vervolgens gesynthetiseerd, en het molecuulgewicht werd gemeten door massaspectrometrie.
De SP1 peptide toonde een hoge binding affiniteit naar FGFR2.
Er werd een ITC-experiment uitgevoerd om de affiniteit van de kleine peptide met FGFR2 te meten. Het resultaat gaf aan dat de SP1 peptide heeft een hoge affiniteit naar FGFR2 (KD ≈ 1,4 μM; Figuur 2). Deze datum toonde de efficiëntie van het screening protocol.
De SP1 peptide geremd de groei van fibroblasten.
Om de biologische activiteit van het SP1-peptide te onderzoeken, werd een fibroblast-proliferatie test uitgevoerd met behulp van een CCK-8-Kit. BALB/c 3T3 cellen werden geïnineerd met het SP1 peptide in verschillende concentraties (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 en 100 μM). Het resultaat suggereerde dat de SP1 Peptide de groei van de BALB/c 3T3 cellen onderdrukte (Figuur 3).
Figuur 1. Biopanning voor kleine peptide targeting FGFR2 met behulp van faag display Library.
(A) Schematische weergave van kleine peptide screening met behulp van faag display Library. Inbroed de bibliotheek met 1011 Pfu in een schaaltje bedekt met FGFR2. Gooi ongebonden Fagen weg door het wassen en elueer gebonden Fagen. Versterk de eluteerde Fagen en gebruik ze als input voor de volgende biopanning. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Het meten van de affiniteit van interactie tussen de SP1 peptide en FGFR2 door ITC.
1,5 μM FGFR2 eiwit werd getitreerd met 40 μM van het SP1-peptide. De ITC-gegevens werden verder geanalyseerd met behulp van Origin 7,0-software. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Effect van de SP1 peptide op de groei van fibroblasten.
BALB/c 3T3 cellen werden behandeld met de SP1 peptide in verschillende concentraties (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 en 100 μM). De resultaten worden uitgedrukt als de gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Ronde | FGFR2 (μg) | Ingang faag (Pfu) | Uitgang faag (Pfu) | Herstel (%) | Verrijking |
| 1 | 10 | 2,0 x 1011 | 3,98 x 104 | 1,99 x 10-5 | 1 |
| 2 | 5 | 2,0 x 1011 | 8,1 x 105 | 4,05 x 10-4 | 20 |
| 3 | 2,5 | 2,0 x 1011 | 2,6 x 106 | 1,3 x 10-3 | 65 |
Tabel 1. Verrijking van faag-targeting FGFR2 ten opzichte van ronde 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een combinatorische faag-bibliotheek is een krachtig en effectief hulpmiddel voor de screening van nieuwe peptiden met een hoge doorvoer die doelwit moleculen kan binden en hun functie13kunnen reguleren. Op dit moment hebben faag display peptide bibliotheken een breed scala aan toepassingen. Bijvoorbeeld, ze kunnen worden gebruikt voor het selecteren van bioactieve peptiden gebonden aan receptor eiwitten23, niet-eiwit targets24,25, ziekte-specifieke antigeen bootst13, Cell-specifieke peptiden26, 27, of weefsel/orgaan-specifieke peptiden21,28,29 en ontwikkeling van peptide-gemedieerde drug delivery Systems19,30. In het kort, faag display peptide bibliotheken zijn nuttige en efficiënte systemen om specifieke peptiden te identificeren in fundamenteel onderzoek en ontwikkeling van translationele geneeskunde. In de studie, een bibliotheek werd gebruikt voor het screenen van kleine peptiden targeting FGFR2 voor celgroei remming.
De kritische stappen van het protocol worden hieronder vermeld. In de pannen stap moet verontreiniging door wild-type Fagen worden vermeden. De ongebonden Fagen moeten grondig worden verwijderd door krachtig wassen. De LB + iptg/X-gal platen voor faag titer moeten vooraf worden opgewarmd tot 37 °c. Voor de faag titer, E. coli ER2738 moet worden geteeld tot halverwege log fase (OD600 ≈ 0,5). In stap 4,3 moet de faag 's nachts worden neergeprecipiteerd bij 4 °C. Goed gescheiden blauwe plaques moeten worden geplukt uit Platea met minder dan 100 plaques voor DNA-sequencing. Bij stap 7.2.6 moet de ethanol oplossing van 70% vooraf worden gekoeld bij 20 °C. Ten slotte moet voor het ITC-experiment steriel water worden ontgast en moeten alle monsters worden gecentrifugeerd om luchtbellen en rest onzuiverheden te verwijderen. Het experiment moet worden uitgevoerd bij een constante temperatuur van 25 °C.
Sommige factoren die van invloed kunnen zijn op de kwaliteit van de behaalde hits22 zijn als volgt: 1) in de eerste screening ronde moet het aantal faag-ingangen 1011 Pfu zijn. In de volgende screening ronde kan de invoer echter lager zijn. 2) een zuivere omgeving moet worden gehandhaafd om wild-type faag besmetting te voorkomen. 3) 3 of 4 rondes van screening zijn meestal voldoende. Vermijd overmatige panning van de peptide bibliotheek. 4) in elke ronde wordt de hoeveelheid doel proteïne geleidelijk verlaagd, terwijl het gehalte aan tween geleidelijk toeneemt in de wasstap. Bovendien wordt de incubatietijd van faag en FGFR2-Coated schaal ook geleidelijk verkort. Als de meeste van de eluteerde faag plaques wit zijn op X-gal/iptg platen, suggereert dit verontreiniging door wild-type Fagen. Om te voorkomen dat een lage titer van versterkte faag in het pannen proces, culturen moeten goed worden belugeerd en besmet vroeg in hun groeifase (OD600 < 0,05).
In deze studie, de SP1 peptide toonde hoge affiniteit naar FGFR2 (KD ≈ 1,4 μM; Figuur 2) en goede biologische activiteit (Figuur 3). Zo, onze resultaten suggereren dat het protocol was effectief bij het selecteren van peptiden tegen het extracellulaire domein van FGFR2 eiwit, hoewel er rekening mee dat als gevolg van de hoge volgorde gelijkenis van FGFR familieleden, de SP1 peptide wellicht enige binding affiniteit met FGFR familieleden naast FGFR2, die verantwoordelijk kunnen zijn voor de biologische activiteit gezien. Ook in het pannen-proces is faag Elisa een alternatief om de positieve Fagen kwalitatief te identificeren. In ons lab krijgen we echter altijd de peptiden door sequencing en evalueren ze hun affiniteit door ITC assay kwantitatief en hebben ze geen problemen gehad bij het evalueren en selecteren van de kandidaat peptiden.
De Phage-display Library heeft verschillende voordelen22. De bibliotheken hebben een hoge capaciteit (tot 1011 Pfu) en kunnen in vitro, in vivo en ex vivo worden gebruikt. Bibliotheken zijn zeer efficiënt, gemakkelijk te hanteren, goedkoop en commercieel beschikbaar. Er zijn echter bepaalde beperkingen van de technologie. De bibliotheken bevatten alleen proteinogene aminozuren en zijn alleen vatbaar voor lineaire en eenvoudige cyclische peptiden zonder ingewikkelde structuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen conflicten van financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het wetenschaps-en technologieprogramma van Guangzhou (nr. 2016201604030039).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
