Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لفحص الببتيدات الصغيرة التي تربط FGFR2 باستخدام مكتبه الببتيد العرض بالعاثيه. ونحن أيضا تحليل تقارب الببتيدات المحددة نحو FGFR2 في المختبر وقدرته علي قمع انتشار الخلايا.
Abstract
وتتالف أسره مستقبلات عامل النمو الليفي البشري (FGFR) من أربعه أعضاء ، وهي FGFR1 ، و FGFR2 ، و FGFR3 ، و FGFR4 ، التي تشارك في مختلف الانشطه البيولوجية بما في ذلك انتشار الخلايا ، والبقاء علي قيد الحياة ، والهجرة ، والتمايز. وقد تم تحديد العديد من الانحرافات في مسار الإشارات FGFR ، بسبب الطفرات أو احداث تضخيم الجينات ، في أنواع مختلفه من السرطانات. التالي ، ركزت البحوث الاخيره علي وضع استراتيجيات تنطوي علي استهداف علاجي لل FGFRs. مثبطات FGFRS الحالية في مراحل مختلفه من التطور قبل السريرية والسريرية تشمل اما مثبطات جزيء صغيره من كيناسيس تيروزين أو الأجسام المضادة الاحاديه ، مع فقط عدد قليل من مثبطات المستندة إلى الببتيد في خط الأنابيب. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول باستخدام تقنيه عرض بالعاثيه لشاشه الببتيدات الصغيرة كخصوم من FGFR2. لفتره وجيزة ، تم احتضان مكتبه من الببتيدات المعروضة phage في لوحه المغلفة مع FGFR2. وفي وقت لاحق ، تم غسلها بالعاثيه غير منضم من قبل tbst (TBS + 0.1 ٪ [v/v] توين-20) ، وكان التملص من بالعاثيه ملزمه مع 0.2 M غليسين-HCl العازلة (pH 2.2). وتم تضخيم البالعاثيه الذي تم التملص منه واستخدامه كمدخل للجولة التالية من القرصنة البيولوجية. وبعد ثلاث جولات من القرصنة البيولوجية ، تم تحديد تسلسل الببتيد من الاستنساخ الفردي للفاج بتسلسل الحمض النووي. وأخيرا ، تم توليف الببتيدات التي تم فرزها وتحليلها للتقارب والنشاط البيولوجي.
Introduction
مستقبلات عامل النمو الليفي (FGFRs) تلعب أدوارا رئيسيه في انتشار الخلايا, التئام الجروح, وتولد الاوعيه في الجسم الحيوي1. التنشيط الشاذ من الإشارات fgfr لوحظ في مجموعه متنوعة من الأورام2,3,4,5 ويشمل تضخيم الجينات, الطفرات الجينية, الانحرافات الكروموسومات, والإفراط في إفراز الاربطه6 . وقد أظهرت العديد من مثبطات استهداف FGFRs الآثار العلاجية واعده في التجارب السريرية وتصنف أساسا إلى ثلاثه أنواع: (1) مثبطات جزيء كيناز الصغيرة ، والتي ترتبط المجال داخل الخلايا من FGFRS ، (2) الخصوم التي تستهدف الجزء خارج الخلية ، و (3) fgf يجند الفخاخ6. علي الرغم من ان العديد من مثبطات كيناز جزيء صغير لها اثار علاجيه جيده علي حد سواء في المختبر والجسم الآخر7, معظمهم لديهم الفقراء تحديد الهدف وتظهر الآثار الضارة مثل ارتفاع ضغط الدم8. غالبيه الخصوم هي الأجسام المضادة الاحاديه9،10 والبولي الببتيدات11. الببتيدات لها مزايا علي جزيئات صغيره بسبب خصوصيتها والآثار الجانبية السفلية. كما انها تحتفظ بنفاذيه الخلية ولا تتراكم في أجهزه محدده بالمقارنة مع الادويه البروتينية12. التالي ، الببتيدات الصغيرة المستهدفة هي عوامل علاجيه فعاله ومحتمله علي حد سواء.
Phage التكنولوجيا العرض هو أداه سهله ولكنها قويه لتحديد الببتيدات الصغيرة التي يمكن ان تربط إلى جزيء معين13،14،15. استخدمنا بالعاثيه العرض المكتبة الببتيد التي تقوم علي M13 بالعاثيه بسيطه مع أكثر من 109 تسلسل الببتيد مختلفه عرضها في الذيل للربط إلى جزيء الهدف (انظر جدول المواد)16. نظرا لتقارب عاليه من والعاثيات نحو جزيء معين ، والعاثيات غير منضم يمكن غسلها بعيدا ، ويتم الاحتفاظ فقط والعاثيات ملزمه باحكام مع الببتيدات القصيرة المطلوبة. الأهداف الجزيئية المعطية يمكن ان يتم تعبئتها البروتينات17،18، الكربوهيدرات، الخلايا المستزرعة ، أو حتى المواد غيرالعضوية 19 ،20. تم الإبلاغ عن حاله مثيره حيث تم اختيار الببتيدات الخاصة بالأعضاء في الجسم الخارجي باستخدام تقنيه عرض بالعاثيه21. مزايا التكنولوجيا عرض بالعاثيه وتشمل الانتاجيه العالية ، وسهوله التشغيل ، وانخفاض التكلفة ومجموعه واسعه من التطبيقات22.
في هذه الدراسة ، ونحن نقدم بروتوكول مفصل للكشف عن الببتيدات الصغيرة ملزمه للبروتين المعباه (FGFR2) باستخدام مكتبه عرض بالعاثيه. ويتم فحص فعاليه التكنولوجيا أيضا من خلال قياس تقارب الببتيد الذي تم الحصول عليه نحو FGFR2 بواسطة المعايرة الحرارية الكيميائية (ITC) ، والنشاط البيولوجي بواسطة فحص انتشار الخلايا. ويمكن تمديد الأسلوب للكشف عن الببتيدات الصغيرة التي تربط الكربوهيدرات, الخلايا المستزرعة, أو حتى المواد غير العضوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. اعداد كاشف
- LB (lysogeny مرق) المتوسطة: تذوب 1 غرام من التريتون ، 0.5 غرام من استخراج الخميرة ، و 0.5 غرام من كلوريد الصوديوم في 100 مل من H2س. الاوتوكلاف وتخزين في 4 درجه مئوية.
- الأسهم التاسكلين: اعداد 20 ملغ/مل في 1:1 الايثانول: ح2س. مخزن في-20 درجه مئوية ، ودوامه قبل استخدام.
- IPTG/X-غال الحل: مزيج 0.5 g من IPTG (ايزوبروبيل β-د-1-ثيوغالاكتويرانيوسيد) و 0.4 g من العاشر غال (5-برومو-4-كلورو-3-indolyl β-د-جالاكتوسيدي) في 10 مل من DMF (ثنائي ميثيل فورميد). يمكن تخزين الحل في-20 درجه مئوية لمده سنه واحده في الظلام.
- LB + التينكلين (Tet) لوحات: Dissove 1 غرام من bacto-التريتون ، 0.5 غرام من استخراج الخميرة ، 0.5 غرام من كلوريد الصوديوم ، و 1.5 غرام من أجار في 100 مل من ح2س. الاوتوكلاف وبارده ل< 70 درجه مئوية. أضافه 100 μL من الأسهم وصب الصفائح. تخزين لوحات في 4 درجه مئوية في الظلام.
- LB + IPTG/X-غال لوحات: حل 1 غرام من باكتون-تريتوني ، 0.5 غرام من استخراج الخميرة ، 0.5 غرام من كلوريد الصوديوم ، و 1.5 غرام من أجار في 100 مل من ح2س. الاوتوكلاف وبارده ل< 70 درجه مئوية. أضافه 100 μL من الحل IPTG/X-غال ويصب لوحات. تخزين لوحات في 4 درجه مئوية في الظلام.
- العازلة الجليسين-HCI (0.2 M): حل 1.5014 غرام من الجليسين و 100 ملغ من جيش صرب الجمهورية (الزلال المصل البقري) في 100 مل من H2O وضبط درجه الحموضة إلى 2.2 مع HCl. تصفيه الحل باستخدام فلتر 0.22 μm وتخزين في 4 درجه مئوية.
- تريس-HCl العازلة (1 م): حل 12.11 ز من تريس (تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثاني) في 100 mL من ح2س وضبط درجه الحموضة إلى 9.1 مع HCl. الاوتوكلاف وتخزين في 4 ° c.
- طلاء العازلة (0.1 M): حل 1.68 g من ناهكو3 في 200 مل من H2O وضبط درجه الحموضة إلى 8.6 مع naoh. تصفيه الحل باستخدام فلتر 0.22 μm وتخزين في 4 درجه مئوية.
- حظر المخزن المؤقت: اعداد 0.1 M ناهكو3 (pH 8.6) مع 5 ملغ/مل بوسنيا. تصفيه الحل باستخدام فلتر 0.22 μm وتخزين في 4 درجه مئوية.
- TBS: اعداد 50 mM تريس-HCl (pH 7.5) مع 150 mM كلوريد الصوديوم. الاوتوكلاف وتخزين في درجه حرارة الغرفة.
- 0.05 ٪ ، 0.1 ٪ ، أو 0.5 ٪ TBST: اعداد TBS مع 0.05 ٪ ، 0.1 ٪ ، أو 0.5 ٪ (v/v) توين-20. تصفيه باستخدام فلتر 0.22 μm وتخزينها في درجه حرارة الغرفة.
- PEG/NaCl: اعداد 20 ٪ (ث/الخامس) البولي إيثيلين جلايكول-8000 مع 2.5 M NaCl. الاوتوكلاف وتخزين في درجه حرارة الغرفة.
- TE الحل: مزيج 1 مل من 1 متر تريس-HCl (pH 8.0) و 2 مل من 50 mM أدتا (pH 8.0) وضبط حجم إلى 100 mL مع H2س. الاوتوكلاف ومخزن في درجه حرارة الغرفة.
- العازلة يوديد: تذوب 30 غرام من ناي في 50 مل من TE ، pH 8.0. تخزين الحل في درجه حرارة الغرفة في الظلام.
- أجار الأعلى: تذوب 1 غرام من التريتون ، 0.5 غرام من استخراج الخميرة ، 0.5 غرام من كلوريد الصوديوم ، و 0.7 غرام agarin في 100 مل من H2س. الاوتوكلاف والاستغناء في 15 مل aliquots. يخزن في درجه حرارة الغرفة للاستخدام.
2-الجولة الاولي من القرصنة البيولوجية: فرز المستنسخات التي تربط المجال خارج الخلية من FGFR2
ملاحظه: استخدم نصائح ماصه مقاومه لإيروسول وارتدي قفازات لجميع البروتوكولات من أجل تقليل التلوث مع البكتيريا البيئية.
- اعداد 10 ميكروغرام/مل FGFR2 (النقاء > 97 ٪ ؛ انظر جدول المواد) الحل في العازلة الطلاء. أضف 1 مل من المحلول المعد إلى طبق 35 سم2 ودوامه بشكل متكرر حتى يصبح السطح مبللا تماما. احتضان بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية مع الاهتزاز.
ملاحظه: لتجنب اختيار المجلدات الهدف الفخ ، يجب ان يكون البروتين الهدف تنقيه عاليه. - تطعيم 5 مل من LB + Tet المتوسطة مع القولونية (e. كولاي) ER2738 لمده 5-10 ساعات في 37 درجه مئوية مع الاهتزاز. سيتم استخدام خلايا ER2738 تضخيم للمعايرة في الخطوة 3.3.
- يسكب محلول الطلاء من الطبق (يجب أزاله المحلول الزائد) وأضافه حل الحجب. احتضان في 4 درجه مئوية لمده 1 ساعة علي الأقل.
- تجاهل محلول الحجب واغسل 6 مرات بسرعة مع TBST (TBS + 0.05 ٪ (v/v] توين-20). تجنب تجفيف الطبق.
- أعاده إنشاء مكتبه بالعاثيه الأصلي في 1 مل من tbst [التركيز النهائي من 1011 لوحه تشكيل وحدات (pfu)] ، أضافه إلى طبق المغلفة ، والصخور بلطف لمده 2 ح علي شاكر في درجه حرارة الغرفة.
- تجاهل ماده طافي وغسل الطبق 10x مع tbst (TBS + 0.05 ٪ (v/v) توين-20) ، كما أجريت في الخطوة 2.4.
ملاحظه: يجب أزاله والعاثيات غير منضم تماما عن طريق الغسيل قويه. - Elute في بالعاثيه ملزمه عن طريق أضافه 1 مل من 0.2 م العازلة الواقية من حمض الهيدروكلوريك (pH 2.2) إلى الطبق وهزاز بلطف لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
- نقل الشطف في أنبوب الطارد المجهري تعقيمها وتحييدها مع 100 μl من 1 M تريس-HCl ، pH 9.1.
ملاحظه: في الخطوة 2.6 ، أزاله بالعاثيه غير منضم قدر الإمكان عن طريق غسل الطبق 10x بقوة. وهذه خطوه حاسمه. ويمكن تخزين بالعاثيه التي تم التملص منها في 4 درجه مئوية لمده أسبوع واحد. ومع ذلك ، فمن الأفضل ان نمضي قدما إلى الخطوة التالية في أقرب وقت ممكن.
3. تحديد titer من الوالعاثيات التي لا يمكن التملص منها
- قبل الحارة LB + IPTG/X-غال لوحات علي الأقل 1 ح في 37 درجه مئوية قبل الاستخدام.
- اعداد 100 μl من 10 اضعاف المسلسل المخففات (اي ، 101، 102، 103 و 104) من شطف من الخطوة 2.8 في LB. استخدام نصائح مع خراطيش فلتر لتجنب التلوث.
- السماح للثقافة من الخطوة 2.2 الوصول إلى مرحله منتصف السجل (OD600 ≈ 0.5). الاستغناء عن 200 μL من الثقافة إلى أنابيب الطارد المجهري المعقمة ، واحده لكل تخفيف الشطف.
- للبدء في العدوى ، أضافه 10 μL من كل تخفيف من الخطوة 3.2 إلى أنابيب الطارد المجهري الفردية التي تحتوي علي الثقافة e. كولاي ER2738 من الخطوة 3.3. دوامه بسرعة واحتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 5 دقائق.
- معطف 90 μL من الخليط من الخطوة 3.4 في لوحات LB + IPTG/X-غال مع العصي الطلاء.
- اختياريا ، تذوب اعلي أجار في الميكروويف ، والاستغناء عن 3 مل في أنابيب الثقافة العقيمة ، واحده لكل تخفيف التلاشي ، والحفاظ علي أنابيب في 45 درجه مئوية. نقل الخليط من الخطوة 3.4 إلى أنابيب الثقافة التي تحتوي علي 45 درجه مئوية اعلي أجار. اخلطي المزيج بسرعة وفورا علي صفيحه من الرطل/IPTG/X-غال التي تم تسخينها مسبقا. أماله برفق وتدوير لوحه لنشر أجار اعلي بالتساوي.
- بعد 5 دقائق ، عكس واحتضان لوحات بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
- يحسب لويحات علي لوحات مع تقريبا 100 لويحات. ضرب كل عدد من قبل عامل التخفيف لتلك اللوحة للحصول علي عيار بالعاثيه في pfu لكل 10 μl.
- تطعيم آخر 5 مل من LB + Tet المتوسطة مع e. القولونية ER2738 في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها مع اهتزاز لتضخيم بالعاثيه.
ملاحظه: استخدام ثقافة ER2738 في مرحله السجل المتوسط (OD600 ≈ 0.5) ل بالعاثيه titer. إذا كانت معظم لويحات بيضاء علي لوحات X-غال/iptg ، فهذا يعني ان تجمع بالعاثيه قد لوثت مع الجراثيم البرية. إذا حدث تلوث ، فمن الضروري ان تبدا مره أخرى مع خطوات بالغسل من محلول الأسهم بالعاثيه غير الملوثة.
4. التضخيم phage
- تمييع (1:100) الثقافة بين عشيه وضحيها من الخطوة 3.8 في 20 مل من LB في قارورة 250 mL Erlenmeyer. أضافه التي لم يتم التشبع بها واحتضان مع اهتزاز قوي ل 4.5 h في 37 درجه مئوية.
- نقل الثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي لمده 10 دقيقه في 12,000 x g في 4 ° c. نقل ماده طافي إلى أنبوب جديد ، الطرد المركزي مره أخرى ، وتجاهل بيليه.
- نقل الجزء العلوي 80 ٪ من ماده طافي إلى أنبوب جديد وأضافه إلى ذلك 1/6 حجم 20 ٪ PEG/2.5 M nacl. السماح بالعاثيه ليعجل في 4 °c بين عشيه وضحيها.
ملاحظه: مزيج الثقافة ماده طافي مع PEG/2.5 M nacl جيدا. - الطرد المركزي وعجلت بالعاثيه في 12,000 x g لمده 15 دقيقه في 4 °c. تخلص من الطاردة الفائقة ، والطرد المركزي مره أخرى ، وأزاله سوبرناتانت المتبقية مع ماصه.
- أعاده تعليق بيليه في 1 مل من TBS ونقل ماده طافي إلى أنبوب الطارد المجهري. جهاز الطرد المركزي في 12,000 x g لمده 5 دقائق في 4 °c.
- نقل ماده طافي إلى أنبوب الأنابيب الصغيرة الطازجة ويعجل مره أخرى عن طريق أضافه 1/6 حجم الوتد 20 ٪/2.5 M nacl. احتضان علي الجليد لمده 15-60 دقيقه. أجهزه الطرد المركزي في 12,000 x g لمده 10 دقيقه عند 4 درجه مئوية. تخلص من الديدان الفائقة وقم باعاده الدوران وأزاله البقايا الفائقة التي تحتوي علي ماصه.
- أعاده تعليق بيليه في 200 μL من TBS والطرد المركزي لمده دقيقه اضافيه لأزاله الشوائب. نقل ماده طافي إلى أنبوب الأنابيب المجهرية الطازجة للحصول علي الشطف تضخيمها.
- Titer تضخيم بالعاثيه كما هو موضح في القسم 3.
ملاحظه: التخفيف من الشطف تضخيم اعلي مقارنه مع التملص غير المستهلكة ؛ ويقترح عاده التخفيفات التسلسلية من 108– 1011 .
5-الجولة الثانية من القرصنة البيولوجية
- كرر الأقسام من 2 إلى 4.
- Titer الجولة الثانية من تضخيم التملص علي LB + IPTG/X-غال لوحات كما هو موضح في القسم 3.
ملاحظه: تقليل تركيز الطلاء من البروتين FGFR2 إلى 5 ميكروغرام/مل. استخدام بالعاثيه تضخيم من الخطوة 4.7 كما المدخلات والحفاظ علي عيار نفس كما في الجولة الاولي (1011 pfu). تقصير وقت الحضانة من بالعاثيه وطبق FGFR2-المغلفة إلى 1 ح وزيادة تركيز توين إلى 0.1 ٪ (v/v) في خطوات الغسيل.
6-الجولة الثالثة من القرصنة البيولوجية
- كرر الخطوات 2.1-2.6.
- Elute في بالعاثيه ملزمه عن طريق أضافه 1 مل من 20 ميكرومتر bfgf الحل (يجند ل FGFR2) إلى الطبق وهزاز بلطف ل 60 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
- كرر الخطوات 3.1-3.7.
ملاحظه: تقليل تركيز الطلاء من البروتين FGFR2 إلى 2.5 ميكروغرام/مل. استخدام الجولة الثانية من تضخيم بالعاثيه من الباب 5 كما المدخلات والحفاظ علي عيار نفس كما في الجولة الاولي (1011 pfu). تقصير وقت الحضانة من بالعاثيه و FGFR2 المغلفة طبق إلى 30 دقيقه وزيادة تركيز توين إلى 0.5 ٪ (v/v) في خطوات الغسيل.
7. الحصول علي الحمض النووي البلاك للتسلسل
- التضخيم البلاك
- تمييع (1:100) ثقافة بين عشيه وضحيها من ER2738 في LB. الاستغناء عن 1 مل من الثقافة المخففة في أنبوب 2 مل ، واحده لكل استنساخ لتكون تتميز.
- استخدم طرف ماصه لاختيار لوحه ملونه زرقاء مفصوله جيدا من لوحه عيار من القسم 6 ونقلها إلى الأنبوب الذي يحتوي علي الثقافة المخففة. اختيار ما مجموعه 15 لويحات.
ملاحظه: يجب ان تكون اللوحات < 1 – 3 أيام من العمر ، وتخزينها في 4 درجات مئوية ، و< لويحات 100. - احتضان الأنابيب مع اهتزاز قوي ل 4.5 h في 37 درجه مئوية.
- نقل الثقافات إلى أنابيب الطرد المركزي وأجهزه الطرد المركزي في 12,000 x g ل 30 s. نقل ماده طافي إلى أنبوب جديد والطرد المركزي مره أخرى.
- باستخدام ماصه ، نقل الجزء العلوي 80 ٪ من ماده طافي إلى أنبوب جديد. تسميه هذا باسم الأسهم الضخمة.
ملاحظه: تمييع بالعاثيه تضخيم مع حجم متساو من 100 ٪ الجلسرين معقمه وتخزين في-80 درجه مئوية للاستخدام في وقت لاحق.
- استخراج الحمض النووي اللويحة
- نقل 500 μl من تضخم بالعاثيه إلى أنبوب الأنابيب المجهرية الطازجة وأضافه حجم 1/6 من 20 ٪ PEG/2.5 M nacl. عكس لخلط والسماح لها الوقوف لمده 10-20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي في 12,000 x g لمده 10 دقيقه في 4 °c ومن ثم تصب قباله supernatant.
ملاحظه: قد لا يكون Phage بيليه مرئية. - الطرد المركزي مره أخرى. أزاله اي supernatant المتبقية بعناية.
- أعاده تعليق بيليه جيدا في 100 μL من العازلة يوديد من خلال التنصت بقوة علي الأنبوب.
- أضافه 250 μL من الايثانول 100 ٪ واحتضان لمده 15 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي في 12,000 x g لمده 10 دقيقه في 4 °c وأزاله supernatant. غسل بيليه مع 0.5 mL من 70 ٪ الايثانول ، الطرد المركزي بسرعة مره أخرى ، وأزاله supernatant ، وجافه لفتره وجيزة بيليه.
- أعاده تعليق بيليه في 30 μL من المخزن المؤقت TE واستخدام هذا للتسلسل.
ملاحظه: قبل تبريد الايثانول 70 ٪ في-20 درجه مئوية في وقت مبكر من الخطوة 7.2.6. يجب ان يكون بيليه بالعاثيه بدقه أعاده تعليق في المخزن المؤقت يوديد قبل أضافه الايثانول.
8. تحديد تسلسل الببتيد
- استخدام-96 التمهيدي التسلسل gIII (5 ' cccccccccccg العلامات TTA GCG المقطع – 3 ') للتسلسل.
- تحليل تسلسل الببتيد المعروضة علي بالعاثيه استنادا إلى نتائج تسلسل الحمض النووي.
- توليف الببتيدات الصغيرة وتحليل بواسطة اللوني السائل عاليه الأداء (HPLC) والطيف الكتلي لتاكيد نقاء (≥ 98 ٪).
9. الكشف عن تقارب الببتيد الصغيرة التي تم الحصول عليها والبروتين خارج الخلية من FGFR2 من قبل مركز التجارة الكترونيه
- المياه المعقمة degas باستخدام أداه الموجات فوق الصوتية. حل الببتيد الصغيرة والبروتين خارج الخلية FGFR2 في المياه المعقمة. الطرد المركزي هذه العينات لأزاله الرواسب المتبقية.
- قم باجراء تجارب المعايرة للمركز عند درجه حرارة 25 مئوية. معايره 40 μM من الببتيد الصغيرة في الخلية مع 1.5 μM من البروتين FGFR2 من الحقنه ، مع سرعه التحريك من 750 دوره في الدقيقة. أضافه بروتين FGFR2 في 2 μl قسامات (لما مجموعه 19 الحقن) في فواصل 5 دقائق.
- تحليل بيانات المركز باستخدام نموذج ربط موقع واحد.
ملاحظه: يجب ان تكون المياه المعقمة بالغاز ، ويجب ان تكون جميع العينات طرد لأزاله فقاعات الهواء والشوائب المتبقية. يجب اجراء التجربة بدرجه حرارة ثابته تبلغ 25 درجه مئوية.
10. التحقق من النشاط البيولوجي من الببتيد الصغيرة التي تم الحصول عليها باستخدام فحص انتشار الخلايا
- البذور BALB/c 3T3 الخلايا (3.0 × 103 خلايا/حسنا ، 100 μl) في لوحه 96 بشكل جيد مع النسر المعدلة دولبيكو المتوسطة (dmem) مع 10 ٪ مصل الأبقار الجنينية بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
- استبدال ماده طافي مع dmem الطازجة مع 0.5 ٪ وتجويع الخلايا لمده 12 ساعة.
- جعل التخفيفات التسلسلية من الببتيد الصغيرة (0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20, و 100 μM) مع DMEM الطازجة تستكمل مع 0.5% الهواء (6 مكرره الآبار/التركيز). أزاله ماده طافي من لوحه 96 البئر وأضافه 100 μl من محلول الببتيد الصغيرة في البئر. احتضان ل 48 ح في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
- استبدال ماده طافي مع dmem الطازجة التي تحتوي علي 10 ٪ خليه عد كيت (cck)-8 الحل واحتضان لمده 2 ساعة.
- قياس الامتصاص من كل بئر في 450 nm مع قارئ ميكروبلايت وتحليل قابليه الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الحصول علي عاليه التقارب الببتيد الصغيرة استهداف FGFR2.
لفحص الوالعاثيات التي تستهدف FGFR2 ، استخدمت مكتبه الدكتوراه-7 في هذه الدراسة. ويبين الشكل 1التمثيل التخطيطي لسير العمل. في هذه العملية ، تم الاحتفاظ بعدد المدخلات بالعاثيه (pfu) دون تغيير ، في حين تم تخفيض تركيز الطلاء من بروتين FGFR2 تدريجيا. وأشارت نتائج الدورة إلى ان عدد الزوائد المستردة ازداد تدريجيا ، وبعد ثلاث جولات ، كانت هناك زيادة ب65 بالمقارنة مع الجولة الاولي (الجدول 1).
المقبل ، اخترنا الاستنساخ بالعاثيه عشوائيا بعد الجولة الثالثة واستخراج الحمض النووي بالعاثيه للتسلسل. تم تسميه الببتيد الممثل (WRARVPL) الذي تم الحصول عليه بواسطة الفحص SP1. وقد تم توليفها فيما بعد ، وتم قياس وزنها الجزيئي بمقياس الطيف الكتلي.
وأظهرت الببتيد SP1 تقارب ربط عاليه نحو FGFR2.
وأجريت تجربه للمركز لقياس تقارب الببتيد الصغيرة إلى FGFR2. وأشارت النتيجة إلى ان الببتيد SP1 لديه تقارب عاليه نحو FGFR2 (دينار كويتي ≈ 1.4 μM; الشكل 2). وقد اظهر هذا التاريخ كفاءه بروتوكول الفرز.
الببتيد SP1 تثبيط نمو الخلايا الليفية.
للتحقيق في النشاط البيولوجي الببتيد SP1 ، تم اجراء فحص انتشار الخلايا الليفية باستخدام مجموعه CCK-8. تم احتضان الخلايا BALB/c 3T3 مع الببتيد SP1 في تركيزات مختلفه (0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20, و 100 μM). واقترحت النتيجة ان الببتيد SP1 قمعت نمو الخلايا BALB/c 3T3 (الشكل 3).
الشكل 1 القرصنة البيولوجية لاستهداف الببتيد الصغيرة FGFR2 باستخدام مكتبه عرض بالعاثيه.
(ا) التمثيل التخطيطي للكشف عن الببتيد الصغيرة باستخدام مكتبه عرض بالعاثيه. احتضان المكتبة التي تحتوي علي 1011 pfu في طبق المغلفة مع FGFR2. تخلص من الوالعاثيات غير المنضمة عن طريق الغسل ، والوالعاثيات المنضمة. تضخيم الوالعاثيات التي لا يمكن التملص منها واستخدامها كمدخل للجولة التالية من القرصنة البيولوجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 قياس تقارب التفاعل بين الببتيد SP1 و FGFR2 من قبل مركز التجارة الكترونيه.
1.5 ميكرومتر FGFR2 البروتين تم معايره مع 40 μM من الببتيد SP1. وتم تحليل بيانات المركز باستخدام برنامج Origin 7.0. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 تاثير الببتيد SP1 علي نمو الخلايا الليفية.
وعولجت الخلايا BALB/c 3T3 مع الببتيد SP1 في تركيزات مختلفه (0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20 و 100 μM). يتم التعبير عن النتائج كمتوسط ± SD. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| جوله | FGFR2 (ميكروغرام) | المدخلات بالعاثيه (pfu) | الناتج بالعاثيه (pfu) | الاسترداد (%) | تخصيب |
| 1 | 10 | 2.0 x 1011 | 3.98 x 104 | 1.99 x 10-5 | 1 |
| 2 | 5 | 2.0 x 1011 | 8.1 x 105 | 4.05 x 10-4 | 20 |
| 3 | 2.5 | 2.0 x 1011 | 2.6 x 106 | 1.3 x 10-3 | 65 |
الجدول 1 إثراء البالعاثيه استهداف FGFR2 نسبه إلى الجولة 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعد مكتبه التصوير التوافقي أداه قويه وفعاله للفحص العالي الإنتاجي للببتيدات الجديدة التي يمكنها ربط الجزيئات المستهدفة وتنظيم وظيفتها13. حاليا ، بالعاثيه المكتبات الببتيد العرض لديها مجموعه واسعه من التطبيقات. علي سبيل المثال, يمكن استخدامها لاختيار الببتيدات النشطة بيولوجيا منضم إلى مستقبلات البروتينات23, غير البروتين الأهداف24,25, يحاكي مستضد المرض الخاصة13, الببتيدات الخاصة بالخلايا26, 27، أو الانسجه/الببتيدات الخاصة بالأعضاء21،28،29 وتطوير نظم تسليم الببتيد بوساطة المخدرات19،30. وباختصار ، فان المكتبات الببتيد العرض هي نظم مفيده وفعاله لتحديد الببتيدات محدده في البحوث الاساسيه وتطوير الطب متعديه. في الدراسة ، تم استخدام مكتبه لفحص الببتيدات الصغيرة التي تستهدف FGFR2 لتثبيط نمو الخلايا.
وترد أدناه الخطوات الحاسمة للبروتوكول. في الخطوة بالغسل ، يجب تجنب التلوث بواسطة والعاثيات من النوع البري. يجب أزاله الوالعاثيات غير المنضمة بدقه عن طريق الغسيل القوي. يجب ان تكون لوحات LB + iptg/X-غال ل بالعاثيه عيار قبل الإحماء إلى 37 درجه مئوية. لل بالعاثيه titer, e. القولونية ER2738 يجب ان تزرع حتى منتصف سجل المرحلة (OD600 ≈ 0.5). في الخطوة 4.3 ، يجب ان تكون عجلت بالعاثيه بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية. يجب انتقاء لويحات زرقاء مفصوله جيدا من platea تحتوي علي اقل من 100 لويحات لتسلسل الحمض النووي. في الخطوة 7.2.6 ، يجب ان يكون محلول الايثانول 70 ٪ قبل التبريد في 20 درجه مئوية مقدما. وأخيرا ، بالنسبة لتجربه مركز التجارة الكترونيه ، يجب أزاله المياه المعقمة ، ويجب ان طرد جميع العينات للتخلص من فقاعات الهواء والشوائب المتبقية. يجب اجراء التجربة بدرجه حرارة ثابته تبلغ 25 درجه مئوية.
بعض العوامل التي يمكن ان تؤثر علي نوعيه الزيارات التي تم الحصول عليها22 هي كما يلي: 1) في الجولة الاولي من الفرز ، يجب ان يكون عدد المدخلات بالعاثيه 1011 pfu. ومع ذلك ، في الجولة التالية من الفرز ، يمكن ان تكون المدخلات اقل. 2) يجب الحفاظ علي بيئة نقيه لتجنب التلوث البري من نوع بالعاثيه. 3) 3 أو 4 جولات من الفرز وعاده ما تكون كافيه. تجنب الإفراط في بالغسل مكتبه الببتيد. 4) في كل جولة ، يتم تخفيض كميه البروتين المستهدف تدريجيا ، في حين يتم زيادة محتوي توين تدريجيا في خطوه الغسيل. الاضافه إلى ذلك ، يتم أيضا تقصير وقت الحضانة من بالعاثيه وطبق FGFR2 المغلفة تدريجيا. إذا كان معظم لويحات بالعاثيه التي لا تكون بيضاء علي لوحات X-غال/iptg ، وهذا يوحي التلوث من قبل بالعاثيه من النوع البري. من أجل تجنب انخفاض عيار من تضخم بالعاثيه في عمليه بالغسل ، يجب ان تكون الثقافات الخلوية جيدا والمصابين في وقت مبكر من مرحله النمو (OD600 < 0.05).
في هذه الدراسة, وأظهرت الببتيد SP1 تقارب عاليه نحو FGFR2 (دينار كويتي ≈ 1.4 μM; الشكل 2) والنشاط البيولوجي الجيد (الشكل 3). التالي, نتائجنا تشير إلى ان البروتوكول كان فعالا في اختيار الببتيدات ضد المجال خارج الخلية من البروتين FGFR2, علي الرغم من ان نلاحظ انه نظرا لتشابه تسلسل عاليه من افراد الاسره FGFR, الببتيد SP1 قد يكون لها بعض التقارب ملزمه مع FGFR أسره أعضاء فضلا عن FGFR2, اي استطاع كنت مسؤوله للنشاط احيائيه يري. أيضا ، في عمليه بالغسل ، بالعاثيه ELISA هو بديل لتحديد بالعاثيه ايجابيه نوعيا. ومع ذلك ، في مختبرنا ، ونحن دائما الحصول علي الببتيدات عن طريق التسلسل وتقييم تقاربها من قبل المركز الفحص الكمي ولم يكن لديك مشاكل في تقييم واختيار الببتيدات المرشح.
مكتبه عرض phage لديها العديد من المزايا22. المكتبات ذات قدره عاليه (تصل إلى 1011 pfu) ويمكن استخدامها في المختبر ، في الجسم المجري ، والجسم السابق. المكتبات ذات كفاءه عاليه ، وسهله للتعامل ، وغير مكلفه ومتاحه تجاريا. ومع ذلك ، هناك بعض القيود علي التكنولوجيا. المكتبات تحتوي فقط علي الأحماض الامينيه البروتينية وقابله فقط إلى الببتيدات الخطية والبسيطة دوري دون هياكل معقده.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تنازع في المصالح المالية.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل برنامج العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (رقم 2016201604030039).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
