Summary
בזאת, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לסינון פפטידים קטנים התאגד ל-FGFR2 באמצעות ספריית התצוגה הקטנה של phage. אנו לנתח עוד יותר את האהדה של הפפטידים שנבחרו כלפי FGFR2 בתוך מבחנה ויכולתה לדכא את תפוצת התאים.
Abstract
מקדם הגדילה האנושי של הצמיחה פיברובסט (FGFR) מורכב מארבעה חברים, כלומר, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, המעורבים בפעילויות ביולוגיות שונות כולל הפצת תאים, הישרדות, הגירה ובידול. מספר סטיות במסלול האיתות FGFR, בשל מוטציות או אירועי הגברה גנטית, זוהו בסוגים שונים של סרטן. מכאן, מחקר שנערך לאחרונה התמקד בפיתוח אסטרטגיות מעורבות טיפולית של FGFRs. מעכבי FGFRS הנוכחי בשלבים שונים של התפתחות פרה-קליני וקליני כוללים מעכבי מולקולה קטנה של הקינזה או נוגדנים חד שבטיים, עם רק כמה פפטיד מבוססי מעכבי בצינור. כאן, אנו מספקים פרוטוקול באמצעות טכנולוגיית התצוגה phage למסך פפטידים קטנים כאנטוניסטים של FGFR2. בקצרה, ספריה של הפפטידים המוצגים phage היה מודבטים בצלחת מצופה עם FGFR2. לאחר מכן, phage לא מאוגד היה שטף על ידי TBST (TBS + 0.1% [v/v] יצירת רצף-20), ו phage מאוגד היה מוגבל עם 0.2 M גליצין-HCl מאגר (pH 2.2). והשתמשו בו כקלט. לסיבוב הבא בביואננינג בעקבות שלושה סיבובים של ביו ביונינג, רצפי פפטיד של שיבוטים phage בודדים זוהו על ידי רצפי DNA. לבסוף, הפפטידים הוקרן היו מסונתז ונותחו לפעילות זיקה וביולוגית.
Introduction
קולטני הצמיחה פיברובסט (FGFRs) משחקים תפקידי מפתח בתפוצת תאים, ריפוי פצעים ואנגיוגנזה ב-vivo1. הפעלה חריגה של איתות fgfr נצפתה במגוון רחב של גידולים2,3,4,5 כולל הגברה גנטית, מוטציות גנים, סטיות כרומוזומלית, וליגונים מוגזמת6 . מעכבי רבים המיקוד fgfrs הראו השפעות טיפוליות מבטיחות בניסויים קליניים מסווגים בעיקר לשלושה סוגים: (1) מולקולה קטנה קינאז מעכבי, אשר לאגד את התחום התאיים של fgfrs, (2) האנטוניסטים מיקוד ה קטע מסחטות, ו (3) FGF ליגומלכודות6. למרות שכמה מעכבי מולקולה קטנה קינאז יש השפעות טיפוליות טובות הן בתחום החוץ והן ב vivo7, רובם יש ספציפיות היעד העניים ולהראות תופעות לוואי כגון יתר לחץ דם8. רוב האנטוניסטים הם נוגדנים חד-שבטיים9,10 ו פוליפפטידים11. פפטידים יש יתרונות על פני מולקולות קטנות בשל הספציפיות שלהם תופעות לוואי נמוכות. הם גם שומרים על חדירות התאים ואינם צוברים איברים ספציפיים לעומת תרופות החלבון12. מכאן, פפטידים קטנים ממוקדות הם יעילים ופוטנציאליים סוכנים רפואיים.
טכנולוגיית התצוגה phage הוא כלי קל אך חזק לזיהוי פפטידים קטנים אשר יכולים לאגד למולקולה נתונה13,14,15. השתמשנו בספרייה פפטיד להציג בספריה כי הוא מבוסס על M13 phage פשוטה עם מעל 109 רצפי פפטיד שונים מוצגים בזנב לכריכה למולקולה היעד (ראה טבלת חומרים)16. בשל הזיקה הגבוהה של phages לעבר מולקולה נתונה, phages לא מאוגד יכול להיות שטף משם, ורק מאוגד היטב phages עם פפטידים קצרים הרצוי נשמרים. מטרות מולקולריות נתון יכול להיות מקיבוע חלבונים17,18, פחמימות, תאים מתורבתים, או אפילו חומרים אורגניים19,20. מקרה מרגש דווח היכן הפפטידים הספציפיים לעוגב נבחרו בvivo באמצעות טכנולוגיית התצוגה phage21. היתרונות של טכנולוגיית התצוגה phage כוללים תפוקה גבוהה, קלות הפעולה, עלות נמוכה ומגוון רחב של יישומים22.
במחקר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של הקרנת פפטידים קטנים כריכת החלבון הקיבוע (FGFR2) באמצעות ספריית תצוגה phage. יעילותה של הטכנולוגיה נבדקת גם על ידי מדידת הזיקה של הפפטיד המתקבל כלפי FGFR2 על ידי איזותרמי טיטור קלורימטריה (הטכניון), ואת הפעילות הביולוגית על ידי שיטת הפצת תאים. ניתן להאריך את השיטה לסינון פפטידים קטנים הקושרים לפחמימות, לתאים מתורבתים או אפילו לחומרים לא אורגניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה מגיב
- LB (ציר הקימוט) בינוני: לפזר 1 גרם של טריטונים, 0.5 g של תמצית שמרים, ו 0.5 g של הנאל ב 100 mL של H2O. אוטוקלב וחנות ב 4 ° c.
- טטרציקלין מניות: להכין 20 מ"ג/mL ב 1:1 אתנול: H2O. Store-20 ° c, ומערבולת לפני השימוש.
- הפתרון IPTG/X-גל: לערבב 0.5 g של IPTG (איזופרופיל β-D-1-thioגלאויד) ו 0.4 g של X-גל (5-bromo-4-כלורו-3-indolyl β-D-גלטוסייד) ב 10 מ ל של DMF (דימתיל). ניתן לאחסן את הפתרון ב-20 ° c למשך שנה אחת בחשיכה.
- LB + טטרציקלין (ט) צלחות: מנתח 1 גרם של bacto-טריטונים, 0.5 g של תמצית שמרים, 0.5 g של הנאל, ו 1.5 g של אגר ב 100 mL של H2O. אוטוקלב וקריר כדי ≪ 70 ° c. הוסף 100 μL של המניה טטרציקלין ולמזוג צלחות. חנות צלחות ב 4 ° c בחושך.
- LB + IPTG/X-גל צלחות: לפזר 1 גרם של bacto-טריטונה, 0.5 g של תמצית שמרים, 0.5 g של הנאקול, ו 1.5 g של אגר ב 100 mL של H2O. אוטוקלב וקריר כדי ≪ 70 ° c. הוסף 100 μL של פתרון IPTG/X-gal ושופכים צלחות. חנות צלחות ב 4 ° c בחושך.
- גליצין-hci מאגר (0.2 M): התמוססות 1.5014 g של גליצין ו 100 מ"ג של bsa (הסרום הפרה אלבומין) ב 100 mL של H2O ולהתאים את ה-pH ל2.2 עם HCl. מסנן את הפתרון באמצעות מסנן ב0.22 יקרומטר ואחסן ב 4 ° c.
- טריס-HCl מאגר (1 M): לפזר 12.11 g של טריס (טריס (הידרוקסימתיל) בשנת 100 mL של H2O ולהתאים את ה-pH ל 9.1 עם HCl. האוטוקלב והחנות ב 4 ° c.
- מאגר ציפוי (0.1 M): התמוססות 1.68 g של נחקו3 ב 200 ML של H2O ולהתאים את ה-PH כדי 8.6 עם naoh. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר ואחסן ב-4 ° c.
- חסימת מאגר: להכין 0.1 M נחקו3 (pH 8.6) עם 5 מ"ג/ML bsa. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר ואחסן ב-4 ° c.
- TBS: להכין 50 mM טריס-HCl (pH 7.5) עם 150 מ"מ הנאל. לאוטוקלב ולאחסן בטמפרטורת החדר.
- 0.05%, 0.1%, או 0.5% TBST: הכן TBS עם 0.05%, 0.1%, או 0.5% (v/v) ברצף-20. מסנן באמצעות פילטר 0.22 יקרומטר ואחסן בטמפרטורת החדר.
- יתד/שאול: להכין 20% (w/v) פוליאתילן גליקול-8000 עם 2.5 M הנאל. לאוטוקלב ולאחסן בטמפרטורת החדר.
- הפתרון TE: מערבבים 1 מ ל של 1 M Tris-HCl (pH 8.0) ו 2 מ מ של 50 mM EDTA (pH 8.0) ולהתאים את עוצמת הקול ל 100 mL עם H2O. אוטוקלב ולאחסן בטמפרטורת החדר.
- מאגר יודיד: התמוססות 30 גרם של נאי ב 50 מ ל של TE, pH 8.0. אחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר בחשכה.
- למעלה אגר: לפזר 1 גרם של טריטונים, 0.5 g של תמצית שמרים, 0.5 g של הנרוג, ו 0.7 g agarin 100 mL של H2O. אוטוקלב ו לוותר על 15 מ"ל מימן. החנות בטמפרטורת החדר לשימוש.
2. סיבוב ראשון של ביואננינג: הקרנת שיבוטים phage כי לאגד את התחום החילוץ של FGFR2
הערה: השתמש בטיפים עמידים בפני תרסיס וללבוש כפפות עבור כל הפרוטוקולים על מנת למזער את הזיהום עם בקטבאצ סביבתיים.
- הכינו 10 μg/mL FGFR2 (טוהר > 97%; ראה טבלת חומרים) פתרון מאגר ציפוי. הוסף 1 מ ל של הפתרון המוכן לצלחת 35 ס"מ2 ומערבולת שוב ושוב עד שפני השטח רטובים לחלוטין. מודטה בלילה ב -4 ° c עם טלטול.
הערה: כדי להימנע מבחירה של קלסרים היעד דמה, חלבון היעד חייב להיות מטוהר מאוד. - האיחסן 5 מ ל של LB + ט בינונית עם esER2738 chia coli (E. coli) במשך 5 – 10 שעות ב 37 ° צ' עם רעד. התאים ER2738 מוגבר ישמש לטיטור בשלב 3.3.
- יוצקים את פתרון הציפוי ממנה (יש להסיר את הפתרון העודף) ולהוסיף את פתרון החסימה. מודטה ב -4 מעלות צלזיוס לפחות 1 h.
- התעלם מפתרון החסימה ושטוף 6 פעמים במהירות עם TBST (TBS + 0.05% (v/v) יצירת רצף-20). להימנע מייבוש הצלחת.
- מרכיבים את ספריית phage המקורית ב 1 מ ל של TBST [ריכוז סופי של 1011 פלאק להרכיב יחידות (pfu)], להוסיף את הצלחת מצופה, רוק בעדינות עבור 2 h על שייקר בטמפרטורת החדר.
- להיפטר supernatant ולשטוף את הצלחת 10x עם TBST (TBS + 0.05% (v/v) יצירת רצף-20), כפי שבוצעה בשלב 2.4.
הערה: הפייגים הלא מאוגדים חייבים להיות מוסרים ביסודיות על ידי כביסה נמרצת. - Elute מאוגד phage ידי הוספת 1 מ ל של 0.2 M גליצין-HCl מאגר (pH 2.2) את המנה ואת נדנדה בעדינות עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- להעביר את החומקת לתוך צינור microfuge מעוקר ולנטרל אותו עם 100 μL של 1 M טריס-HCl, pH 9.1.
הערה: בשלב 2.6, להסיר את phage לא מאוגד ככל האפשר על ידי שטיפת הצלחת 10x במרץ. . זהו צעד מכריע המלון יכול להיות מאוחסן ב -4 מעלות צלזיוס למשך שבוע אחד. עם זאת, מומלץ להתקדם לשלב הבא בהקדם האפשרי.
3. הנחישות של הקטר
- לפני השימוש בלוחות LB + IPTG/X-גל לפחות 1 h ב 37 ° צ'.
- להכין 100 μL של 10-לקפל סדרתי (כלומר, 101, 102, 103 ו 104) של מתחמק משלב 2.8 בLB. השתמש בעצות עם מחסניות הסינון כדי למנוע זיהום.
- תן את התרבות משלב 2.2 להגיע שלב באמצע יומן (OD600 ≈ 0.5). לוותר 200 μL של התרבות לתוך צינורות microfuge מעוקר, אחד עבור כל הדילול.
- כדי ליזום את הזיהום, להוסיף 10 μL של כל דילול משלב 3.2 לצינורות microfuge בודדים המכילים את התרבות ER2738 E. coli משלב 3.3. ומערבולת במהירות ומטה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.
- מעיל 90 μL של התערובת משלב 3.4 לתוך לוחות LB + IPTG/X-גל עם מקלות ציפוי.
- באופן אופציונלי, להמיס העליון אגר במיקרוגל, לוותר על 3 מ ל לתוך צינורות תרבות סטרילית, אחד עבור דילול כל להתחמק, ולשמור על צינורות ב 45 ° c. העבר את התערובת משלב 3.4 לצינורות התרבות המכילים 45 ° c העליון אגר. מערבבים במהירות ובאופן מיידי לשפוך את התרבות על צלחת מראש מחומם/IPTG/X-גל. בעדינות להטות ולסובב את הצלחת כדי להפיץ את החלק העליון אגר באופן שווה.
- לאחר 5 דקות, היפוך לוחיות הדגירה לילה ב 37 ° c.
- לוחיות הספירה על צלחות עם כ 100 שלטים. הכפל כל מספר על ידי גורם הדילול עבור צלחת זו כדי לקבל את סיכוייו בתוך pfu לכל 10 μl.
- האיחסן עוד 5 מ ל של LB + ט בינונית עם E. coli ER2738 ב 37 ° c לילה עם טלטול עבור הגברה phage.
הערה: השתמש בתרבות של ER2738 בשלב באמצע יומן (OD600 ≈ 0.5) עבור phage titer. אם רוב השלטים הם לבנים על X-גל/לוחות IPTG, זה אומר כי הבריכה של phage כבר מזוהם עם בקטזומים פראי. אם מתרחשת זיהום, יש צורך להתחיל שוב עם הצעדים פנורמי מתוך פתרון מלאי מזוהם phage.
4. הגברה הפצגה
- לדלל (1:100) את התרבות לילה משלב 3.8 ב 20 מ ל של LB ב 250 mL Erlenmeyer בקבוקון. הוסף את האלואט הבלתי מוגבר ואת הדגירה עם טלטול נמרץ עבור 4.5 h ב 37 ° c.
- העבר את התרבות לצינור צנטריפוגה ו צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 12,000 x g ב 4 ° c. העבר את הסופרנטאנט לשפופרת טרייה, צנטריפוגה שוב, והשמט את הגלולה.
- העבירו את העליון 80% של supernatant לצינור טרי ולהוסיף אותו 1/6 נפח של 20% יתד/2.5 M הנאל. אפשר לזרז את הטיול ב -4 ° c בלילה.
הערה: מערבבים היטב את התרבות עם יתד/2.5 מ'. - צנטריפוגה את הזירז ב 12,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c. השמט את הסופרנטאנט, הצנטריפוגה שוב, והסר את השרידי הסופר עם הפיפטה.
- השהה מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של TBS ולהעביר את supernatant לצינור microfuge. צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
- העבר את הסופרנטאנט לצינור microfuge טרי ומזרז שוב על ידי הוספת 1/6 נפח של 20% יתד/2.5 M הנאל. דגירה על קרח 15 – 60 דקות. צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. השמט את הסופרנטאנט, הסתובב מחדש והסר את הסופרנטאנט השיורי עם הפיפטה.
- השהה מחדש את הגלולה ב-200 μL של TBS ו צנטריפוגה לדקה נוספת כדי להסיר זיהומים. העבר את הסופרנטאנט לצינור microfuge טרי כדי להשיג את הקצב הוגבר.
- הטיטר את הפייגה המוגברה כמתואר בסעיף 3.
הערה: הדילול של המוקצב גבוה יותר לעומת המוקצב הבלתי מוגבר; דילול סדרתי של 108– 1011 מוצעים בדרך כלל.
5. סיבוב שני של ביו-ביונינג
- חזור על סעיפים 2 עד 4.
- Titer הסיבוב השני של הצלחות מוגברת על LB + IPTG/X-גל לוחות כפי שמתואר בסעיף 3.
הערה: הפחת את ריכוז הציפוי של חלבון FGFR2 ל-5 μg/mL. השתמש phage מוגבר משלב 4.7 כקלט ולשמור את סיכוייו כמו בסיבוב הראשון (1011 pfu). לקצר את זמן הדגירה של phage ו FGFR2-מצופה הצלחת 1 h ולהגדיל את הריכוז רצף הזמן 0.1% (v/v) במדרגות לשטוף.
6. סיבוב שלישי של ביו-ביונינג
- חזור על שלבים 2.1-2.6.
- Elute המאוגד מאוגד על ידי הוספת 1 מ ל 20 הפתרון bfgf של μm (ליגנד עבור FGFR2) כדי הצלחת ונדנדה בעדינות עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר.
- חזור על שלבים 3.1-3.7.
הערה: להפחית את ריכוז הציפוי של חלבון FGFR2 כדי 2.5 μg/mL. השתמש בסיבוב השני של phage הוגבר מסעיף 5 כקלט ולשמור את סיכוייו כמו בסיבוב הראשון (1011 pfu). לקצר את זמן הדגירה של phage ו FGFR2-מצופה הצלחת 30 דקות ולהגדיל את הריכוז רצף הזמן 0.5% (v/v) במדרגות לשטוף.
7. רכישת דנ א של פלאק לרצף
- הגברה הפלאק
- לדלל (1:100) תרבות לילה של ER2738 ב LB. לחלק 1 מ ל של תרבות מדולל לתוך שפופרת 2 mL, אחד עבור כל שיבוט להיות מאופיין.
- השתמש בעצת פיפטה כדי לבחור לוח אחד בצבע כחול מופרד היטב מצלחת סיכוייו מסעיף 6 ולהעביר לצינור המכיל את התרבות המדוללת. . תבחר סכום של 15 שלטים
הערה: לוחות צריך להיות < 1 – 3 ימים, מאוחסן ב 4 ° c, ויש להם < 100 שלטים. - מודטה את הצינורות עם טלטול נמרץ עבור 4.5 h ב 37 ° c.
- להעביר את התרבויות לצינורות צנטריפוגה ו צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 30 s. העבר את הסופרנטאנט לשפופרת טרייה ולצנטריפוגה שוב.
- באמצעות פיפטה, העבירו את ה80 העליונים של הסופרנט לשפופרת חדשה. סמן את זה כמלאי מוגבר של phage.
הערה: לדלל את phage מוגברת עם נפח שווה של 100% גליצרול סטרילי ולאחסן ב-80 ° צ' לשימוש מאוחר יותר.
- הפקת דנ א של הפלאק
- העבר 500 μL של phage מוגבר לצינור microfuge טרי ולהוסיף נפח 1/6 של 20% יתד/2.5 M הנאל. היפוך כדי לערבב ולתת לו לעמוד במשך 10 – 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c ולאחר מכן לשפוך את supernatant.
הערה: ייתכן שגלולה Phage לא תהיה גלויה. - . צנטריפוגה שוב הסר בזהירות את כל הסופרנטאנט שנותר.
- השהה מחדש את הגלולה ביסודיות ב 100 μL של מאגר יודיד על ידי הקשה במרץ על השפופרת.
- הוסף 250 μL של 100% אתנול ו-דגירה עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c ולהסיר את הסופרנטאנט. לשטוף את הגלולה עם 0.5 mL של 70% אתנול, במהירות צנטריפוגה שוב, להסיר את supernatant, ולזמן קצר יבש את הגלולה.
- להשעות מחדש את הגלולה ב 30 μL של מאגר TE ולהשתמש בזה לרצף.
הערה: מראש מגניב 70% אתנול ב-20 ° c לפני שלב 7.2.6. הגלולה phage חייב להיות מחדש ביסודיות מאגר יודיד לפני הוספת אתנול.
8. זיהוי רצף הפפטיד
- השתמש ב-96 gIII רצפי רצף (5 זה-CCC TCA תג טה GCG TAA CG – 3) עבור רצף.
- לנתח את רצפי פפטיד מוצג על phage מבוסס על התוצאות רצפי DNA.
- לסנתז פפטידים קטנים ולנתח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים וספקטרומטר מסה כדי לאשר את הטוהר שלהם (≥ 98%).
9. מזהה את האהדה של החלבון המתקבל פפטיד ומFGFR2 באמצעות היחידה למען הילד
- דגה מים סטריליים באמצעות מכשיר אולטרסאונד. מפזר את הפפטיד הקטן ואת חלבון FGFR2 מסחטות במים סטריליים. צנטריפוגה את הדגימות האלה. כדי להסיר משקעים שיורית
- בצע את ניסויי הטיטור באוניברסיטת ה, ב -25 ° c. Titrate 40 μM של פפטיד קטן בתא עם 1.5 μM של חלבון FGFR2 מן המזרק, עם מהירות ערבוב של 750 rpm. הוסף את חלבון FGFR2 ב 2 μL (עבור סך של 19 זריקות) במרווחי זמן של 5 דקות.
- נתח את נתוני האינטרנט באמצעות מודל כריכה של אתר יחיד.
הערה: מים סטריליים חייב להיות מעוקר, וכל הדגימות חייב להיות centrifuged כדי להסיר בועות אוויר ושרידי זיהומים. הניסוי חייב להתבצע בטמפרטורה מתמדת של 25 ° c.
10. אימות הפעילות הביולוגית של הפפטיד הקטן שהושג באמצעות שיטת הפצת תאים
- זרע BALB/c 3T3 תאים (3.0 × 103 תאים/גם, 100 μl) ב 96-באר צלחת עם מדיום נשר שונה של Dulbecco (dmem ע) עם 10% סרום העובר (fbs) לילה בשעה 37 ° c ו-5% CO2.
- החלף את הסופרנטאנט באמצעות Dמאמ טרי עם 0.5% FBS ולהרעיב את התאים עבור 12 h.
- הפוך את הדיעות הסדרתיות של הפפטיד הקטן (0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20, ו-100 μM) עם dmem טרי בתוספת של 0.5% FBS (6 בארות כפולות/ריכוז). הסר את supernatant מצלחת 96-באר ולהוסיף 100 μL של פתרון פפטיד קטן לכל טוב. מודטה עבור 48 h ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
- החלף את הסופרנטאנט עם DMEM טרי המכיל 10% תא ספירת תאים (CCK)-8 פתרון ו מודלת עבור 2 h.
- למדוד את ספיגת כל טוב ב 450 ננומטר עם קורא מיקרופלייט ולנתח את הכדאיות התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השגת פפטיד קטן של זיקה גבוהה מיקוד FGFR2.
כדי להקרין phages מיקוד FGFR2, השתמשו בספריית Ph.D. 7 במחקר זה. ייצוג סכמטי של זרימת העבודה מוצג באיור 1. בתהליך זה, מספר קלט phage (PFU) נשמר ללא שינוי, בעוד ריכוז הציפוי של חלבון FGFR2 הופחת בהדרגה. תוצאות של phage סיכוייו הציע כי מספר phage התאושש גדל בהדרגה, ואחרי 3 סיבובים, היתה עלייה בקיפול 65 לעומת זה של הסיבוב הראשון (שולחן 1).
בשלב הבא, אספנו שיבוטים phage באופן אקראי לאחר הסיבוב השלישי וחילוץ ה-DNA phage לרצף. פפטיד אחד מייצג (WRARVPL) המתקבל על ידי הקרנת נקרא SP1. זה היה מסונתז לאחר מכן, והמשקל המולקולרי שלה נמדד על ידי ספקטרומטר מסה.
הפפטיד של SP1 הראה זיקה מחייבת גבוהה כלפי FGFR2.
הניסוי באוניברסיטת התחתית נערך כדי למדוד את הזיקה של הפפטיד הקטן ל-FGFR2. התוצאה מציינת שלפפטיד של SP1 יש זיקה גבוהה כלפי FGFR2 (Kd ≈ 1.4 μM; איור 2). תאריך זה הפגין את היעילות של פרוטוקול ההקרנה.
הפפטיד של SP1 מעכבות את צמיחת הפיברופיצוצים.
כדי לחקור את הפעילות הביולוגית של הפפטיד של SP1, בוצעה במערכת שיטת הפצת שגשוג בעזרת ערכת CCK-8. בתאי BALB/c 3T3 היו מודבטים עם פפטיד SP1 בריכוזים שונים (0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20, ו 100 μM). התוצאה הציעה שהפפטיד של SP1 דיכא את צמיחת התאים של BALB/c 3T3 (איור 3).
איור 1. ביו-ביואנינג למיקוד קטן של פפטיד FGFR2 באמצעות ספריית התצוגה phage.
(א) ייצוג סכמטי של הקרנת פפטיד קטנה באמצעות ספריית התצוגה של phage. מודחת הספרייה המכילה 1011 pfu בתבשיל מצופה עם FGFR2. התעלם מפייגים לא מאוגדים על ידי כביסה והפגים מאוגדים. והשתמש בהם כקלט. לסיבוב הבא של הביואננינג אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
. איור 2 מדידת האהדה של האינטראקציה בין הפפטיד של SP1 ו FGFR2 על ידי היחידה לתקשורת התחתית.
1.5 μm FGFR2 חלבון היה טיטרציה עם 40 μm של הפפטיד SP1. הנתונים בנוגע לשנת ההמשך נותחו באמצעות מקור 7.0 תוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
. איור 3 ההשפעה של הפפטיד של SP1 על צמיחת הפיברופיצוצים.
תאי BALB/c 3T3 טופלו באמצעות פפטיד של SP1 בריכוזים שונים (0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20 ו100 μM). התוצאות מבוטאים הממוצע ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| סיבוב | FGFR2 (μg) | קלט (PFU) | הפלט phage (PFU) | שחזור (%) | עשרה |
| 1 | 10 | 2.0 x 1011 | 3.98 x 104 | 1.99 x 10-5 | 1 |
| 2 | מיכל 5 | 2.0 x 1011 | 8.1 x 105 | 4.05 x 10-4 | 20 |
| 3 | 2.5 | 2.0 x 1011 | 2.6 x 106 | 1.3 x 10-3 | 65 |
. שולחן 1 העשרת המיקוד של הFGFR2 ביחס לסיבוב 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ספריית קומבינטורית phage הוא כלי רב עוצמה ויעיל עבור הקרנת תפוקה גבוהה של פפטידים הרומן שיכול לאגד את מולקולות היעד ולווסת את תפקידם13. בשלב זה, לספריות המוצגות באזור יש מגוון רחב של יישומים. לדוגמה, הם יכולים לשמש לבחירת הפפטידים אקטיביים מאוגד לקולטן חלבונים23, שאינם חלבונים מטרות24,25, מחלות ספציפי אנטיגן מחקה13, תאים ספציפיים פפטידים26, 27, או רקמה/איברים-פפטידים ספציפיים21,28,29 ופיתוח של פפטיד-תיווך מערכות משלוח תרופות19,30. בקצרה, מציג phage ספריות פפטיד הן מערכות שימושיות ויעילה כדי לזהות פפטידים ספציפיים במחקר בסיסי ופיתוח של רפואה טרנסלבותית. במחקר, השתמשו בספרייה לסינון פפטידים קטנים המכוונים FGFR2 לעיכוב בצמיחת תאים.
השלבים הקריטיים של הפרוטוקול מוזכרים להלן. בשלב הגלילה הרציפה, יש להימנע מזיהום על ידי phages מסוג פראי. הפייגים הלא מאוגדים חייבים להיות מוסרים ביסודיות על ידי כביסה נמרצת. הצלחות LB + iptg/X-גל עבור phage סיכוייו חייב להיות מחומם מראש עד 37 ° c. עבור phage titer, E. coli ER2738 יש לגדל עד אמצע יומן השלב (OD600 ≈ 0.5). בשלב 4.3, המלון חייב להיות מחולל לילה ב -4 ° c. היטב לוחיות כחול מופרדים חייב להיבחר platea המכיל פחות מ 100 שלטים עבור רצפי DNA. בשלב 7.2.6, הפתרון של האתנול 70% חייב להיות מקורר מראש ב -20 ° c מראש. לבסוף, עבור הניסוי באמצעות האוויר הארצי, מים סטריליים חייב להיות מעוקר, וכל הדגימות חייב להיות centrifuged כדי להסיר בועות אוויר ושרידי זיהומים. הניסוי חייב להתבצע בטמפרטורה מתמדת של 25 ° c.
כמה גורמים שיכולים להשפיע על איכות הלהיטים המתקבלים22 הם כדלקמן: 1) בסיבוב הראשון של ההקרנה, מספר תשומות phage צריך להיות 1011 pfu. עם זאת, בסיבוב הבא של ההקרנה, הקלט יכול להיות נמוך יותר. 2) סביבה טהורה חייבת להישמר כדי למנוע זיהום מסוג פראי. 3) 3 או 4 סיבובים של הקרנה מספיקים בדרך כלל. הימנע מפני גלילה מחדש של ספריית פפטיד. 4) בכל סיבוב, כמות חלבון היעד מופחתת בהדרגה, בעוד שהתוכן של הרצף מוגבר בהדרגה בשלב הכביסה. בנוסף, זמן הדגירה של המנה phage ו FGFR2 מצופה גם מקוצר בהדרגה. אם רוב השלטים האלה הם לבנים על X-גל/IPTG לוחות, זה מרמז על זיהום של phage מסוג פראי. על מנת למנוע סיכוייו נמוך של phage מוגבר בתהליך פנורמי, תרבויות חייב להיות מוגזים היטב נגוע מוקדם בשלב הצמיחה שלהם (OD600 < 0.05).
במחקר זה, פפטיד SP1 הראה אהדה גבוהה כלפי FGFR2 (Kd ≈ 1.4 μM; איור 2) ופעילות ביולוגית טובה (איור 3). כך, התוצאות שלנו מראים כי הפרוטוקול היה יעיל בבחירת פפטידים נגד התחום המיגלוני של חלבון FGFR2, למרות ששים לב כי בשל הדמיון הרצף הגבוה של בני משפחה FGFR, פפטיד SP1 יכול להיות קצת זיקה מחייב עם FGFR בני משפחה מלבד FGFR2, אשר יכול להיות אחראי על הפעילות הביולוגית נראה. כמו כן, בתהליך הגלילה הרציפה, הארגון מאפשר לזהות את הפייגים החיוביים. עם זאת, במעבדה שלנו, אנחנו תמיד להשיג את הפפטידים על ידי רצף והערכת הזיקה שלהם על ידי שיטת המעבדה לכימות, לא היו בעיות הערכת ובחירת פפטידים המועמד.
בספריית ה-phage יש מספר יתרונות של22. הספריות הן בעלות קיבולת גבוהה (עד 1011 ) וניתן להשתמש בהן בvivo, ולשעבר vivo. הספריות יעילות מאוד, קלות לטיפול, זולות וזמינות מסחרית. עם זאת, יש מגבלות מסוימות של הטכנולוגיה. הספריות מכילות רק חומצות אמינו מפרוטגניות והן קלות לפפטידים מחזורית פשוטים וליניאריים ללא מבנים מסובכים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על התנגשות. בין אינטרסים פיננסיים
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של גואנגג'ואו (No. 2016201604030039).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
