Summary
Burada, faj görüntüleme peptid kütüphanesi kullanarak FGFR2'ye bağlanan küçük peptidlerin taranması için ayrıntılı bir protokol sayılmiyoruz. Seçilen peptidlerin FGFR2 in vitro'ya olan yakınlığını ve hücre çoğalmasını bastırma yeteneğini daha da analiz ediyoruz.
Abstract
İnsan Fibroblast Büyüme Faktörü Reseptörü (FGFR) ailesi, hücre çoğalması, sağkalım, göç ve farklılaşma gibi çeşitli biyolojik faaliyetlerde bulunan FGFR1, FGFR2, FGFR2, FGFR3 ve FGFR4 olmak üzere dört üyeden oluşur. FGFR sinyal yolunda mutasyonlar veya gen amplifikasyon olayları nedeniyle çeşitli kanser türlerinde çeşitli sapmalar tespit edilmiştir. Bu nedenle, son araştırmalar FGFR'lerin terapötik hedeflemesini içeren stratejiler geliştirmeye odaklanmıştır. monoklonal antikorlar, boru hattında sadece birkaç peptit bazlı inhibitörleri vardır. Burada, FGFR2 antagonistleri olarak küçük peptidler görüntülemek için faj ekran teknolojisini kullanarak bir protokol sağlar. Kısaca, faj görüntülenen peptidler bir kütüphane FGFR2 ile kaplı bir tabak içinde kuluçka yada oldu. Daha sonra, bağlanmamış faj TBST tarafından yıkandı (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20), ve bağlı faj 0.2 M glisin-HCl tampon (pH 2.2) ile eluted edildi. Eluted faj daha da güçlendirilmiş ve biopanning bir sonraki tur için giriş olarak kullanılmıştır. Üç tur biopanning sonrasında, bireysel faj klonların peptid dizileri DNA dizilimi ile tespit edildi. Son olarak, taranmış peptidler sentezlendi ve yakınlık ve biyolojik aktivite için analiz edildi.
Introduction
Fibroblast büyüme faktörü reseptörleri (FGVR) hücre çoğalmasında, yara iyileşmesinde ve in vivo1'deanjiyogenezde kilit rol oynar. Çeşitli tümörlerde gözlenen FGFR sinyallerinin anormal aktivasyonu2,3,4,5 gen amplifikasyonu, gen mutasyonları, kromozom salamanasyonları ve aşırı ligand salgılanması6 . FGFR'leri hedef alan birçok inhibitör klinik çalışmalarda umut verici terapötik etkiler göstermiştir ve esas olarak üç tipe ayrılır: (1) fgfr hücre içi etki alanına bağlanan küçük molekül kinaz inhibitörleri, (2) antagonistleri hücre dışı segment ve (3) FGF ligand tuzakları6. Küçük molekül kiazaz inhibitörleri birkaç in vitro ve in vivo7hem de iyi terapötik etkileri olmasına rağmen, bunların çoğu kötü hedef özgüllüğü var ve hipertansiyon gibi yan etkiler göstermektedir8. Antagonistlerin çoğunluğu monoklonal antikorlar9,10 ve polipeptidler11. Peptidler özgüllük leri ve düşük yan etkileri nedeniyle küçük moleküllere göre avantajlıdır. Ayrıca hücre geçirgenliğini korurlar ve protein ilaçlarına göre belirli organlarda birikmezler12. Bu nedenle, hedeflenen küçük peptidler hem etkili ve prospektif terapötik ajanlardır.
Faj ekran teknolojisi belirli birmolekül13,14,15bağlanabilir küçük peptidler tanımlamak için kolay ama güçlü bir araçtır. Biz hedef moleküle bağlanmak için kuyruk görüntülenen 109 farklı peptid dizileri ile basit bir M13 faj dayalı bir faj ekran peptid kütüphane kullanılır (Malzeme Tablosubakınız )16. Verilen moleküle fajların yüksek yakınlığı nedeniyle, bağlanmamış fajlar yıkanabilir ve sadece istenilen kısa peptidler ile sıkıca bağlanmış fajlar korunur. Verilen moleküler hedefler immobilize proteinler olabilir17,18, karbonhidratlar, kültürlü hücreler, hatta inorganik maddeler19,20. Heyecan verici bir durumda nerede organa özgü peptidler faj ekran teknolojisi kullanılarak in vivo seçildibildirilmiştir 21. Faj görüntüleme teknolojisinin avantajları arasında yüksek iş gücü, çalışma kolaylığı, düşük maliyet ve çok çeşitli uygulamalar22bulunmaktadır.
Bu çalışmada, faj görüntüleme kitaplığı kullanılarak immobilize proteine (FGFR2) bağlanan küçük peptidlerin taranması için ayrıntılı bir protokol sunuz. Teknolojinin etkinliği, elde edilen peptidin FGFR2'ye olan yakınlığı nın Izothermal Titrasyon Kalorimetresi (ITC) ile ölçülmesi ve hücre çoğalması tahkikatı ile biyolojik aktivite ile de incelenir. Yöntem karbonhidratlar, kültürlü hücreler, hatta inorganik maddelere bağlanan küçük peptidlerin taranması için uzatılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reaktif hazırlama
- LB (lysogeny suyu) orta: 1 g tripton, 0,5 g maya özü ve 0,5 g NaCl 100 mL H2O. Otoklav ve 4 °C'de saklayın.
- Tetrasiklin stoğu: 20 mg/mL'yi 1:1 etanolde hazırlayın:H2O. -20 °C'de ve kullanmadan önce girdapta saklayın.
- IPTG/X-gal çözeltisi: 10 mL DMF (dimethylethylformaformide) içinde 0,5 g IPTG (izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside) ve 0,4 g X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside) karıştırın. Çözelti karanlıkta bir yıl boyunca -20 °C'de saklanabilir.
- LB + Tetrasiklin (Tet) plakaları: Ayrıştırıcı 1 g bakto-tripton, 0.5 g maya özü, 0.5 g NaCl ve 1.5 g agar 100 mL H2O. Otoklav ve serin < 70 °C. Tetrasiklin stokunun 100 μL'sini ekleyin ve plakadökün. Plakaları karanlıkta 4 °C'de saklayın.
- LB + IPTG/X-gal plakalar: 1 g bakto-tripto, 0,5 g maya ekstresi, 0,5 g NaCl ve 1,5 g agar 100 mL H2O. Otoklav ve serin < 70°C çözünür. IPTG/X-gal çözeltisinin 100 μL'sini ekleyin ve plaka dökün. Plakaları karanlıkta 4 °C'de saklayın.
- Glisin-HCI tamponu (0,2 M): 100 mL H2O'da 100 mg glisin ve 100 mg BSA (sığır serum albumini) çözünve HCl ile pH'ı 2,2'ye ayarlayın.
- Tris-HCl tamponu (1 M): 100 mL H2O'da 12,11 g Tris (tris(hidroksemimetil)aminometan) çözünve pH'ı HCl. Otoklav ile 9,1'e ayarlayın ve 4 °C'de saklayın.
- Kaplama tamponu (0,1 M): 1,68 g NaHCO3'ü 200 mL H2O'da çözün ve naoh ile pH'ı 8,6'ya ayarlayın. Çözeltiyi 0,22 m filtre kullanarak filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
- Bloke tampon: 5 mg/mL BSA ile 0,1 M NaHCO3 (pH 8.6) hazırlayın. Çözeltiyi 0,22 m filtre kullanarak filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
- TBS: 150 mM NaCl ile 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) hazırlayın. Otoklav ve oda sıcaklığında saklayın.
- %0.05, %0.1 veya %0.5 TBST: TBS'yi %0.05, %0.1 veya %0.5 (v/v) Tween-20 ile hazırlayın. 0,22 μm filtre kullanarak filtre uygulayın ve oda sıcaklığında saklayın.
- PEG/NaCl: 2,5 M NaCl ile %20 (w/v) polietilen glikol-8000 hazırlayın. Otoklav ve oda sıcaklığında saklayın.
- TE çözeltisi: 1 mL 1 M Tris-HCl (pH8.0) ve 2 mL 50 mM EDTA (pH 8.0) karıştırın ve h2O. Otoklav ile sesi 100 mL'ye ayarlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
- İyot tamponu: 30 g NaI'yi 50 mL TE, pH 8.0'da çözün. Çözeltiyi karanlıkta oda sıcaklığında saklayın.
- Top Agar: 1 g tripton, 0,5 g maya özü, 0,5 g NaCl ve 0,7 g agarin 100 mL H2Otoklav ve 15 mL aliquots içine dağıtın. Kullanım için oda sıcaklığında saklayın.
2. Biopanning ilk tur: FGFR2 ekstrasellüler etki alanına bağlanan faj klonları tarama
NOT: Çevresel bakteriyofajlarla kontaminasyonu en aza indirmek için aerosole dayanıklı pipet uçları kullanın ve tüm protokoller için eldiven giyin.
- Kaplama tamponunda 10 μg/mL FGFR2 (Saflık > %97; bkz. Malzemeler Tablosu)çözeltisi hazırlayın. Hazırlanan çözeltinin 1 mL'sini 35 cm2 tabağa ekleyin ve yüzey tamamen ıslanana kadar tekrar tekrar girdap. Gece boyunca 4 °C'de sallayarak kuluçkaya yatın.
NOT: Yem hedef bağlayıcılarının seçilmesini önlemek için hedef protein insaflaştırılmalıdır. - 5 mL LB + Tet orta Escherichia coli (E. coli) ER2738 ile 5-10 saat boyunca 37 °C'de sallayarak aşındırın. Güçlendirilmiş ER2738 hücreleri adım 3.3 titrasyon için kullanılacaktır.
- Çanak tan kaplama çözeltisi dökün (fazla çözelti kaldırılmalıdır) ve engelleme çözeltisi ekleyin. En az 1 saat boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Engelleme çözeltisini atın ve TBST ile 6 kat hızlı yıkayın (TBS + %0,05 (v/v] Ara-20). Yemeği kurutmaktan kaçının.
- TBST 1 mL orijinal faj kütüphane yeniden [1011 plak şekillendirme birimleri (PFU)], kaplamalı çanak ekleyin ve oda sıcaklığında bir shaker üzerinde 2 saat hafifçe kaya.
- Supernatant atın ve tbst (TBS + 0.05% (v / v) Tween-20 ile çanak 10x yıkayın, adım 2.4 gerçekleştirilen gibi.
NOT: Bağlanmamış fajlar güçlü yıkama ile iyice uzaklaştırılmalıdır. - Çanağa 0,2 M glisin-HCl tamponunun (pH 2,2) 1 mL'si eklenerek ve oda sıcaklığında 10 dakika hafifçe sallayarak bağlı fajı saplayın.
- Eluate'yi sterilleştirilmiş bir mikrofuge tüpüne aktarın ve 100 μL 1 M Tris-HCl, pH 9.1 ile nötralize edin.
NOT: Adım 2.6'da, çanağı 10 kat şiddetle yıkayarak, bağlanmamış fajı mümkün olduğunca çıkarın. Bu çok önemli bir adım. Eluted faj bir hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir. Ancak, en kısa sürede bir sonraki adıma geçmek için en iyisidir.
3. Eluted fajların titer tayini
- Kullanmadan önce 37 °C'de en az 1 saat sıcak LB + IPTG/X-gal plakaları.
- 10 kat seri seyreltmelerin 100 μL'sini (örneğin, 101,102,103 ve 104)LB.8'de 2.8'den elüata hazırlayın.
- Adım 2.2'deki kültürün günlük aşamasının ortasına (OD600 』 0,5) ulaşmasına izin verin. Kültürün 200 μL'sini sterilize edilmiş mikrofuge tüplere dağıtın, her eluat seyreltme için bir tane.
- Enfeksiyonu başlatmak için, adım 3.2'den e. coli ER2738 kültürünü içeren tek tek mikrofuge tüplere her seyreltmenin 10 μL'sini adım 3.3'ten ekleyin. Girdap hızlı ve 5 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
- Coat 90 μL karışımın 3.4 adımdan lb +IPTG/X-gal plakalarına kaplama çubukları ile gir.
- İsteğe bağlı olarak, üst agarı mikrodalgafırında eritin, steril kültür tüplerine 3 mL dağıtın, her eluat seyreltmesi için bir tane ve 45 °C'de tüpleri koruyun. Karışımı adım 3.4'ten 45 °C üst agar içeren kültür tüplerine aktarın. Hızlı bir şekilde karıştırın ve hemen önceden ısıtılmış LB/IPTG/X-gal plaka üzerine kültür dökün. Yavaşça yatırın ve üst agar eşit yaymak için plaka döndürün.
- 5 dakika sonra, 37 °C'de bir gecede ters ve kuluçka plakaları.
- Yaklaşık 100 plaketiçeren plakaları sayın. 10 μL başına PFU faj titresini almak için her sayıyı o plakanın seyreltme faktörüyle çarpın.
- Bir gecede 37 °C'de E. coli ER2738 ile 5 mL lb + Tet ortamı aşılayın ve faj amplifikasyonu için titretin.
NOT: Faj titreci için orta log fazında (OD600 』 0,5) ER2738 kültürünü kullanın. Plakların çoğu X-gal/IPTG plakalarında beyaz sayılsa, bu faj havuzunun yabani bakteriyofajlarla kirlendiği anlamına gelir. Kontaminasyon oluşursa, kirlenmemiş faj stok çözeltisinden kaydırma adımları ile yeniden başlamak gerekir.
4. Faj amplifikasyonu
- Seyreltik (1:100) 250 mL Erlenmeyer şişesinde LB 20 mL adım 3.8 gelen bir gecede kültür. 37 °C'de 4,5 saat boyunca güçlü bir şekilde sallayarak amplifikatize edilmemiş eluate ve inkübün ekleyin.
- Kültürü 4 °C'de 12.000 x g'da 10 dk'lık bir santrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın. Supernatant'ı taze bir tüpe aktarın, tekrar santrifüj edin ve peleti atın.
- Supernatant'ın üst %80'ini yeni bir tüpe aktarın ve 1/6 hacim %20 PEG/2,5 M NaCl ekleyin. Fajın bir gecede 4 °C'de çökelmesine izin verin.
NOT: Kültür supernatant'ı PEG/2.5 M NaCl ile iyice karıştırın. - Çökelmiş fajı 12.000 x g'de 15 dakika 4 °C'de santrifüj edin. Supernatant atın, santrifüj tekrar, ve bir pipet ile artık supernatant kaldırın.
- Peleti 1 mL TBS'de yeniden askıya alın ve süpernatantı mikrofuge tüpüne aktarın. 4 °C'de 5 dk için 12.000 x g santrifüj.
- Süpernatant'ı taze bir mikrofuge tüpe aktarın ve %20 PEG/2.5 M NaCl'nin 1/6 hacmini ekleyerek tekrar çökeltin. 15-60 dk. Santrifüj 12.000 x g 4 °C'de 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka. Supernatant atın, yeniden spin ve bir pipet ile artık supernatant çıkarın.
- Kirleri gidermek için peleti 200 μL TBS ve santrifüjde bir dakika daha askıya alın. Güçlendirilmiş eluat elde etmek için taze bir mikrofuge tüp supernatant aktarın.
- Bölüm 3'te açıklandığı gibi güçlendirilmiş fajı titretin.
NOT: Amplifiye edilmiş eluatın seyreltilmesi, amplifikatörsüz eluate göre daha yüksektir; seri seyreltmeler 108-1011 tipik olarak önerilmektedir.
5. Biopanning ikinci tur
- Bölümleri 2'den 4'e tekrarlayın.
- Bölüm 3'te açıklandığı gibi LB + IPTG/X-gal plakalarında güçlendirilmiş eluate'nin ikinci turunu titretin.
NOT: FGFR2 proteininin kaplama konsantrasyonunu 5 μg/mL'ye düşürün. 4.7.adımdaki yükseltilmiş fajı giriş olarak kullanın ve titreyi ilk turda (1011 PFU) aynı tutun. Faj ve FGFR2 kaplı kabın kuluçka süresini 1 saate kısaltın ve yıkama adımlarında Ara konsantrasyonunu %0,1'e (v/v) yükseltin.
6. Biopanning üçüncü tur
- Adımları 2.1-2.6'yı yineleyin.
- Çanağa 1 mL 20 μM bFGF çözeltisi (FGFR2 için bir ligand) ekleyerek ve oda sıcaklığında 60 dakika hafifçe sallayarak bağlı fajı eleyin.
- Adımları 3.1-3.7'yi yineleyin.
NOT: FGFR2 proteininin kaplama konsantrasyonunu 2,5 g/mL'ye düşürün. Giriş olarak bölüm 5'teki güçlendirilmiş fajın ikinci turunu kullanın ve titreyi ilk turda (1011 PFU) aynı tutun. Faj ve FGFR2 kaplı kabın kuluçka süresini 30 dakikaya kısaltın ve yıkama adımlarında Ara konsantrasyonunu %0,5'e (v/v) yükseltin.
7. Sıralama için plak DNA'sının elde edilmesi
- Plak amplifikasyonu
- Seyreltik (1:100) LB. Bir 2 mL tüp içine seyreltilmiş kültür 1 mL dağıtmak ER2738 bir gecede kültür, karakterize edilmesi gereken her klon için bir.
- Bölüm 6'dan bir titrek plakasından iyi ayrılmış mavi renkli bir plak seçmek ve seyreltilmiş kültürü içeren tüpe aktarmak için bir pipet ucu kullanın. Toplam 15 plaket seçin.
NOT: Plakalar < 1-3 günlük olmalı, 4 °C'de saklanmalı ve < 100 plak olmalıdır. - Tüpleri 37 °C'de 4,5 saat boyunca güçlü bir şekilde sallayarak kuluçkaya yatırın.
- Kültürleri 12.000 x g'de 30 s. Süpernatant'ı tekrar taze bir tüp ve santrifüje aktarın.
- Bir pipet kullanarak, supernatant üst% 80 yeni bir tüp aktarın. Bunu güçlendirilmiş faj stoku olarak etiketle.
NOT: Güçlendirilmiş fajı %100 steril gliserol ile seyreltin ve daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.
- Plak DNA'sının çıkarılması
- Güçlendirilmiş fajın 500 μL'sini taze bir mikrofuge tüpe aktarın ve 1/6 hacim %20 PEG/2.5 M NaCl ekleyin. Karıştırmak ve oda sıcaklığında 10-20 dakika bekletin ters çevirin.
- 4 °C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj edin ve sonra süpernatantı dökün.
NOT: Faj peletgörünür olmayabilir. - Yine santrifüj. Kalan supernatant'ı dikkatlice çıkarın.
- Tüpe şiddetle dokunarak peleti iyodür tamponunun 100 μL'sinde iyice yeniden askıya alın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %100 etanol ve kuluçkaya 250 μL ekleyin.
- 4 °C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Peleti 0,5 mL%70 etanol ile yıkayın, hızlı bir şekilde tekrar santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve peleti kısa bir süre kurulayın.
- 30 μL TE tamponundaki peleti yeniden askıya alın ve bunu sıralama için kullanın.
NOT: Adım 7.2.6'dan önce -20°C'de %70 etanol önceden soğutun. Faj pelet iyice etanol eklenmesinden önce iyodür tampon içinde resuspended olmalıdır.
8. Peptit dizisinin tanımlanması
- Sıralama için -96 gIII sıralama astarını (5'-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG –3 ́) kullanın.
- Faj üzerinde görüntülenen peptit dizilerini DNA dizileme sonuçlarına göre analiz edin.
- Küçük peptidleri sentezler ve saflıklarını doğrulamak için yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve kütle spektrometresi ile analiz edin (≥98%).
9. ITC tarafından FGFR2 elde edilen küçük peptid ve ekstrasellüler proteinin inanıntlığını saptayır
- Ultrasonik bir alet kullanarak steril su degas. Küçük peptid ve FGFR2 ekstrasellüler proteini steril suda çözün. Artık çökelti kaldırmak için bu örnekleri santrifüj.
- ITC titrasyon deneylerini 25 °C'de gerçekleştirin. 750 rpm karıştırma hızı ile şırınga dan FGFR2 proteini 1.5 μM ile hücrede küçük peptit 40 μM titrat. FGFR2 proteinini 5 min aralıklarla 2 μL aliquots (toplam 19 enjeksiyon için) ekleyin.
- ITC verilerini tek siteli bağlama modelini kullanarak analiz edin.
NOT: Steril su gazdan arındırılmalı ve hava kabarcıklarını ve artık kirleri gidermek için tüm numuneler santrifüj edilmelidir. Deney 25 °C sabit sıcaklıkta yapılmalıdır.
10. Elde edilen küçük peptidin biyolojik aktivitesinin hücre çoğalması tsayını kullanarak doğrulanması
- Tohum BALB/c 3T3 hücreleri (3.0 × 103 hücre/kuyu, 100 μL) Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) ile 96-iyi bir tabakta% 10 fetal sığır serumu ile (FBS) gecede 37 °C ve% 5 CO2.
- Supernatant'ı taze DMEM ile %0,5 FBS ile değiştirin ve hücreleri 12 saat aç kayaşverin.
- Küçük peptidin seri seyreltmelerini (0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20 ve 100 μM) taze DMEM ile %0,5 FBS (6 yinelenen kuyu /konsantrasyon) ile yapın. Supernatant'ı 96 kuyulu plakadan çıkarın ve kuyu başına 100 μL küçük peptit çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 48 saat ve %5 CO2'dekuluçka .
- Supernatant%10 Hücre Sayma Kiti (CCK)-8 çözeltisi içeren taze DMEM ile değiştirin ve 2 saat kuluçkaya yatırın.
- Bir mikroplaka okuyucu ile 450 nm her kuyunun emiciölçün ve hücre canlılığını analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FGFR2 hedefleyen yüksek bir afinite küçük peptid elde.
Bu çalışmada FGFR2'yi hedefleyen fajları taramak için doktora-7 kütüphanesi kullanılmıştır. İş akışının şematik gösterimi Şekil 1'degösterilmiştir. Bu süreçte faj girdisi (PFU) sayısı değişmeden tutulurken, FGFR2 proteininin kaplama konsantrasyonu kademeli olarak azaltıldı. Faj titresinin sonuçları, kurtarılan faj sayısının kademeli olarak arttığını ve 3 raunt tan sonra ilk tura göre 65 kat artış olduğunu ileri sürmüştür(Tablo 1).
Sonra, üçüncü turdan sonra rastgele faj klonları seçtik ve sıralama için faj DNA'sını çıkardık. Tarama ile elde edilen bir temsili peptid (WRARVPL) SP1 olarak adlandırıldı. Daha sonra sentezlendi ve molekül ağırlığı kütle spektrometresi ile ölçüldü.
SP1 peptid FGFR2 karşı yüksek bağlayıcı yakınlık gösterdi.
Küçük peptidin FGFR2'ye olan yakınlığını ölçmek için bir ITC deneyi yapılmıştır. Sonuç, SP1 peptidin FGFR2'ye (Kd § 1.4 μM; Şekil 2). Bu tarih tarama protokolünün verimliliğini gösterdi.
SP1 peptiti fibroblastların büyümesini engelledi.
SP1 peptidin biyolojik aktivitesini araştırmak için CCK-8 kiti kullanılarak fibroblast proliferasyon teşpisi yapıldı. BALB/c 3T3 hücreleri farklı konsantrasyonlarda (0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20 ve 100 μM) SP1 peptid ile kuluçkaya yatırıldı. Sonuç, SP1 peptidin BALB/c 3T3 hücrelerinin büyümesini baskıladığını ortaya sürmüştür(Şekil 3).
Şekil 1. Faj görüntüleme kitaplığı kullanılarak FGFR2'yi hedefleyen küçük peptit için biopanning.
(A) Faj görüntüleme kitaplığı kullanılarak küçük peptit taraması şematik gösterimi. FGFR2 ile kaplanmış bir tabakta 1011 PFU içeren kütüphaneyi kuluçkaya yatırın. Bağlanamayan fajları yıkaarak atın ve bağlı fajları eler. Eluted fajlar yükseltmek ve biopanning bir sonraki tur için giriş olarak kullanabilirsiniz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. ITC tarafından SP1 peptid ve FGFR2 arasındaki etkileşimin yakınlığının ölçülmesi.
1.5 μM FGFR2 proteini 40 μM SP1 peptid ile titre edildi. ITC verileri Origin 7.0 yazılımı kullanılarak daha da analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. SP1 peptidin fibroblastların büyümesi üzerine etkisi.
BALB/c 3T3 hücreleri farklı konsantrasyonlarda (0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20 ve 100 μM) SP1 peptid ile tedavi edildi. Sonuçlar ortalama ± SD olarak ifade edilir.
| Yuvarlak | FGFR2 (g) | Giriş fajı (PFU) | Çıkış fajı (PFU) | Kurtarma (%) | Zengin -leştirme |
| 1 | 10 | 2.0 x 1011 | 3,98 x 104 | 1,99 x 10-5 | 1 |
| 2 | 5 | 2.0 x 1011 | 8.1 x 105 | 4,05 x 10-4 | 20 |
| 3 | 2.5 | 2.0 x 1011 | 2,6 x 106 | 1,3 x 10-3 | 65 |
Tablo 1. FGFR2'yi hedefleyen fajzenginleştirme 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir kombinatoryal faj kütüphane hedef molekülleri bağlamak ve fonksiyonlarını düzenleyen yeni peptidlerin yüksek iş letiyet tarama için güçlü ve etkili bir araçtır13. Şu anda, faj ekran peptid kütüphaneleri uygulamaları geniş bir yelpazede var. Örneğin, onlar reseptör proteinlerine bağlı biyoaktif peptidler seçmek için kullanılabilir23, non-protein hedefleri24,25, hastalığa özgü antijen taklitleri13, hücreye özgü peptidler26, 27, veya doku / organa özgü peptidler21,28,29 ve peptit aracılı ilaç dağıtım sistemlerinin geliştirilmesi19,30. Kısacası, faj ekran peptid kütüphaneleri, çeviri tıbbının temel araştırma ve geliştirmesinde belirli peptidleri belirlemek için yararlı ve etkili sistemlerdir. Çalışmada, hücre büyümesi inhibisyonu için FGFR2'yi hedefleyen küçük peptidlerin taranması için bir kütüphane kullanılmıştır.
Protokolün kritik adımları aşağıda belirtilmiştir. Panning adımda, yabani tip fajlar tarafından kontaminasyon kaçınılmalıdır. Bağlanmamış fajlar güçlü yıkama ile iyice kaldırılmalıdır. Faj titresi için LB + IPTG/X-gal plakaları 37 °C'ye önceden ısıtılmalıdır. Faj titresi için, E. coli ER2738 orta günlük fazına kadar yetiştirilmelidir (OD600 』 0.5). 4.3. adımda faj bir gecede 4 °C'de çökeltilmelidir. Dna dizilimi için 100'den az plak içeren platea dan iyi ayrılmış mavi plaklar alınmalıdır. Adım 7.2.6'da % 70 etanol çözeltisi önceden 20 °C'de soğutulmalıdır. Son olarak, ITC deneyi için steril su gazdan arındırılmalı ve hava kabarcıklarını ve artık kirleri gidermek için tüm numuneler santrifüj edilmelidir. Deney 25 °C sabit sıcaklıkta yapılmalıdır.
Elde edilen22 isabetkalitesini etkileyebilecek bazı faktörler şunlardır: 1) Taramanın ilk turunda faj giriş sayısının 1011 PFU olması gerekir. Ancak, bir sonraki tarama turunda giriş daha düşük olabilir. 2) Yabani tip faj kontaminasyonunu önlemek için saf bir ortam sağlanmalıdır. 3) Tarama 3 veya 4 tur genellikle yeterlidir. Peptit kitaplığını aşırı kaydırmaktan kaçının. 4) Her turda, hedef protein miktarı kademeli olarak azalır, Tween içeriği ise yıkama adımında kademeli olarak artar. Buna ek olarak, faj ve FGFR2 kaplı çanak kuluçka süresi de yavaş yavaş kısalır. Eluted faj plakları çoğu X-gal / IPTG plakaları üzerinde beyaz ise, bu yabani tip fajlar tarafından kontaminasyon göstermektedir. Panning sürecinde güçlendirilmiş fajın düşük bir titresini önlemek için kültürlerin büyüme evrelerinde iyi bir şekilde temizlenmeleri ve enfekte olmaları gerekir (OD600 < 0.05).
Bu çalışmada, SP1 peptid FGFR2 (Kd 』 1.4 μM; Şekil 2) ve iyi biyolojik aktivite (Şekil 3). Bu nedenle, sonuçlarımız protokolün FGFR2 proteininin hücre dışı etki alanına karşı peptidlerin seçiminde etkili olduğunu göstermektedir, ancak FGFR aile üyelerinin yüksek dizibenzerliği nedeniyle SP1 peptidin FGFR ile bazı bağlayıcı yakınlığı olabileceğini unutmayın. görülen biyolojik aktiviteden sorumlu olabilecek FGFR2 dışında aile üyeleri. Ayrıca, panning sürecinde, faj ELISA nitel pozitif fajlar tanımlamak için bir alternatiftir. Ancak, laboratuarımızda, her zaman sıralama ve ITC tsay kantitatif tarafından onların yakınlık değerlendirerek peptidler elde ve değerlendirme ve aday peptidler seçme ve değerlendirme sorunları yoktu.
Faj-ekran kitaplığı çeşitli avantajlarıvardır 22. Kütüphaneler yüksek kapasitelidir (1011 PFU'ya kadar) ve in vitro, in vivo ve ex vivo olarakkullanılabilir. Kütüphaneler son derece verimli, kullanımı kolay, ucuz ve ticari olarak mevcuttur. Ancak, teknolojinin bazı sınırlamaları vardır. Kütüphaneler sadece proteinojenik amino asitler içerir ve sadece karmaşık yapıları olmadan doğrusal ve basit döngüsel peptidler için münasiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir mali çıkar çatışması ilan.
Acknowledgments
Bu çalışma Guangzhou Bilim ve Teknoloji Programı (No. 2016201604030039) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
